乙酸鈉對氧糖剝奪皮質神經元損傷的作用及HIF-1α表達的影響

孔祥一 胡文潔 任進陽 姚旭進 高靖辰 萬芪

［摘要］ 目的 探討乙酸鈉（NaAc）對氧糖剝奪（OGD）損傷后皮質神經元的作用及低氧誘導因子-1α（HIF-1α）表達的影響。

方法 將OGD處理的皮質神經元作為腦缺血模型，采用細胞存活實驗（CCK-8）、乳酸脫氫酶（LDH）釋放實驗檢測NaAc處理后的神經元存活情況，Western blot方法檢測OGD損傷后、NaAc處理后神經元中HIF-1α蛋白表達；應用二甲基草酰甘氨酸（DMOG）、HIF-1α抑制劑（LW6）分別激動和抑制HIF-1α，觀察NaAc是否通過抑制HIF-1α發揮神經保護作用。采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色觀察NaAc處理后大鼠腦組織梗死體積。

結果 TTC結果顯示，NaAc處理可以減輕腦梗死體積（F=107.20，P<0.05）。體內細胞存活實驗和LDH釋放實驗顯示，NaAc可以減輕OGD對神經元的損傷（F=98.80、72.62，P<0.05），NaAc通過抑制HIF-1α表達促進神經元存活（F=43.57、97.52，P<0.05）。Western blot結果顯示，NaAc可抑制正常神經元中HIF-1α蛋白的表達（t=7.84，P<0.05），OGD損傷后神經元HIF-1α蛋白表達增加（t=9.96，P<0.05），NaAc可抑制OGD損傷后神經元HIF-1α蛋白表達（F=74.74，P<0.05）。

結論 OGD損傷后，補充NaAc可通過抑制HIF-1α蛋白表達發揮神經保護作用。

［關鍵詞］ 乙酸鈉；腦缺血；再灌注損傷；神經保護；大腦皮質

［中圖分類號］ R743.31;R338.2

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 2096-5532（2023）01-0001-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.011

［網絡出版］ https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20230303.1118.007.html;2023-03-06 10：56：03

EFFECT OF SODIUM ACETATE ON CORTICAL NEURONAL INJURY CAUSED BY OXYGEN-GLUCOSE DEPRIVATION AND ITS INFLUENCE ON THE EXPRESSION OF HYPOXIA-INDUCIBLE FACTOR 1α

（The Institute of Neuroregeneration and Neurorehabilitation， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

; ［ABSTRACT］ ?Objective ?To investigate the effect of sodium acetate （NaAc） on cortical neurons after oxygen-glucose deprivation （OGD） injury and its influence on the expression of hypoxia-inducible factor 1α （HIF-1α）.

Methods ?Cortical neurons treated with OGD were established as a model of cerebral ischemia. CCK-8 assay and lactate dehydrogenase （LDH） release assay were used to measure the viability of neurons treated with NaAc; Western blot was used to measure the protein expression of HIF-1α in neurons after OGD injury and NaAc treatment; HIF-1α was stimulated by dimethyloxalylglycine and inhibited by an HIF-1α inhibitor （LW6） to observe whether NaAc exerts a neuroprotective effect by inhibiting HIF-1α. The 2，3，5-triphenyltetrazolium chloride （TTC） staining was used to observe cerebral infarct volume of the rats treated with NaAc.

Results ?TTC staining showed that NaAc treatment reduced cerebral infarct volume （F=107.20，P<0.05）. In vivo cell survival test and LDH release assay showed that NaAc alleviated neuronal injury caused by OGD （F=98.80，72.62;P<0.05） and promoted the survival of neurons by inhibiting HIF-1α expression （F=43.57， 97.52;P<0.05）. Western blot showed that NaAc inhibited the protein expression of HIF-1α in normal neurons （t=7.84，P<0.05）， and there was a significant increase in the protein expression of HIF-1α in neurons after OGD injury （t=9.96，P<0.05）， while NaAc inhibited the protein expression of HIF-1α in neurons after OGD injury （F=74.74，P<0.05）.

Conclusion ?NaAc supplementation exerts a neuroprotective effect after OGD injury by inhibiting the protein expression of HIF-1α.

［KEY WORDS］ ?sodium acetate；brain ischemia; reperfusion injury; neuroprotection; cerebral cortex

缺血性卒中是由原位血栓或來自另一個動脈或心臟的栓塞的動脈梗阻引起的，是全球第三大死亡原因［1］。考慮到溶栓和手術治療缺血性卒中的效果有限而且預后不佳，需要新的治療方式來改善卒中的預后。低氧誘導因子-1（HIF-1）是由β亞基和α亞基組成的異二聚體。泛素依賴性蛋白酶根據氧氣含量調節α亞基水平［2-3］。研究表明，HIF-1α有一定神經保護作用［4］。乙酸鈉（NaAc）是一種短鏈脂肪酸。已有研究表明，含有醋酸酯的短鏈脂肪酸有抑制炎癥作用［5］。NaAc在缺血性腦卒中動物及細胞模型中作用研究甚少。本研究利用大腦中動脈閉塞（MCAO）模型及氧糖剝奪（OGD）處理的皮質神經元作為腦缺血模型，探究NaAc對腦缺血再灌注損傷后神經元損傷的作用及HIF-1α水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 雄性SD大鼠30只，體質量為250～300 g，購自青島大仁福成牧業有限公司。大鼠分籠飼養，每籠2～3只。飼養條件：光照/黑暗周期為12/12 h，房間溫度23～25 ℃，自由獲取食物和水。實驗前適應喂養3 d。

