基于 g-C3N4-Et3N 體系的雙電位比率 MIP-ECL 傳感器檢測多巴胺

顧雄文　王彥　楊敏麗

摘要：石墨相氮化碳納米薄片（g-C3N4NSs ）是一種優良的電化學發光（ECL ）材料，在三乙胺（ Et3N ）為共反應劑時，陽極和陰極都能產生 ECL 信號，而多巴胺（DA ）對其陽極信號產生猝滅作用，但不影響陰極信號.利用這一特點，結合分子印跡聚合物（MIP ）技術，構建了一種檢測 DA 的雙電位比率MIP-ECL 傳感器.首先將摻雜有多壁碳納米管（MWCNTs ）的 g-C3N4NSs 固定在玻碳電極（GCE ）上，然后以 DA 作為模板分子，鄰苯二胺（O-PD ）作為功能化單體，通過電化學聚合法引入 MIP 膜，洗脫模板分子后的傳感器對 DA 具有特異性識別能力，利用 DA 對傳感器陰陽極信號不同的影響作用，實現了對 DA 的高選擇靈敏檢測.傳感器對 DA 的線性響應范圍為1.0×10-10～3.0×10-7 mol ·L-1，檢出限（LOD ）為0.063 nmol ·L-1（信噪比 S/N 為3），與非比率法相比，比率法的重現性得到了明顯提高.

關鍵詞：雙電位比率法；電化學發光（ECL ）；石墨相氮化碳納米薄片（g-C3N4NSs ）；分子印跡聚合物（MIP ）；多巴胺（DA ）

中圖分類號：O 657.1?? 文獻標志碼：A?? 文章編號：1000-5137（2023）01-0030-08

A dual-potential ratiometric MIP-ECL sensor for detection of dopamine based on g-C3N4-Et3N system

GU? Xiongwen1，WANG? Yan2，YANG? Minli1*

（1.College of Chemistry and Materials Science，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China；

2.Linzhou City Linqi Second Junior Middle School，Linzhou 456550，Henan，China）

Abstract：Graphite phase carbon nitride nanosheets（g-C3N4NSs ） are an excellent electrochemiluminescence（ECL ） material，which can produce ECL signals in both the anode and cathode when triethylamine（Et3N ） is used as a co-reaction reagent. It is interesting that the presence of dopamine （ DA ） quenches the anode signal ，but has no effect on the cathode signal. This phenomenon inspired us to build a dual-potential ratiometric ECL biosensor combined with molecularly imprinted polymer（ MIP ） for the detection of DA. The nanocomposites of g-C3N4NSs and multi-walled carbon nanotubes（ MWCNTs ） were immobilized on the? surface? of? glassy? carbon? electrode （ GCE ） and? then? a? molecularly? imprinted? film? was? introduced? by? electrochemical polymerization of O-phenylenediamine（ O-PD ） in the presence of DA. The cavities formed after eluting DA were used for specific recognization of DA. The sensitive and selective detection of DA was realized by taking advantage of the different effects of DA on? the anode and cathode signals of the sensor. The sensor has a linear response to the DA concentration in a range from 1.0×10-10 to 3.0×10-7 mol ·L-1 with a low detection limit（ LOD ） of 0.063 nmol ·L-1（signal to noise ratio S/N=3）. The reproducibility and accuracy of this ratio method are greatly improved，compared with the non-ratio method.

Key words：dual-potential ratiometric detection；electrochemiluminescence（ECL）；carbon nitride nanosheets（g-C3N4NSs ）；molecular imprinted polymer（MIP ）；dopamine（DA ）

0 引言

多巴胺（DA ）是一種由大腦分泌的兒茶酚胺類神經遞質物質[1]，用來幫助細胞傳送脈沖的化學物質.若 DA 水平偏低，則會引發一些神經疾病，如精神分裂癥、亨廷頓病和帕金森病[2]，DA 水平偏高會導致精神興奮和血壓升高.因此，DA 含量的檢測對于這些疾病的診斷、監測、預防和治療具有非常重要的意義.目前，檢測 DA 的方法包括熒光法（FL ）[3]、化學發光法[4]、電化學發光法（ECL ）[5]、差分脈沖伏安法（ DPV ）[6]、循環伏安法（CV ）[7]等.然而，它們大多存在一些缺陷，如成本高、耗時長、預處理繁瑣、易受儀器和環境干擾等.

