一種快速有效鑒定煙草苗期青枯病抗性的水培接種法

張海玲　許玉紅　馬麗聰　夏巖石　李榮華　黃依琳　周子苑　肖建旺　袁清華　趙偉才　郭培國

摘要：為探尋一種快速有效的煙草青枯病苗期抗性鑒定方法，以紅花大金元、青梗、長脖黃和 D101等4個煙草品種為材料，在水培條件下采用傷根和不傷根法進行青枯菌侵染接種，依據病情指數進行抗病性鑒定。結果顯示，水培條件下采用傷根和不傷根接種法，接種后7～10 d 便可判斷出各品種的抗性，結果為 D101中抗、長脖黃高感、紅花大金元高感或感病、青梗感病，與傳統盆栽傷根灌菌接種法的評價結果基本一致，而盆栽傷根灌菌接種法則需3～4周。本研究建立的水培接種法可快速、高效準確鑒定和評價煙草苗期青枯病抗性。

關鍵詞：煙草青枯??；水培；抗病性；鑒定

中圖分類號： S435.72?????????? 文獻標識碼： A?????????? 文章編號：1007-5119（2023）01-0071-06

A Hydroponic Inoculation Method for Rapid and Efficient Evaluation of Tobacco Resistance to Bacterial Wilt Disease at Seedling Stage

ZHANG Hailing1， XU Yuhong1， MA Licong1， XIA Yanshi1， LI Ronghua1， HUANG Yilin1，ZHOU Ziyuan1， XIAO Jianwang1， YUAN Qinghua2， ZHAO Weicai3， GUO Peiguo1*

（1. School of Life Sciences， Guangzhou University， Guangzhou 510006， China;2. Crop Research Institute， Guangdong Academy ofAgricultural Sciences， Guangzhou 510640， China;3. Guangdong Research Institute of Tobacco Sciences， Shaoguan， Guangdong512400， China）

Abstract： In order to develop a rapid and effective method for resistance evaluation of tobacco bacterial wilt disease （BWD） at seedling stages， four tobacco varieties including Honghuadajinyuan， Qinggeng， Changbohuang and D101 were selected as materials in this study， and their BWD resistance or susceptibility were evaluated based on the disease index after inoculation of Ralstonia solanacearum? with? root-undamaged? and? root-damaged? methods? in? a? hydroponic? system. The? results? showed? that? the? BWD resistance/susceptibility for cultivars could be identified at the 7 or 10 days after inoculation by both root-damaged and undamaged inoculation methods， respectively. D101 was middle resistant， Changbohuang was highly susceptible， Honghuadajinyuan was highly susceptible or susceptible， and Qinggeng was? susceptible. These results were basically consistent with the resistance evaluation obtained by a traditional root-damaged inoculation method in pot culture experiment， which needed 3 to 4 weeks. These results indicated that the hydroponic inoculation method established in this study was a rapid， efficient and accurate method for evaluation of tobacco BWD resistance/susceptibility at seedling stages.

Keywords： tobacco bacterial wilt disease; hydroponics; disease resistance; evaluation

煙草青枯病是由青枯菌（ Ralstonia? solanacearum）引起的一種土傳性細菌病害，該病害的隱秘性、爆發性和傳播性極強，一旦爆發，將降低煙葉的產量和品質，給煙草生產帶來不可估量的損失[1]。目前國內外主要采用農業、生物和化學等方法防控青枯病，但防控效果欠佳[2]，而選育抗病品種是防治青枯病發生的最為經濟有效的途徑[3]。

準確有效地鑒定煙草材料的抗病性對選育抗病品種至關重要。目前，煙草青枯病的抗性鑒定主要分為田間鑒定和苗期鑒定[4]。田間鑒定能較好地評價煙草材料的青枯病抗性，但易受到生態、氣候、區域分布和其他病害干擾等因素的影響，且存在工作量大、耗時長和操作繁瑣等不足[5-6]。苗期鑒定常采用傳統的盆栽試驗進行青枯菌接種[7]，但抗病性評價周期較長，一般需1個月左右[8]。目前我國普遍采用煙草漂浮育苗，劉勇等[9]建立了塑料大棚內漂浮育苗水培接種法，該方法雖能有效避免土培煙苗再移植盆栽等復雜繁瑣的操作，但存在漂浮池面積較大青枯菌難以均勻分布等問題；范江等[10]采用塑料大棚內漂浮育苗水培接種法對47個煙草品種進行青枯病抗性鑒定，發現鑒定結果受季節影響，且易受其他病害干擾。

