糖蛋白Ⅲa的PlA1/A2多態性與心肌梗死易感性關系研究

吳慶湘,史振羽,倪偉智,黃琪容,袁 丁

血小板活化在急性心肌梗死(AMI)的發病中發揮重要作用,血小板活化介導的血栓形成會加重AMI病情,提升病人死亡率[1]。研究發現,血小板活化的早期,其表面發生糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa復合物構型改變,GPⅡb/Ⅲa受體的活化表達能進一步介導血小板聚集與釋放,因此,GPⅡb/Ⅲa被認為是血小板早期活化的標志物[2-3]。GPⅢa基因位于17號染色體長臂上17q21.32,多態性表現為PIA1、PIA2。但目前GPⅡb/Ⅲa受體的PlA1/A2多態性在AMI發病中的作用以及對疾病進展的影響尚存在較大爭議,有報道指出,PlA1/A2多態性主要影響血小板聚集成單核細胞,PlA2等位基因的攜帶與AMI存在顯著相關性[4-5]。但也有學者認為PlA1/A2多態性并非AMI的病理風險因素[6]。本研究擬通過研究健康人群與AMI病人PlA1/A2多態性,分析GPⅢa的PlA1/A2多態性與心肌梗死易感性的關系,現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年9月—2021年9月廣州中醫藥大學第五臨床醫學院收治的70例AMI病人,男41例,女29例;年齡30～76(65.47±9.52)歲。納入標準:①符合《急性ST段抬高型心肌梗死診斷和治療指南(2019)》[7]關于AMI的診斷標準;②通過血清心肌酶譜、心電圖及冠狀動脈造影等檢查確診為AMI;③能夠配合完成各項檢查治療;④臨床資料完整。排除標準:①已接受GPⅡb/Ⅲa受體抑制劑、阿司匹林治療者;②有心臟病史(包括心肌病、風濕性心臟病、主動脈夾層等)和腦梗死病史;③合并免疫系統疾病、血液系統疾病、急慢性感染、惡性腫瘤;④病人存在血緣關系;⑤精神疾病病人。同期選取本院體檢健康志愿者70名作為對照組,男39名,女31名,年齡28～80(66.30±9.45)歲。所有試驗對象對研究內容充分知情且簽署書面同意書,本研究經過醫學倫理委員會審查批準。

1.2 方法

1.2.1 基線資料收集 采集兩組研究對象性別、年齡、體質指數(BMI)、血壓、吸煙史、病史、血脂4項、磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌鈣蛋白I(cTnI)、N末端腦鈉肽前體(NT-proBNP)等資料,其中,血脂4項指標包括總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。

1.2.2 標本采集 采集病人入院時和健康對照者空腹靜脈血5 mL于真空采血管中,乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝,1 h內送實驗室完成檢測。

1.2.3 DNA提取 ①取上述新鮮抗凝全血樣品300 μL于EP管中,加入等量磷酸緩沖鹽溶液(PBS)稀釋,混勻。②在另1個EP管中加入3 mL人外周血單個核細胞分離液(北京索萊寶科技有限公,P9011),使用巴氏德吸管吸取稀釋后的血漿小心地平鋪到分離液液面上方,注意保持兩液面界面清晰。③室溫下離心(3 000 r/min,半徑15 cm)20 min,離心后液體呈明顯分層,吸取血漿層與分離液層間白膜層即為單個核細胞層。④使用移液槍吸取白膜層至15 mL潔凈EP管中,10 mL PBS洗滌,離心(2 000 r/min,半徑10 cm)10 min,棄去上清液,重復3次。⑤使用DNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司)提取出基因組DNA,再行瓊脂糖凝膠電泳,測定DNA濃度。

1.2.4 PlA1/A2基因多態性檢測 使用聚合酶鏈式反應(PCR)-限制性片段長度多態性(RFLP)技術測定PlA1/A2基因多態性,使用軟件Primer 5設計引物5′-TGCTGGACTTCTCTTTGGGC-3′和 5′-TCAGGTC TCTCCCCGCAAAG-3′,引物委托上海生工生物有限公司合成,PCR反應條件:95 ℃預變性5 min,經(94 ℃變性30 s,57 ℃退火40 s,72 ℃延伸30 s)39個循環,72 ℃延伸10 min。

1.2.5 基因多態性分析 取10 μL PCR擴增后產物,加入1 μL限制性內切酶TaqⅠ(美國NEB公司)進行酶切,再對PCR產物進行核苷酸序列測定,測序由上海生工生物有限公司完成,測序結果使用DNAMAN軟件進行分析。

1.3 統計學處理 PlA1/A2的基因型及等位基因頻率等定性資料比較使用χ2檢驗,以確定其是否符合Hardy-Weinberg遺傳定律,年齡、BMI、血脂指標等定量資料比較使用t檢驗或方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組臨床資料比較 AMI組糖尿病史、高血壓史占比明顯高于對照組(P<0.05),且AMI組TG、TC、LDL-C、CK-MB、cTnI及NT-proBNP水平均高于對照組,而HDL-C水平低于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05)。兩組性別、年齡、BMI、吸煙史比較差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2 Hardy-Weinberg平衡吻合度檢測 對照組與AMI組GPⅢa的PlA1/A2位點基因型分布及等位基因頻率均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05),表明PlA1/A2位點基因型分布在本研究的人群中達到了遺傳平衡,具有良好的群體代表性。詳見表2。