雙電位比率 ECL 法是利用發光物質在不同電位下，發光信號的比值與待測物質含量之間的關系來進行定量分析的一種方法[8-9].相比于傳統的單信號檢測技術，比率檢測技術能夠矯正因電極、儀器和環境變化帶來的影響，從而提高檢測結果的準確度.

分子印跡聚合技術是以目標分子作為模板，通過聚合反應，合成分子印跡聚合物（MIP ）[10-12].除去膜板分子后留下形狀、大小與目標分子互補的三維空腔結構，這些三維空腔可以高選擇性地結合目標分子，從而實現對目標分析物的高選擇性檢測[13-14].將比率 ECL 發光與高選擇性的 MIP 相結合，不僅可以改善靈敏度和選擇性，還可以避免環境干擾，提高檢測準確度.

石墨相氮化碳納米薄片（g-C3N4NSs ）具有優良的 ECL 性能，在陰陽兩極都能產生 ECL 信號，而 DA 可以極大猝滅其陽極信號，而陰極信號不變.依據這個原理，結合 MIP 技術，構建了一種 MIP-ECL 傳感器，實現了對 DA 的高靈敏、高選擇的準確檢測.實驗中，在 g-C3N4NSs 材料中加入多壁碳納米管（ MWCNTs ），將其混合后固定在電極上，再引入 MIP. MWCNTs 的加入提高了 g-C3N4NSs 的發光強度和穩定性，MIP 對 DA 的特異性識別排除了其他共存物質的干擾，改善了選擇性，比率法檢測矯正了儀器和環境變化帶來的影響，提高了檢測結果的準確度.值得注意的是，這種雙電位比率法只需要一個 ECL 物質，相比于那些由兩個發光物質構成的體系，這個單一物質的體系更簡單，干擾更少.

1 實驗部分

1.1 實驗試劑

三聚氰胺（C3H6N6）、三乙胺（Et3N ）、DA、鄰苯二胺（O-PD ）均購于上海 Aladdin 公司；磷酸二氫鉀（ KH2PO4）、磷酸氫二鉀（K2HPO4）、無水乙醇、鹽酸（HCl）均購于國藥集團化學試劑有限公司；MWCNTs 購于河南濮陽永新科技有限公司；氯化鉀（KCl）購于上海潤捷股份有限公司.所有藥品均是分析純級，溶液以去離子水配制.

1.2 實驗儀器

ECL 分析系統，西安瑞邁分析儀器責任有限公司，MPI-A/B；電化學工作站，上海辰華儀器有限公司，660E；數字化 pH 計，上海洛奇特電子設備有限公司，PHS-25；馬弗爐，上海慧泰儀器制造有限公司， PRD-C3000；數控超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司，KQ-100DE；恒溫干燥箱，上海躍進醫療器械廠，GZX-DH-X；離心機，上海安亭科學儀器廠，TGL-16C；恒溫磁力攪拌器，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司，95-I；透射電子顯微鏡（TEM ），日本電子公司，JEOL 2100；X 射線光電子能譜（XPS ），美國PE 公司，ULVCA-PHI；恒溫干燥箱，上海躍進醫療器械廠，GZX-DH-X.

三電極工作系統：以玻碳電極（GCE ）為工作電極，銀/氯化銀（Ag/AgCl）電極（飽和KCl溶液）為參比電極，鉑（Pt ）絲為對電極.

