血小板中Toll樣受體表達與急性冠脈綜合征的關系

毛先軍,左益檠

血小板除了在促進止血和加速凝血方面發揮主要作用外,還能分泌多種黏附分子,在內皮細胞和其他免疫細胞之間的相互作用中起著至關重要的作用[1]。研究表明,血小板通過釋放P-選擇素和CD40L或形成血小板-白細胞聚集體與白細胞相互作用并調節其功能[2]。血小板上Toll樣受體(TLRs)的表達可能在血小板與免疫反應之間發揮重要的作用[3-5]。以往的研究主要集中于血小板TLRs在血小板減少癥、膿毒癥、失血性休克或感染繼發的嚴重血栓性并發癥(如腦卒中或心肌梗死)中的作用[6-8]。然而,據報道,TLRs不僅能感知外源性微生物分子,還能感知宿主來源的分子[9]。動脈粥樣硬化被認為是一種無菌性炎癥相關性疾病,這提示TLRs在動脈粥樣硬化的發生發展中可能發揮一定的作用。本研究旨在探索血小板TLR-2和TLR-4的表達與急性冠脈綜合征(ACS)之間的關系。現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2019年9月—2020年8月我院心內科收治的首次診斷為ACS的病人50例[包括不穩定型心絞痛(UAP)、非ST段抬高型心肌梗死(NSTEMI)、ST段抬高型心肌梗死(STEMI)]作為試驗組,選擇相同時間段年齡、性別匹配且冠狀動脈正常者50例作為對照組。納入標準:①試驗組病人符合《急性冠脈綜合征急診快速診治指南(2019)》[10]中ACS的診斷標準;②試驗組病人自身條件允許行冠狀動脈造影檢查;③所有病人未接受過抗血小板或抗凝藥物治療;④研究對象對此項臨床研究知情并簽署知情同意書。排除標準:①有冠心病病史者;②合并肝腎功能嚴重損害者;③患有惡性腫瘤者;④合并各種血液系統疾病者;⑤患有感染、自身免疫性疾病等全身性炎癥性疾病者;⑥近3個月內有手術史者。本研究經我院醫學倫理委員會審核通過。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 收集研究對象年齡、性別、冠心病常見危險因素(如高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙、冠心病家族史)、體質指數(BMI)、用藥情況[他汀類藥物、β受體阻滯劑、血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)、血管緊張素受體拮抗劑(ARB)等]、實驗室指標[血清肌酐、空腹血糖、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、血紅蛋白、白細胞計數、血小板計數、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌鈣蛋白T]、左室射血分數(LVEF)。

1.2.2 血小板TLR表達水平檢測 采集研究對象外周靜脈血樣本,且采樣前均未接受抗血小板或抗凝藥物治療。采集血樣后15 min內用流式細胞儀檢測血小板TLR的表達水平。用含有檸檬酸鈉的采血管收集全血(5 mL),3 000 r/min離心15 min,收集富含血小板的部分,用含0.1%牛血清白蛋白緩沖液(17.5 mmol/L Na2HPO4,8.9 mmol/L Na2EDTA,154 mmol/L NaCl,pH 6.9,0.1%牛血清白蛋白)洗滌血小板2次;210×g離心5 min,用4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液(132 mmol/L NaCl,6 mmol/L KCl,1 mmol/L MgSO4,1.2 mmol/L KH2PO4,20 mmol/L HEPES,pH 7.4,5 mmol/L葡萄糖)重懸血小板。用流式細胞儀(Beckman Coulter XLMCL,美國)檢測血小板TLR-2和TLR-4的表達。106個血小板與10 μL TLR-2 PE(CD282,cloneT2.5,Biolegend)、10 μL TLR-4 FITC(CD284,HTA125,Biolegend)抗體、同位素對照(MsIgG1 FITC、MsIgG1PE,Biolegend)在4 ℃條件下避光孵育30 min,用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌1次,上機檢測。

2 結 果

2.1 兩組臨床資料比較 試驗組與對照組年齡、性別、BMI比較差異均無統計學意義(P>0.05)。在心血管危險因素中,試驗組高血壓、糖尿病、吸煙、冠心病家族史、高脂血癥比例明顯高于對照組(P<0.05)。試驗組服用他汀類藥物、β受體阻滯劑、ACEI/ARB比例明顯高于對照組(P<0.05)。試驗組白細胞計數、空腹血糖水平明顯高于對照組(P<0.05)。試驗組HDL-C水平明顯低于對照組(P<0.05),而兩組LDL-C、血清肌酐水平、血小板計數差異均無統計學意義(P>0.05)。試驗組LVEF低于對照組(P<0.05)。詳見表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2 兩組血小板TLRs表達情況比較 ACS病人血小板TLR-2和TLR-4表達水平明顯高于冠狀動脈正常者(TLR-2中位數分別為30.4%與4.5%,P<0.001;TLR-4中位數分別為44.4%與5.7%,P<0.001)。詳見圖1。血小板TLR-2、TLR-4的表達水平在UAP、NSTEMI、STEMI 3組病人間差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表2。

圖1 試驗組與對照組血小板TLR-2和TLR-4表達水平比較

表2 ACS各亞型病人血小板TLR-2和TLR-4表達水平比較[M(QR)] 單位:%

2.3 血小板TLR表達與心血管危險因素及服藥情況的關系 有高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙史和冠心病家族史及服用他汀類藥物、β受體阻滯劑、ACEI/ARB的ACS病人,血小板TLR-2和TLR-4的表達水平明顯升高(P<0.05)。詳見表3、表4。

