分析動物源性食品中抗生素殘留的快速檢測方法

吳曉曉 俞進 熱孜萬古力·賽麥提 賈毅飛

當前，國內畜牧業養殖中存在亂用和濫用抗生素的現象，這將直接引致動物源性食品中的抗生素水平超出標準，威脅我國民眾的身體健康。可見，有效分析抗生素殘留類別，應用科學的前處理技術方案，使用有效且快速的抗生素殘留量檢測方式，能在根本上確保食品安全。本文全面分析動物源性食品中抗生素殘留的快速檢測方法，旨在為相關人員的研究工作提供參考。

抗生素是放線菌、真菌、細菌等諸多微生物生長時產生的有著抗病原體活性的次級代謝產物。抗生素有助于家畜禽免受疾病危害，增速動物生長。但在畜牧養殖過程中使用抗生素也是一柄“雙刃劍”。抗生素的使用一直被業界重點關注。目前存在抗生素被過度使用而導致動物體內抗生素積累過多的問題。另外，大多數養殖業主體并不能嚴格執行藥物的休藥期。人們長時間攝入含高抗生素含量的動物源性制品，可能引起機體中耐藥菌株的生成和增多，機體菌群平衡被打破，個別人還會出現變態反應，威脅生命安全。可見，探討高效而準確的動物源性制品的抗生素殘留檢測方法尤其重要。筆者簡要分析了動物源性食品中抗生素殘留的快速檢測方法，以饗讀者。

1.抗生素發展歷程以及在畜禽養殖業中的應用

1.1抗生素的發展歷程

1929年，英國人F lemming在研究葡萄球菌時發現培養基上的一種產青黃霉能抑制周圍的葡萄球菌生長。他進一步研究發現了青霉菌分泌的一種抗菌物質，并將其命名為青霉素（Penicillin）。此后，許多研究者努力將青霉素純化并確定化學結構，肯定了它的醫學價值。20世紀40年代，青霉素被投入工業化生產。1943年，Waksman從土壤中分離出鏈霉素（Streptomyces），它對頑固性結核桿菌具有明顯的抑制作用。1947年從放線菌屬委內瑞拉鏈霉菌中分離出氯霉素，它是廣譜抗生素，抑制革蘭氏陰性細菌比陽性細菌效力強。1948年，研究者從金色鏈霉菌發酵液中分離出金霉素，隨后的幾年又相繼發現了土霉素家族的其他成員。1952年，研究者又從紅鏈霉菌中獲得一種堿性抗生素——紅霉素。20世紀50年代，科學家又合成了6-氨基青霉烷酸（6-A-AP），并以此結構為母核，合成了一系列的可口服且耐β-內酰胺酶的青霉素衍生品，如甲氧西林、奈福西林、氯唑西林等，開啟了半合成青霉素新時代。20世紀70年代中期，德國默克公司在篩選作用于細菌細胞壁生物合成抑制劑的過程中，從卡特利鏈霉菌（Streptomyces cattlelya）發酵液中分離得到了第一個碳青霉烯類化合物硫霉素。由于抗生素具有良好的化學治療作用，隨著醫學和獸醫學的發展，不斷有新的抗生素被發現和合成。

1.2抗生素在畜禽養殖業中的應用情況

從當前的情況來看，抗生素主要被用于治療動物疾病。合理應用抗生素能夠促進動物生長。在禽畜養殖過程中，抗生素的應用比較常見，也非常必要。即便在歐美發達國家，該國不管其養殖管理技術怎樣先進，都需要應用抗生素針對發病禽畜進行治療，比如合理應用抗生素治療豬呼吸道感染、禽流感、奶牛乳腺炎等等。治療上述疾病的藥品包含慶大霉素、鏈霉素、青霉素類藥物等等。