1.3? g-C3N4NSs 的合成

g-C3N4NSs 是先合成體相氮化碳（g-C3N4），再經過酸化剝離而得到[15].具體方法為：1）稱7.5 g C3H6N6固體放入坩堝，馬弗爐600℃灼燒3 h，取出后自然降溫，得到淡黃色 g-C3N4固體，研磨，備用；2）取2.0 g 合成好的 g-C3N4固體粉末，加入100 mL 濃 HCl，攪拌6 h，用蒸餾水抽濾洗滌至 pH=7.0，收集產物，烘箱60℃干燥4 h；3）取50 mg 產物，加50 mL 超純水，超聲2 h，5000 r ·min-1離心6 min，去除未剝離的塊狀 g-C3N4，取上層白色溶液，烘干即得 g-C3N4NSs，使用時，分散為質量濃度為1.0 mg·mL-1的溶液.

1.4? g-C3N4NSs/MWCNTs 復合物的制備

1）制備羧基化的 MWCNTs：取1.25 g MWCNTs 與12 mL 混酸（即98% H2SO4（質量分數）和65% HNO3（質量分數）以體積比為3∶1的比例混合）混合，60℃攪拌3 h，自然冷卻至室溫，用超純水洗滌至 pH=7，50℃真空干燥12 h，得羧基化的 MWCNTs；2）取一定量羧基化 MWCNTs，在超純水中分散，得到0.1 mg ·mL-1羧基化 MWCNTs；3）將上述制備的1.0 mg ·mL-1的 g-C3N4 NSs 分散液與0.1 mg ·mL-1羧基化 MWCNTs 按照10∶1（體積比）比例充分混合，超聲30 min，得到 g-C3N4NSs 與 MWCNTs 的復合物，記為 g-C3N4NSs/MWCNTs.

1.5? MIP-ECL 傳感器的構建

如圖1所示，將 GCE 用粒徑為0.5μm 三氧化二鋁（Al2O3）粉末打磨 GCE 至光滑，再用無水乙醇與去離子水（體積比為1∶1）洗滌電極，超聲5 min，自然晾干.取6.0μL g-C3N4NSs/MWCNTs 混合液滴涂于 GCE 表面，自然晾干，即得 g-C3N4/MWCNTs/GCE.把 g-C3N4/MWCNTs/GCE 電極置于含有2 mmol ·L-1 DA 和6 mmol·L-1 o-PD 的0.1 mol ·L-1磷酸鹽緩沖溶液（PBS ）溶液中（pH=7.0），在0～0.8 V 電壓范圍內循環掃描15圈，在電極表面引入 MIP.然后，將電極浸入95%乙醇（質量分數）與水的混合溶液中（體積比為4∶1），靜置15 min，除去模板分子 DA，得到能特異性識別 DA 的 MIP-ECL 傳感器，用相同的方法制備了非分子印跡傳感器（NIP-ECL ），用于對比實驗.

1.6? ECL 檢測

用 ECL 分析儀，采用三電極系統，修飾電極作為工作電極，Pt 絲電極為對電極（輔助電極），Ag/AgCl 電極為參比電極.將該電極系統插入0.1 mol ·L-1 PBS （pH=7.0，含有30 mmol·L-1 Et3N ）溶液中，在-1.2～+1.5 V 電壓范圍內，以100 mV·s-1的掃描速率進行循環掃描，記錄 ECL 信號（光電倍增管為-600 V）.檢測 DA 時，先將 MIP-ECL 傳感器插入不同濃度的 DA 溶液中，孵育10 min 后取出，用去離子水清洗干凈，再插入檢測底液，根據陽極與陰極 ECL 信號的比值（I/I0）對 DA 進行定量檢測.

2 結果與討論

2.1? g-C3N4NSs-Et3N 體系的雙電位 ECL 表征

在上述 ECL 檢測條件下，測試了 g-C3N4NSs-Et3N 體系的 ECL 信號，如圖2所示.該體系在陽極（+1.48 V ）和陰極（-1.20 V）產生了2個 ECL 信號，因此可以用來構建比率型傳感器.

2.2 傳感器的表征

分別采用電化學阻抗（EIS ）、循環伏安（CV ）以及 ECL 方法對不同修飾電極，包括 GCE，C3N4/ GCE，C3N4/MWCNTs/GCE，MIP/C3N4/MWCNTs/GCE 及洗脫 DA 和重新孵育 DA 后的電極進行了表征.