據此，本研究在前人[9-10]研究的基礎上，參考番茄[11]、茄子[12]和馬鈴薯[13]等植物開展的青枯病抗性鑒定方法，應用水培技術，采用傷根和不傷根法在煙草苗期進行青枯菌接種，以期建立一種適用于溫室和人工氣候箱的小型、易移動且快速有效的煙苗青枯病抗性鑒定評價體系。

1材料與方法

1.1供試材料

供試煙草品種為 D101、青梗、紅花大金元和長脖黃，由廣東省煙草科學研究所提供。其中，D101為青枯病抗病性較強的品種，青梗、紅花大金元和長脖黃為易感青枯病的煙草品種[14-15]。

1.2供試培養基

參照譚茜等[16]采用的適宜青枯菌生長的細菌瓊脂葡萄糖（BG）培養基，配方如下：酵母提取物1.0 g/L、酪蛋白氨基酸1.0 g/L、細菌蛋白胨10 g/L、瓊脂15 g/L、葡萄糖5 g/L 。加入1%的2， 3， 5-三苯基氯化四氮唑（TTC）溶液使其終濃度為0.005%，即為 TTC 選擇性平板。

1.3病原菌的分離與鑒定

2021年7月，收集廣東省南雄市古市鎮溪口村呈典型青枯病癥狀的煙株，稱取約1 g 病健交界處的維管束組織，置于30 mL 的滅菌水中浸泡20min，蘸取浸出液在 TTC 平板上劃線分離，于30 C的恒溫培養箱中培養48 h。

參考已報道的鑒定青枯病病原菌的3個特異性 PCR 引物：759F/760R 、fliC-F/R 和 pehA#3/6[17-19]（表1），進行青枯菌的 PCR 鑒定。25?L 的 PCR 反應體系包含 ddH2O 9.5?L ，2×Taq? PCR? Master Mix （諾唯贊生物科技股份有限公司）12.5?L，青枯菌菌液模板1?L，每對引物（10?mol/L）分別為1?L。PCR 擴增程序為：95 C預變性5 min ，擴增30個循環[95 C變性30 s ，59 C （fliC-F/R 和pehA#3/6）或60 C （759F/760R）退火1 min，72 C 延伸2 min]，最后72 C延伸10 min。

1.4水培體系的構建

1.4.1水培設備所使用的水培設施主要包括：水培箱（長×寬×高41 cm×24 cm×14 cm ）、定植籃（長×寬×高1.7 cm×3.4 cm×3.5 cm ）、氣泵（SY-Q01）和曝氣石等。

1.4.2水培煙苗煙草種子消毒后，在26 C人工氣候箱催苗培養，待煙苗長至十字葉期移入定植籃，并置于含有 Hoagland 營養液的水培箱中；每一個水培箱內放置一個爆氣石進行增氧型水培，每7天更換1次營養液。

1.4.3水培接種將保藏的菌種在 TTC 平板上復蘇，挑取青枯菌的單菌落在 LB 溶液中擴繁48 h，在4800 r/min 下離心20 min 收集菌體；用滅菌水調配好的 Hoagland 營養液懸浮菌體，濃度約為1×108 cfu/mL[20]，每一個水培箱中注入7 L 的菌懸液。

不傷根試驗處理，將4～6葉期煙苗根部置于盛有1×108 cfu/mL 的青枯病菌懸液的水培箱中，水培接種兩周左右；傷根試驗處理，用無菌剪刀在4～6葉期煙苗主根的根尖處剪掉1 cm，再置于上述水培箱中水培接種兩周左右。

傷根和不傷根接種試驗，每個品種均選用12株煙苗，重復3次。水培箱置在溫度30 C、濕度80%、光周期16 h/d 的人工氣候箱中。

1.5盆栽接種

采用傷根灌菌法[21]對煙苗傷根，每株接種菌液10 mL，以無菌水為空白對照，每個品種均選用10株煙苗，重復3次。設置人工氣候箱溫度為30 C、80%濕度、光周期16 h/d。