現階段，抗生素仍舊為防治動物性疾病的重要方法。如果動物在生病之后沒有得到及時有效的治療，不但該動物會死亡，還有可能引發病菌在動物群之間傳染。這些病菌還會在周圍環境中存活，威脅人類健康。此外，不容忽視的是少部分抗菌藥物。比如，黃霉素、桿菌肽等等，應用亞劑量治療發病動物具有提高飼料轉化率、促進動物生長的效果。國內外養殖業迄今為止仍舊將其視為抗菌促長劑來應用。在中國、澳大利亞、加拿大、美國等國家的養殖業發展中，抗生素藥物起著舉足輕重的作用。

目前，我國批準被作為獸藥使用的抗生素絕大部分屬于治療藥物。我國嚴格控制抗生素作為飼料添加劑應用。截至現階段，相關部門僅批準了桿菌肽、聯桿菌素、土霉素等抗生素可被視為治療藥物添加使用。與此同時，規定了諸多動物品種藥物的最高用量和最低用量、生理階段、應用方法，以及用藥過程中的注意事項與停藥期。上述藥物于歐美發達國家被允許在飼料內作為添加劑使用。

2.國內外動物源性食品內抗生素殘留情況分析

從我國動物性食品獸藥殘留現狀來看，主要有以下幾點問題。

第一，濫用飼料添加劑以及獸藥。禁用藥物包含β-激動劑、鹽酸克倫特羅、雌激素、安眠酮等等。這些藥物容易在蛋類、肉類以及奶制品中殘留。藥物殘留重度超標的藥物包含土霉素、紅霉素、孔雀石綠、氯霉素等等。

第二，消費者對動物性食品的防范意識不強。現階段，正規市場上所售賣的動物類制品大部分在牲畜被屠宰前后檢疫，是持有合格證明的放心肉。但值得注意的是，在此背景下仍舊有不法之徒為了牟利，通過各類途徑將私自宰殺的肉制品售賣給消費者。且值得說明的是，大部分消費者防范意識不強，很難鑒別這些肉品。

第三，相關部門對動物食品獸藥殘留監管不力。某些地區的畜牧獸醫站建設落后，投入資金較少，導致防疫站隊伍專業水平參差不齊。相關人員的經費難以被保證，站內設施比較落后，無法完成上級指定的防疫檢疫任務。

第四，獸醫檢疫工作者專業知識儲備量不充足。從當前情況來看，在鄉鎮畜牧獸醫站所工作的人員學歷偏低，技能水平較低，有些工作者職業操守與責任心不強。這種情況很容易導致他們對動物食品藥物殘留檢疫工作有所疏忽，發生誤檢、漏檢的不良情況。

第五，部分地區獸藥殘留檢驗手段落后。比如，前幾年出現的“瘦肉精”中毒事件就證明了部分地區的檢驗水平較低。相關調查顯示，部分地區針對市面上豬肉流通領域的管理依舊沿用20世紀50到60年代的獸醫衛生檢疫規則。在彼時，國內主要針對豬只的傳染病疫病進行防控，未能將飼料添加物殘留視為強檢范圍。

從當前國際獸藥殘留監控發展趨勢來看，主要問題有以下幾點。

其一，獸藥使用劑量愈加增多。近幾年，國際上禁止應用的獸藥，尤其是動物飼料內所添加的藥物品類越來越多。早在2000年，國際食品法典委員會就已經確定了多達185類農獸藥評價與3724個農獸藥殘留限量標準。在1975年，美國就開始落實國家藥物殘留計劃。該國要求相關人員在屠宰動物之前，必須檢查重金屬、殺蟲劑、抗生素以及激素殘留。在2002年，日本進一步加大針對本國食品內農獸藥殘留以及食品添加劑安全管理力度，加強農獸藥毒性測試以及針對食品添加劑的安全評估。

其二，國際上對動物源性食品內獸藥殘留要求愈加嚴格。近幾年來，發達國家針對農獸藥殘留限量要求日趨嚴格。以氯霉素為例，國際殘留限量標準要求明顯提高。該藥物已經從原有的10ug/kg提高至0.1ug/kg，足足提高了100倍。