1.1.2 主要的實驗試劑 NaAc購自上海埃彼化學試劑有限公司；二甲基草酰甘氨酸（DMOG）購自CSNpharm公司；兔來源抗HIF-1α多克隆抗體、抗MAP2多克隆抗體購自CST公司；HIF-1α抑制劑（LW6）、乳酸脫氫酶（LDH）細胞毒性檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；CCK-8試劑盒購自北京Bioss生物技術有限公司；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）購自美國Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原代神經元培養 采用相關文獻的方法［6］，原代培養6批神經元，分別用于Western blot檢測、免疫熒光染色、細胞存活實驗（CCK-8）和乳酸脫氫酶（LDH）釋放實驗。

1.2.2 氧糖剝奪/復氧模型（OGD/R模型）的制備

根據相關文獻方法［7］，采用OGD/R處理神經元，以其作為OGD/R模型。

1.2.3 缺血再灌注損傷模型制備及TTC染色 采用線栓梗死技術制備大鼠缺血再灌注損傷模型 ［8］。將SD大鼠分為Sham組（假手術對照）、MCAO組（制備缺血再灌注損傷模型）、MCAO+NaAc組（制備缺血再灌注損傷模型并腹腔注射NaAc），各6只。觀察各組大鼠腦梗死體積。

1.2.4 Western blot檢測 采用相關文獻方法［8］。將原代培養神經元分為3批，第1批分為Sham組（未做處理）和NaAc組（加入NaAc），觀察NaAc對HIF-1α蛋白水平的影響；第2批分為Sham組（未做處理）和OGD/R 6 h組（給予神經元OGD/R處理），觀察OGD后神經元內HIF-1α蛋白水平的變化；第3批分為Sham組（未做處理）、OGD組（給予神經元OGD處理）、OGD+NaAc組（神經元OGD后加入NaAc），觀察NaAc對OGD后HIF-1α蛋白水平的影響。每組實驗重復6次。

1.2.5 免疫熒光染色 采用相關文獻方法［8］，將原代培養神經元分為Sham組（未做處理）、OGD組（給予神經元OGD處理）和OGD+NaAc組（神經元OGD后加入NaAc），觀察NaAc對OGD后神經元存活的影響。

1.2.6 CCK-8比色法以及LDH釋放實驗 采用相關文獻的方法［8］，將神經元分為2批，第1批分為Control組（未做處理）、Control+NaAc組（加入NaAc）、OGD組（給予神經元OGD處理）、OGD+NaAc組（神經元OGD后加入NaAc），觀察NaAc對OGD后神經元存活的影響；第2批分為Control組（未做處理）、OGD組（給予神經元OGD處理）、OGD+NaAc組（神經元OGD之后加入NaAc處理）、OGD+NaAc+DMOG組（神經元OGD后加入NaAc和DMOG）、OGD+NaAc+LW6組（神經元OGD后加入NaAc和LW6），觀察HIF-1α表達對NaAc調節的損傷神經元存活的影響。每組實驗均重復6次。

1.3 統計學分析

應用Graph Pad Prism 8.0軟件進行統計學分析。計量資料以±s表示，兩組比較采用兩獨立樣本比較t檢驗；多組均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結? 果

2.1 NaAc對缺血損傷后大鼠腦梗死體積的影響

TTC染色結果示，Sham組、MCAO組、MCAO+NaAc組大鼠腦梗死體積分別為0、32.89±5.05、19.36±3.57，各組比較差異有顯著性（F=107.20，P<0.05），MCAO+NaAc組腦梗死體積明顯小于MCAO組（t=5.988，P<0.05）。見圖1。

2.2 NaAc對OGD損傷后神經元的影響

CCK-8比色檢測顯示，各組神經元存活率差異有顯著性（F=98.80，P<0.05）。與Control組相比，OGD組細胞存活率降低（t=14.29，P<0.05）；與OGD組相比，OGD+NaAc組細胞存活率增加（t=5.94，P<0.05）。LDH釋放實驗顯示，各組LDH釋放率差異具有統計學意義（F=72.62，P<0.05）。與Control組相比，OGD組LDH釋放率明顯升高（t=11.35，P<0.05）；與OGD組相比較，OGD+NaAc組LDH釋放率降低（t=2.75，P<0.05）。見表1。