1.6病情調查與抗性評價標準

參照標準 GB/T 23222—2008《煙草病蟲害分級及調查方法》進行病情調查，采用 Excel 2010和 SPSS 26.0整理數據和統計分析。參照 GB/T 23224—2008《煙草品種抗病性鑒定》進行抗病性評價，在感病對照品種長脖黃的病情指數達到80以上時[10]，依據各品種病情指數調查結果，按評定標準值判斷其抗病性強弱（表2）。

2結果

2.1供試煙草青枯病菌的分離篩選

蘸取1?L 的病株浸出液，在 TTC 平板上劃線分離，待長出形態不一的單菌落（圖1A），挑取疑似青枯菌形態的單菌落繼續分離。經純化后，供試菌株的單菌落為不規則圓形，中央為粉色，邊緣為乳白色，且具有較強的流動性（圖1B ）。

2.2煙草青枯病病菌的 PCR 鑒定

采用已報道鑒定青枯菌的3對引物組合（759F/760R 、flic-F/R 、pehA#3/6）對初步篩選出的菌株進行 PCR 鑒定（圖2），結果發現這3對引物均能在待測的菌株中擴增出特異性條帶，大小分別約為281、400和504 bp，與前人[17-19]報道的青枯菌特征擴增片段的大小一致，故判定從煙草感病材料中分離篩選出的菌株為青枯病病菌。

2.3煙草青枯病病原菌的致病性

對水培煙苗（4～6葉期）接種分離出的青枯菌，接種后的第3天，煙株有1片葉開始出現半邊萎蔫（圖3A）；隨著病情的加重，煙株一側的葉片萎蔫，呈典型的“半邊瘋”癥狀[22]（圖3B）；發病后期，整株葉片全部凋萎且莖部出現明顯的黑色條斑（圖3C ）；而未接種青枯菌的對照則正常生長（圖3D ）；選取病株莖部流溢的乳白色懸浮液（即菌膿）為模板，以青枯菌種的特異性引物組合759F/760R 進行 PCR 擴增，可檢測到281 bp 的特征條帶（圖3E ），而對照則無此條帶。這些結果表明，分離出的病原菌可侵染煙苗，且具較強的致病力，導致煙苗出現典型的青枯病癥狀。

2.4水培傷根法接種青枯菌鑒定煙草品種的青枯病抗性

供試的4個煙草品種水培煙苗剪除根尖1 cm 后，接種青枯病病原菌。在接種后的第3天，長脖黃、紅花大金元和青梗3個品種，已有部分煙株出現半邊葉片萎蔫的發病癥狀但仍為綠色；而 D101葉片只有零星病癥，且癥狀較輕（表3）。接種后第5天，4個煙草品種的感病表型較為明顯，其中長脖黃、紅花大金元和青梗的葉片均萎蔫下垂，病指明顯上升，但 D101的發病相對較緩。在接種后的第7天，4個品種的發病率均大幅度增加，伴隨有葉片黃化，部分煙株莖稈上出現黑色條斑，甚至蔓延至煙株頂部繼而枯死；長脖黃、紅花大金元和青梗3個品種與D101的病情指數差異顯著，其抗性等級評價分別屬于高感、高感、感病和中抗。說明水培傷根法僅需7 d 便可鑒定供試煙草品種的青枯病抗性。

2.5水培不傷根法接種青枯菌鑒定煙草品種的青枯病抗性

由表4可知，4個煙草品種的病情指數在接種后的前3天無顯著差異。接種后第5天，長脖黃、紅花大金元和青梗的病癥逐漸加重，病情指數增加較快，D101的下部葉片亦開始出現輕度萎蔫癥狀。接種后第7天，感病對照長脖黃的病情指數大幅度上升，紅花大金元和青梗次之， D101的病情指數最低。接種后第10天，紅花大金元和長脖黃的葉片明顯黃化與枯萎，青梗病癥加重亦有枯萎現象，而 D101的葉片只出現輕微發病癥狀；依病情指數，長脖黃、紅花大金元、青梗和 D101的抗性等級分別屬于高感、感病、感病和中抗。說明水培不傷根法只需10 d 就可鑒定供試煙草品種的青枯病抗性。