其三，獸藥殘留檢測水平變得越來越高。由于當前市面上被批準的獸藥在動物源性產品內獸藥殘留限量變得越來越小，常常需要開展超微量、微量以及痕量、超痕量分析。其中涉及的獸藥品類比較多，化學結構也是千差萬別。待測組分相當復雜。有時還需要測定樣本中降解物、有毒代謝物、中間產物以及轉化物等等。此類情況對獸藥殘留檢測水平提出了嚴苛的要求，但也推進了獸藥殘留檢測技術的發展。

其四，當前國際被允許添加的售藥品類變得越來越少。為了避免農畜產品內獸藥殘留危害民眾身體健康，從而達到保護生態平衡與環境安全的目的，相關國際組織以及發達國家當前正減少被允許使用的獸藥品類。在這種情況下，被允許應用的獸藥品類數量變得越來越少。例如，早在1994年，聯合國糧農組織就決定禁止應用氯霉素。

3.動物源性食品內抗生素殘留前處理技術分析

3.1基質輔助固相分散萃取技術

這種技術的原理是將涂有C18等聚合物單體固相萃取材料與樣品一起研磨處理，獲取半干狀態混合物質，隨后把這些填料裝柱處理，應用各類溶劑對柱子進行淋洗處理，直至待測物洗脫。此方式為一類便捷且高效的前處理方式。應用這一方法完成前處理工作，不但有機溶劑、樣本的使用量相當少，而且也有著相當快的萃取速度。現如今，基質輔助固相分散萃取技術已經被全面應用到藥品、食品和飼料的殘留分析之中。

3.2液-液萃取法

動物源性食品抗生素檢測的核心為樣本前處理，該項工作質量直接影響了技術指標。液-液萃取法主要依照具體分析物于各類溶劑內的分配系數詳情，經凈化及富集、萃取、勻漿等等步驟實現分離樣本的根本目標。當前，常見用于實現液-液萃取的溶劑為二氯丙烷以及乙酸乙酯。這種前處理手段對于實驗的要求較低，但操作時間長。

3.3固相萃取法

固相萃取法指的是使用固體吸附劑將液體樣本中的目標化合物吸附，在對相同的基質進行分離處理之后，應用分離、加熱解吸附的方法取得處理目標。應用頻率較高的固相萃取主要包含硅膠以及氧化鋁，不需要使用大量的溶劑，并且在處理過程中也不會乳化，應用這一方式能全面提升樣本前處理效率，達到節省實驗成本的目的。

4.動物源性食品內抗生素殘留處理方式

4.1理化檢測方式

該法主要指的是應用抗生素分子內特有基團的反應或者性質測定具體含量水平。常見的理化測定方式包含超臨界流體色譜法（SFC）、毛細管電泳法（CE）、薄層色譜法（TLC）、氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）等等。

4.1.1高效液相色譜法

高效液相色譜法（HPLC）主要指的是將液體視為流動相，通過高壓運送待測樣品流經色譜柱，結合樣本內的各類成分分配系數差別實現分離，在此之后通過檢測設備檢測其含量水平。HPLC特征為操作自動化、應用范疇廣泛、操作簡便、檢測限度低、靈敏性高，其也為當前檢測抗生素殘留的最常用方式。在高效液相色譜法之中，發展最快的方法為反向高效液相色譜，這種方法應用范圍比較廣。有學者創建了通過高效液相色譜法同時測定包含牛肉之內的六類磺胺藥物殘留。結果表明，這種方法除了精密度以及精準性達到檢測要求以外，剩余的幾種磺胺類藥品能夠在10min之內顯示出高峰。該法的應用在極大程度上體現出快速檢驗的根本要求。