圖3（a）為不同電極在1 mmol ·L-1鐵氰化鉀溶液（[ Fe （ CN ）6]3-/4-，含0.1 mol ·L-1 KCL ）的 EIS 譜圖（圖3（b）為圖3（a）部分圖的放大圖），與裸電極

圖2 g-C3N4NSs-Et3N 體系的雙電位 ECL 信號圖

GCE （黑線1）相比，C3N4/GCE （紅色2）的電阻值（Rct ）有所增大，主要是因為 g-C3N4具有半導體性質，阻礙部分電子轉移，表明 g-C3N4薄膜已成功固定到電極表面.當 MWCNTs 修飾到電極表面（藍線3）時，Rct變小，主要是因為 MWCNTs 優良的導電性能，加速了電子轉移.隨著 MIP 的引入（橙線4），Rct急劇增加，表明非導電的 MIP 膜成功引入電極表面.當 DA 洗脫后（粉線5），電子轉移通道被打開，Rct變小.重新孵育 DA 后（綠線6），Rct再次增加，這是因為電子傳遞通道再次被堵塞.

圖3（c）為不同修飾電極在同樣條件下的 CV 曲線圖.可以看出，其結果與 EIS 結果相吻合.

圖3（d）是不同修飾電極的 ECL 信號.與裸 GCE 相比，C3N4/GCE （黑線1）表現出很強的 ECL 響應，表明 g-C3N4具有較高的 ECL 活性.引入 MWCNTs（藍線2）后，ECL 信號進一步增強.然而，引入 MIP（粉線3）膜后，ECL 信號顯著降低，這由2個因素引起：一個是 DA 對 g-C3N4的 ECL 的猝滅效應；另一個是 MIP 膜對電子轉移的阻礙作用.當目標分子從電極上洗脫后（紅線4），ECL 信號再次增加.由于同樣的原因，孵育 DA 后（綠線5） ECL 信號再次降低.

以上結果證明，傳感器的構建是成功的，而且對 DA 具有良好的響應，可用于 DA 的選擇性檢測.

2.3 實驗條件優化

ECL 信號受諸多因素影響，包括 PBS 緩沖溶液的 pH 值、共反應劑 Et3N 的濃度以及目標分子 DA 的洗脫時間和孵育時間，分別對以上因素進行了考察，結果如圖4所示.

圖4（a）為 PBS 的 pH 值在6.0～9.0范圍內對 ECL 信號的影響.當 pH 從6.0增加到7.0時，ECL 信號逐漸增大，在 pH=7.0時，達到最大，之后隨著 pH 值的進一步增加，ECL 強度減小.因此，本實驗選擇 pH 值為7.0.

圖4 不同檢測條件對 ECL 影響.（a）檢測底液的 pH 值；（b）共反應劑 Et3N 的物質的量濃度；（c） DA 的洗脫時間；（d） DA 重新孵育時間第1期顧雄文，王彥，楊敏麗：基于g-C3N4-Et3N 體系的雙電位比率MIP-ECL 傳感器檢測多巴胺35

圖4（b）表示了共反應劑 Et3N 的物質的量濃度對 g-C3N4NSs/Et3N 體系陽極與陰極ECL 信號比值的影響.隨著 Et3N 物質的量濃度的增加，陽極與陰極 ECL 信號比值迅速增加，當 Et3N 物質的量濃度超過30 mmol ·L-1后，陽極與陰極 ECL 信號比值并沒有明顯的變化.這是因為剛開始時，由于發光物質 g-C3N4NSs 含量過多，需要大量共反應劑 Et3N 才能產生更強的 ECL 信號，當 Et3N 增加到一定量時，由于 g-C3N4NSs 是定量的，過量的共反應劑不會導致 ECL 信號的增加.本實驗選擇共反應劑 Et3N 的物質的量濃度為30 mmol ·L-1.