2.3 NaAc對正常神經元HIF-1α蛋白表達的影響

NaAc組的HIF-1α蛋白表達水平較Sham組明顯下降（t=7.84，P<0.05）。見圖2。

2.4 缺血再灌注損傷后神經元HIF-1α蛋白表達

Western blot檢測結果表明，與Sham組相比較，OGD/R 6 h 組HIF-1α蛋白表達明顯上升（t=9.96，P<0.05）。見圖3。

2.5 NaAc對OGD損傷神經元HIF-1α表達影響

Western blot檢測結果顯示，與Sham組相比較，OGD組HIF-1α蛋白表達水平明顯升高（F=74.74，t=11.62，P<0.05）；與OGD組相比，OGD+NaAc組HIF-1α蛋白表達水平明顯降低（t=9.11，P<0.05）。見圖4。

2.6 HIF-1α蛋白表達對NaAc調節的神經元存活的影響

CCK-8比色及LDH釋放實驗顯示，與OGD+NaAc組相比較，OGD+NaAc+DMOG組細胞存活率降低（F=43.57，t=10.12，P<0.05），LDH釋放率增高（F=97.52，t=3.28，P<0.05）；而OGD+NaAc+LW6組的細胞存活率升高（t=4.49，P<0.05），LDH釋放率降低（t=3.37，P<0.05）。見表2。

3 討? 論

缺血性腦卒中可直接造成大腦不可逆的細胞損傷，或在半暗帶引起一系列病理生理過程，引起細胞死亡，導致損傷后梗死體積增加［10］。

短鏈脂肪酸是厭氧細菌發酵的主要代謝產物，被認為是微生物群與宿主組織之間的紐帶［11］。胃腸道和血液中脂肪酸濃度的改變可能會誘發或預防病理性疾病，如癌癥、糖尿病等。NaAc是由不可消化的食物殘渣和腸道內內源性上皮源性黏液厭氧發酵產生的。腸腔中釋放的短鏈脂肪酸很容易被結腸細胞吸收并用作能量來源。正常情況下，人血清中的乙酸鹽水平較低［12］，而在低氧或葡萄糖缺乏狀態下，乙酸鹽可能成為乙酰輔酶A重要來源。乙酸鹽是一種新的、有效的膠質瘤治療途徑［13］。已有研究表明，補充乙酸鹽可增強小鼠抵抗應激的能力［14］；NaAc通過促進p53的升高，可抑制腫瘤細胞的存活［15］。本文動物實驗結果顯示，NaAc可以減小大鼠腦梗死體積；細胞模型研究顯示，OGD損傷后加入NaAc可減輕神經元損傷。因此，NaAc可能是缺血性腦卒中新的潛在治療靶點。

HIF-1由HIF-1α和HIF-1β亞單位組成。每個亞單位都包含基本的bHLH-PAS結構域，該結構域介導異源二聚和DNA結合［16］。HIF-1α的轉錄活性確定了HIF-1α在細胞功能中具有重要的作用［17］。代謝調節是HIF-1α的主要和原始功能。在低氧條件下，HIF-1α可通過調節PDK1、LDHA、BNIP3和BNIP3L介導氧化代謝到糖酵解代謝的轉變。PDK1編碼丙酮酸脫氫酶（PDH）激酶1，其磷酸化可使PDH失活，從而抑制丙酮酸轉化為乙酰輔酶A進入三羧酸循環［18］。本文研究結果顯示，OGD損傷后神經元HIF-1α蛋白表達增加，NaAc通過抑制HIF-1α蛋白的表達促進神經元存活。因此，在缺血再灌注早期，抑制HIF-1α對缺血再灌注損傷具有保護作用。

已有研究結果顯示，NaAc可自由穿過血-腦脊液屏障和細胞膜，并且可以增加蛋白的乙酰化［13］。NaAc能通過促進p53的表達，抑制HIF-1α的轉錄，進而降低HIF-1α的表達；而增多的HIF-1α可以抑制血管生成，調節糖代謝、線粒體功能、細胞存活等相關基因的表達。另有研究表明，HIF-1α升高加重對缺血性卒中的損傷，抑制HIF-1α表達可以減輕炎癥反應，抑制M1微噬細胞、iNOS和COX2的促炎活性；此外，HIF-1α還與PKM2相關基因相互作用，促進糖酵解［19］。補充NaAc可能通過促進p53的表達，發揮神經保護作用［20-21］。NaAc還有很多其他作用，如抑制炎癥，促進細胞自主代謝調節，從而在細胞發生缺血再灌注損傷時發揮重要保護作用［22］。本研究通過構建大鼠MCAO及原代神經元培養OGD模型，探討NaAc對缺血再灌注損傷的作用及其機制。結果顯示，缺血再灌注損傷后，大腦內神經元中HIF-1α蛋白表達上調，補充NaAc可抑制HIF-1α的表達，促進神經元的存活；應用HIF-1α激動劑和抑制劑研究顯示，NaAc可通過抑制HIF-1α蛋白表達發揮神經保護作用。因此，NaAc可能是通過抑制HIF-1α表達進而抑制炎癥反應，對大腦缺血再灌注損傷產生保護作用。

綜上所述，NaAc通過抑制HIF-1α蛋白的表達，在腦缺血再灌注損傷中發揮神經保護作用。

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（本文編輯 黃建鄉）