4.1.2毛細管電泳法

毛細管電泳法主要指的是把已經裝入緩沖液毛細管柱插進相同水平的共計2個緩沖液槽之內。當其受到高壓直流電場作用之后，含有電子的溶質會朝著和其極性完全不同的電極方向實現移動。經過該項機制可實現物質分離電泳分析方式。有學者創建了高效毛細管電泳法測定雞肝臟內喹諾酮和磺胺類藥物殘留情況，結果發現：當電泳條件為25℃、電壓22Kv、紫外線檢測波長262nm時，可以在10min內全部分離兩類磺胺藥物和三類喹諾酮藥物。值得說明的是，雖然說毛細管電泳法擁有取樣量低、檢測速率快、效率高等等優勢，但該法的靈敏性不強。工作人員在應用毛細管電泳法開展檢測的過程中需要針對樣本實施進一步處理，只有這樣才能夠有效檢出抗生素殘留。

4.1.3薄層色譜法

薄層色譜法（TLC）主要指的是將需要分離的物質放于薄板的下部，在此之后將其放在有溶劑的層析缸之內。當受到毛細作用之后，被分離的組分會隨著展開劑以各種速度向上方移動。受到吸附力作用影響之后，各類組分會有選擇性地保留于原點與展開劑前沿間固定相上，最后移除層析板晾干處理。被分離的組分與顯色劑反應顯示出斑點。雖然說薄層色譜法成本低廉、操作簡單，但這種方式的分離能力及靈敏度比較低，且該法很難進行定量測定，因此，此類方式于當前階段的抗生素殘留檢測中應用頻率比較低。

4.2生物檢測法

4.2.1微生物檢測法

微生物檢測法主要指的是將通過某些微生物代謝或者經由微生物生成的抑菌圈與抗生素濃度間關系，用于指示樣本內存在藥物殘留。該方法為現階段公認的用以測定抗生素殘留的有效方式，也是測定抗生素殘留應用較早的方法之一。微生物檢測法的應用范疇相當廣泛。截至目前，其仍舊被經常用于針對大批量產品抗生素初篩。常見的微生物法包含酶比色法、紙片法、FAST法、STOP法等等。有學者發明了一類應用地衣芽孢桿菌的孢子用以測定牛乳內喹諾酮藥物殘留量微生物檢測法。這一方式針對喹諾酮類藥品的敏感度高，適合開展低成本分析大量樣本。且該法開發起來比較容易，適合于實驗室內應用。微生物檢測法的優勢為具有廣譜性、操作簡單、成本低廉。但微生物法準確度以及靈敏度差強人意，無法實現精準定量，這種方式檢測限比較高。由此能夠看出，這一方式更適合用于測定濃度比較高的微生物殘留檢測。

4.2.2免疫分析法

當前，學術界將免疫分析法分為兩大類別：其一，將受體配體識別視為中心內容的受體吸附分析法；其二，以抗原抗體識別為中心內容的酶聯免疫吸附法。常見的免疫分析法包含免疫傳感器法、酶聯免疫吸附法、酶免分析法、熒光免疫分析法、放射免疫分析法。在此之中，又以酶聯免疫分析法應用范圍最廣，其主要通過酶標記抗體實現抗原抗體反應，并在此之后經酶和底物生成顏色反應，用以實現定量測定。有學者應用r-biopharm公司所出品的試劑盒并加以改進，用以測定蜂蜜、牛乳、肉類樣本中四環素殘留情況。這一方式全面滿足了國內外四環素殘留初篩檢測各項要求，而且具有相對迅速的特點。和微生物法相比，該法的特異性更高，檢測成本低，設備投資少，可以同時開展大樣本檢驗。但不容忽視的是，這一方法在進行時，有可能出現交叉反應。因此，該法更多地在基層實驗室中應用。

4.2.3蛋白芯片技術

蛋白芯片技術主要指的是利用經過固定相表面緊密排列蛋白質探針，用以獲取標本內的分子，在此之后使用激光掃描系統或者CCT相機取得相關信息并應用計算機實現定性定量分析的方式。蛋白芯片技術也被稱之為蛋白質微陣列。有學者使用了可視化蛋白芯片分析法實現高靈敏、迅速檢測牛奶之內喹諾酮類與磺胺類殘留的根本目的。蛋白芯片技術為一類于基因芯片技術之后發展起來的高通量蛋白功能分析方案，其優點在于高通量、微型化、操作簡便、檢測誤差低、成本低廉。上述特點決定了該法適合被用在高通量抗生素殘留檢測之中。