表3 血小板TLR-2表達與心血管危險因素及服藥情況的關系[M(QR)] 單位:%

表4 血小板TLR-4表達與心血管危險因素及服藥情況的關系[M(QR)] 單位:%

2.4 血小板TLRs表達與ACS病人基線特征的相關性 血小板TLR-2表達與空腹血糖、白細胞計數、肌鈣蛋白T峰值呈正相關,與HDL-C、LVEF呈負相關。而血小板TLR-4表達與空腹血糖、白細胞計數、CK-MB峰值、肌鈣蛋白T基線值、肌鈣蛋白T峰值呈正相關,與HDL-C、LVEF呈負相關。詳見表5。

表5 血小板TLR表達與ACS病人基線特征的相關性(r值)

2.5 ACS的影響因素分析 冠心病家族史、服用他汀類藥物、血小板TLR-2和TLR-4的表達與ACS的發生獨立相關(P<0.05)。詳見表6。

表6 ACS預測因素的Logistic回歸分析結果

3 討 論

本研究結果表明,與冠狀動脈正常的病人相比,ACS病人血小板TLR-2和TLR-4的表達明顯增加,并且有高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙史和冠心病家族史、服用他汀類藥物、β受體阻滯劑、ACEI/ARB的病人血小板TLR-2和TLR-4的表達水平較高。此外,血小板TLR-2和TLR-4的表達是ACS的獨立預測因子。

動脈粥樣硬化的特征是血管內皮細胞損傷、單核細胞黏附和遷移、巨噬細胞脂質堆積和泡沫細胞的形成[11-12]。在TLR家族中,特別是TLR-4早已被發現在動脈粥樣硬化性疾病的發生和發展中起著至關重要的作用[13-15]。已有研究報道了ACS病人外周血單核細胞(PBMC)中TLRs在循環系統中連接病理信號與促血栓形成和促炎信號之間的關系[16-17]。ACS病人單核細胞亞群、白細胞、PBMC以及冠狀動脈血栓中CD14標記的單核細胞上TLR-2和TLR-4的表達水平明顯升高[16,18]。除ACS外,穩定型心絞痛病人單核細胞上TLR-4的mRNA和蛋白表達水平也明顯升高,并且其表達水平與冠狀動脈嚴重狹窄的血管數量相關[19]。Kuwahata等[20]認為單核細胞上TLR-2的高表達可能是動脈粥樣硬化形成的獨立危險因素。

研究表明,血小板激活和血小板中TLRs表達增強有很強的相關性[21]。血小板激活后表面TLRs的表達增強[22],活化的血小板細胞膜上TLR-2和TLR-9的表達增加,而TLR-4的表達減少。但在活化的血小板細胞內TLR-2、TLR-4和TLR-9的表達均增加[23]。研究表明,刺激血小板TLR-2可增加P-選擇素的表面表達,激活整合素αIIbβ3,產生活性氧,并在人全血中形成血小板-中性粒細胞異型聚集體[24-25]。然而,除了TLR-2和TLR-4的病原體相關配體外,目前還缺乏關于改變自身配體的研究,這些配體已經被證明能誘導血小板的血栓炎癥反應,并且這種反應可以被血小板TLRs識別并轉化為病理反應[26-27]。

在本研究中,與冠狀動脈正常的病人相比,ACS病人血小板TLR-2和TLR-4的表達水平明顯升高。提示通過改變TLRs的自身配體可能導致血小板活化,這可能是導致ACS病人促血栓形成的主要原因。由于STEMI病人中TLRs的表達明顯升高,推測血小板TLRs在ACS病人中的表達,特別是在STEMI病人中的表達,可能在導致血栓形成的非自限性級聯反應中起至關重要的作用。這與Semeraro等[28]的研究結果是一致的,其研究結果已經證明死亡細胞釋放的細胞外組蛋白通過血小板TLR-2和TLR-4促進凝血酶的產生。然而,本研究沒有發現血小板TLRs的表達在ACS 3種亞型(如UAP、NSTEMI、STEMI)病人中的表達有差異。這可以用相對較小的研究人群來解釋。另一方面,ACS病人血小板TLR-2和TLR-4的表達與肌鈣蛋白T峰值水平相關,表明TLRs的表達還與心肌梗死的嚴重程度密切相關。

有研究表明,用合成的TLR-2/TLR-1激動劑Pam3CSK4孵育分離的血小板,可直接誘導血小板聚集和與膠原黏附[29-30]。這些反應在TLR-2缺陷的小鼠中被抑制,同時在人血小板中可以被TLR-2阻斷抗體預處理所抑制[24,31]。這一研究結果具有重要的臨床意義,提示血小板TLRs可能成為治療ACS的新靶點。目前需要進一步的研究來證明TLRs在ACS發病機制中的確切作用,以及改變TLR-2和TLR-4的配體或TLRs本身可能成為ACS的治療靶點。

本研究存在一些局限性,首先,這是一項觀察性研究。其次,表面TLRs的表達不足以衡量血小板中TLRs的產生,本研究未對細胞內TLRs的表達進行評估,而mRNA的檢測可以提供更準確的信息。

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