2.6盆栽傷根法接種青枯菌鑒定煙草品種的青枯病抗性

為檢測水培法接種青枯菌鑒定煙苗青枯病抗病性的可應用性，采用傳統的土壤盆栽傷根灌菌法進行比較試驗。由表5可知，在接種后的前10天，4個煙草品種的病情指數呈緩慢上升的趨勢。在接種后的第15天，青梗和紅花大金元的病情指數急劇上升，有明顯萎蔫與黃化的葉片，長脖黃的病情指數次之，而 D101病指上升較緩慢。當接種時間延長至第21天，長脖黃、紅花大金元和青梗的病指明顯上升，有較多葉片枯萎，莖稈上的黑色條斑蔓延至葉柄和煙株頂部，尤其青梗病情表現最重，多數葉片干枯壞死，有的煙株自下而上枯萎至死亡。以青梗為感病對照，依據病情指數，4個煙草品種的抗性等級分別是青梗為高感、紅花大金元和長脖黃為感病， D101為抗病。此外，當接種時間至第30天，以長脖黃為感病對照，依據病情指數，紅花大金元、青梗與長脖黃的抗性級別均為高感，而 D101仍屬于抗病等級。說明盆栽傷根灌菌法需3～4周才可鑒定供試煙草品種的青枯病抗性。

3討論

植物青枯病抗病性是植物與青枯菌在一定環境條件下相互作用的結果，而在不同環境條件下進行青枯病抗病性鑒定試驗，抗病性評價效果不盡相同[23]。目前常見青枯菌的接種方法有葉片注射法[24]、傷根灌菌法[25]、灌根法[26]等。在自然環境條件下，青枯菌一般可從新生的側根和根尖處或植株傷口處入侵[27]，因而，多數研究常采用傷根灌菌法和灌根法。其中，傷根灌菌法常用于煙草[28]等植物的青枯病抗病性鑒定，且效果相對穩定。

本研究采用煙草水培傷根法和不傷根法接種青枯菌，均可導致葉片枯萎、黃化且莖部一側出現黑色條斑，甚至蔓延到葉柄等部位。以上癥狀作為本研究煙苗感染青枯病的典型特征，與番茄[29]在水培條件下接種青枯菌所表現的青枯病癥狀相同，亦與本研究的煙草盆栽傷根灌菌法所觀察到煙株發病表型一致。針對4個煙草品種采用的水培傷根法、水培不傷根法及盆栽傷根灌菌法，接種青枯菌鑒定青枯病抗性的結果基本一致，D101均具有較強的青枯病抗性，其余3個品種的青枯病抗性基本上均表現為易感青枯病。這些結果表明該煙草水培接種體系是一種鑒定煙草青枯病抗性行之有效的方法。

在選用4個煙草品種煙苗水培接種青枯菌的試驗中，發現傷根接種法導致青枯菌侵染煙苗的速度稍快于不傷根法；在接種后第7天，感病對照品種長脖黃病情指數超過80，達到高感水平；而不傷根接種法煙草青枯病的發病速度則相對較緩，接種后第10天長脖黃的病情指數值才達到80以上，說明傷根接種法有利于加快青枯病病原菌的入侵與定殖，這與 WANG 等[30]研究的馬鈴薯水培接種青枯菌鑒定品種抗性所得的結果一致；而采用盆栽傷根灌菌法接種煙苗，易感對照品種長脖黃在接種后4周，病指才達到80以上，表明該接種方法煙苗青枯病的發病速度遠遠低于水培傷根和不傷根的接種方法。

水培法接種青枯菌所需水培設施簡便，鑒定試驗可在溫室或人工氣候箱里完成，不受季節影響，一年可開展多次，方法易于操作[31-33]；與土壤盆栽或田間的青枯病抗性鑒定方法相比，青枯菌在水培條件下能均勻地接觸到根系，減少了試驗誤差及避免田間土傳病害的干擾，提高了抗病性鑒定的準確性和重復性[32-33]；同時，水培法接種青枯菌，青枯病發病迅速，抗性鑒定需時短而快速[33]。因此，本研究建立的煙苗水培傷根或不傷根法接種青枯菌鑒定煙草材料抗病性的體系，是一種簡捷、準確有效和快速的體系。

4結論

本研究建立了一種鑒定煙草苗期青枯病抗性的水培接種法，利用該方法鑒定評價了4個煙草品種的青枯病抗性，在接種后7～10d 就可判斷出各品種的抗性，與傳統盆栽傷根灌菌接種法需要3～4周才能獲得的鑒定結果基本一致，表明所建立的水培接種法是一種快速和準確有效鑒定煙草材料青枯病抗性的方法。

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