4.2.4生物傳感器法

生物傳感器法涉及化學、生物等諸多學科。生物傳感器法主要指的是經過抗體或者固定化適體和目標分析物間免疫識別或者化學作用，同時將其轉變為電信號，用以測定抗生素殘留的檢測方式。這一方案更多地被用在牛乳、羊乳之中的抗生素殘留檢測。生物傳感法有響應時間短、靈敏性強、操作簡單、成本低廉的優勢。但這一方案穩定度差、選擇性不強，且也存在需要微型化與智能化等問題。

4.3聯合檢測方案

為了達到滿足各類檢測需求的目的，當代分析檢測中出現了各式各樣的聯用技術。比如，在質譜及色譜聯用技術之內，應用色譜用以分離組分，質譜為檢測器測定相關含量。之所以應用該法，主要因為其除具備高靈敏性、高特異性特征之外，還能夠減少定量限以及檢測限，方便實施微量檢測。常見的聯用技術包含氣相色譜-質譜法（CG-MS）、薄層色譜-質譜法（TLC-MS）、毛細管電泳-質譜法（CE-MS）、液相色譜-質譜法（LC-MS）、液相色譜-核磁共振法（LC-NMR）。有學者應用了RC-MS/MS、LC-MS以及LC-UV的方式測定雞肉樣本帶各類喹諾酮化合物鑒定與分離。另有學者創建了一類可靠性強、靈敏度高的迅速檢測方式，其具體使用了超高效液相色譜－雜交四極軌道用以測定肉類及牛乳之中的20余類抗生素殘留。該方法實現了首次應用高靈敏度及高選擇性四級軌道分析乳類、肉類抗生素技術。國外學者發明了高度集成微流控芯片和多功能耦合質譜（MS）。此法除具備無需分離及高特異性外，還可以直接于掃描模式下進行操作，同時進一步應用串聯質譜分析鑒定目標。該學者深入探討了牛乳樣本內七類喹諾酮類化合物，能夠同時實現樣本的提取、磁分離、免疫親和富集、在線洗脫等系列性操作，這種方式方便、快捷。

結語

因為動物源性食品的成分相對復雜、品類多，所以殘留在內部的抗生素品類也非常多，這為動物源性食品抗生素殘留檢測提出了一定要求。現階段，應用的監測技術難以在相同時間滿足檢出限度低、操作簡便、強靈敏度、高特異性及廣譜性等需求，這也是相關學者在日后開展的研究工作中需要解決的難題。以當前應用范圍最廣泛的色譜法-質譜法為例，研究人員仍舊需要在這種技術基礎之上，開發出更新的色譜柱填料方案，用以獲取滿意度更高的分離成效。研發出混合性離子源可以擴大離子化合物的在范疇，并就此發展出直接性電離技術，不需要實現色譜分離，直接性實現離子化處理之后開展質譜分析的方式。從當前情況來看，高分辨質譜為常規化確認、篩選動物源性食品內抗生素殘留極具前景的檢驗方式。該法充分利用數據庫實現高效篩選及自動化搜索功能，精準迅速獲取相關檢測結果，就此將抗生素殘留分析的效率及質量提到新的層次。

抗生素是一柄“雙刃劍”。抗生素的問世除了為人和動物健康帶來福祉外，也會對人類健康造成威脅。雖說當前檢測抗生素殘留的方式多種多樣，但相關技術存在的弊端也是不容忽視的。基于此，在日后相關技術發展中，學者們一定要選擇更為完善的殘留物檢測方式。另外，國內的檢測機構必須制定并完善相關法律法規及條款。消費者要重視食品安全問題。相關養殖人員要依照標準規范，科學使用抗生素。這對積極維護人類健康以及食品安全具有重大意義。

作者簡介：

吳曉曉（1982.04-），漢族，新疆阿克蘇人，碩士研究生，中級獸醫師；研究方向：畜產品安全檢測。