表2 GPⅢa基因型Hardy-Weinberg平衡吻合度檢測

2.3 GPⅢa基因的PlA1/A2多態性分析 GPⅢa基因的PlA1/A2多態性基因型為 PlA1/A1、PlA1/A2、PlA2/A2,對照組與AMI組的主要基因型為PlA1/A1、PlA2/A2。兩組基因型分布及等位基因頻率比較差異均有統計學意義(P<0.05),且PlA1、PlA2等位基因突變與AMI發病有關。詳見表3。

表3 對照組與AMI組GPⅢa的基因型及等位基因頻率分布 單位:例(%)

2.4 PlA1/A2多態性與血脂、心肌酶指標及NT-proBNP的關系 AMI組PlA2/A2基因型病人的TG、TC、LDL-C、CK-MB、cTnI及NT-proBNP水平均明顯高于其他基因型病人,而HDL-C水平明顯低于其他基因型病人,差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表4。

表4 AMI組不同GPⅢa PLA1/A2基因型血脂、心肌酶指標及NT-proBNP水平比較(±s)

3 討 論

AMI病情兇險,死亡率高,我國AMI發病率仍呈上升趨勢,極易錯過最佳治療窗口,危及病人生命安全[8]。動脈粥樣硬化易損斑塊破裂后引發的血小板活化、黏附和聚集是心肌梗死重要的病理基礎,在AMI的病情進展及預后中起著關鍵性作用[9]。研究表明,GPⅢa高表達的心血管疾病病人血小板活性顯著增強[3],提示GPⅢa在血小板聚集調控過程中發揮關鍵作用。相關動物實驗也證實,雙聯抗血小板藥物可下調GPⅢa受體表達,減輕AMI引發的缺血和再灌注損傷[10]。而受遺傳變異性的影響,GPⅢa存在PlA1/A2多態性,其中攜帶PlA2基因病人心臟疾病發生風險較未攜帶者增加4倍,尤其男性病人[11]。有研究認為,與PlA1相比,PlA2多態性血小板對GPⅡb/Ⅲa具有更強的激活作用,介導GPⅡb/Ⅲa與纖維蛋白原的結合[12]。說明GPⅢa A2多態性血小板更有助于誘導血栓的形成,導致不良心血管事件發生。但當前關于GPⅢa的PlA1/A2多態性與心肌梗死易感性的相關研究報道鮮見。

本研究檢測了研究對象血GPⅢa的PlA1/A2基因多態性分布情況,結果發現,AMI病人與健康人群均存在PlA1/A1、PlA1/A2、PlA2/A2 3種基因型,基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律,但AMI組PlA2/A2基因型頻率為55.71%,較對照組明顯增加;同時等位基因PlA2的頻率(65.71%)也明顯升高,且PlA1、PlA2等位基因突變與AMI發病有相關性,表明PlA1/A2基因多態性在AMI的發病中起著關鍵性作用,PlA2位點突變可能增加AMI發病風險,與AMI遺傳易感性相關。但目前GPⅢa的PlA1/A2基因多態性對AMI發病影響的機制尚不明確。血小板質膜上GPⅢa以共價鍵與GPⅡb結合形成二聚體復合物GPⅡb/Ⅲa,是血小板膜上纖維蛋白原受體,GPⅡb/Ⅲa活化后與纖維蛋白原結合是各種血小板激動劑介導血小板凝集的最后共同通路。GPⅢa PlA具有多態性,且會對GPⅡb/Ⅲa的結構與功能造成較大影響[13]。Michelson等[14]比較了不同GPⅡb/Ⅲa基因型冠狀動脈綜合征病人血小板激活、GPⅡb/Ⅲa激活和纖維蛋白原結合的閾值,PlA2/A2基因型病人均為最低,PlA1/A2次之,PlA1/A1最高。提示PlA2基因活化程度更高,有更強的血栓形成傾向。有研究發現,雙聯抗血小板治療可挽救缺血心肌和改善心功能,但PlA1/A1的血小板對阿司匹林、氯吡格雷等不敏感,PlA1/A2與PlA2/A2基因型組則敏感性更高[15]。這種對抗血小板藥物不同的敏感性可能具有潛在的臨床意義,提示在AMI臨床治療中可根據PlA基因型精準調整抗血小板治療方案。

本研究還發現,AMI組PlA2/A2基因型病人TG、TC、LDL-C、CK-MB、cTnI及NT-proBNP水平均明顯高于其他基因型病人,而HDL-C水平明顯低于其他基因型病人。提示GPⅢa 的PlA1/A2多態性會影響AMI病人血脂代謝,導致或加重心肌損傷。目前國內外關于GPⅢa的PlA1/A2多態性與血脂異常具體相關機制的報道鮮見,分析PlA2純合基因病人血小板活化閾值低,動脈粥樣硬化斑塊破裂后能迅速介導血小板聚集,造成局部血栓形成,引發心肌損傷;與此同時,GPⅡb/Ⅲa復合體被活化后使血小板超微結構發生病理變化,還可能通過刺激血小板釋放血小板微粒,調控血管平滑肌細胞、成纖維細胞的凋亡,從而參與心肌細胞損害,具體作用機制仍有待進一步研究。

綜上所述,GPⅢa的PlA1/A2多態性與AMI發病有關,PlA2等位基因可能是AMI發病的易感基因。本研究由于納入病例數較少,且未考慮研究對象的種族、地區差異,研究結果可能存在偏倚,仍有必要進行多中心、大樣本研究來進一步探討GPⅢa的PlA1/A2多態性與AMI易感性的確切關系。

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