圖4（c）是 DA 洗脫時間的優化.將電化學聚合后的 MIP/C3N4/MWCNTs/GCE 電極浸泡在乙醇和水（體積比為4∶1）的混合溶液中，進行洗脫.記錄不同洗脫時間對應的 ECL 信號.結果表明，當洗脫時間從3 min 增加到15 min 時，ECL 信號不斷增加，15 min 后信號基本保持不變，說明 MIP 膜內的 DA 已達平衡狀態，此時信號達到最大值.因此，模板分子 DA 最佳洗脫時間為15 min.

圖4（d）是 DA 孵育時間的優化.將除去模板分子后的電極浸泡在2μmol·L-1的 DA 溶液中進行孵育，記錄不同孵育時間對應的 ECL 信號.由圖4（d）可知，ECL 信號隨著孵育時間的延長而降低，在10 min 后降到最低且保持不變，說明10 min 后孵育達到平衡.因此，選擇10 min 作為最佳孵育時間.

2.4 傳感器對 DA 的 ECL 響應

在上述優化條件下，測試了 DA 對所制備的 MIP-ECL 傳感器的 ECL 響應，結果如圖5（a）所示.隨著 DA 物質的量濃度的增大，體系的陰極 ECL 強度沒有發生明顯的變化，而陽極 ECL 強度逐漸降低.因此，可將陰極信號作為參比值（I0），陽極信號作為變化值（I），通過 I/I0對 DA 進行定量.

由圖5（b）可知，I/I0與 DA 物質的量濃度的對數值在0.1～300 nmol·L-1的范圍內呈良好的線性關系.線性回歸方程為 I/I0=-0.8937 lg C-4.4841，其中 C 為 DA 的物質的量濃度（mol·L-1）.檢出限（LOD ）為0.063 nmol·L-1（信噪比 S/N 為3），相關系數 R2=0.9976.與其他檢測 DA 的方法相比，本實驗的方法具有較低的 LOD 和較寬的線性范圍，如表1所示.

圖5 傳感器對 DA 的 ECL 響應.（a）比率傳感器對不同物質的量濃度的 DA 的 ECL 響應；（b）比率傳感器的 ECL 比值與 DA 物質的量濃度的對數關系

2.5 傳感器選擇性、穩定性和重現性的考察

為考察傳感器的穩定性，在-1.2～+1.5 V 連續循環電位掃描10個周期，如圖6（a）所示，傳感器陰陽兩極的 ECL 強度并沒有發生明顯的變化，表明傳感器具有良好的穩定性.將制備的 MIP-ECL 傳感器放入4℃冰箱保存，每隔一周測試 ECL 信號，儲存6周后，傳感器的 ECL 強度保持了原來97%左右的強度，表明所構建的傳感器存儲穩定性良好，如圖6（b）所示.相同條件下，平行制備了6個傳感器，同樣條件下測試它們的 ECL 信號，相對標準偏差（RSD ）為1.9%，表明傳感器再現性良好，如圖6（c）所示.

為檢測傳感器對 DA 的選擇識別能力，選取了幾種常見共存物，包括葡萄糖（Glc）、谷氨酸（Glu）、丙氨酸（Ala）、酪氨酸（Tyr）、檸檬酸（CA ）、尿酸（UA ）、抗壞血酸（AA ）、腎上腺素（AD ）和去腎上腺素（NE ），考察了傳感器對它們的響應情況，如圖6（d）所示，共存物濃度為 DA 濃度的20倍，這些共存物對 DA 不產生影響，表明所制備的 MIP-ECL 傳感器對 DA 的選擇性良好.

2.6 比率法與非比率法的 RSD 比較

為了驗證比率法是否能提高檢測方法的重現性和檢測結果的準確度，分別采用比率法（以陽極信號與陰極信號的比值定量）和非比率法（以陽極信號定量）對不同物質的量濃度的 DA 進行平行檢測，比較其 RSD，如圖7所示，可以看出比率法的 RSD 要明顯低于非比率法，證明比率法能提高方法的重現性，自然也能提高檢測結果的準確度.

3 結論

本實驗基于 g-C3N4NSs 的雙電位 ECL 信號，及 DA 對其陽極信號的猝滅作用，構建了一種檢測 DA 的比率 ECL 傳感器.為了提高傳感器的靈敏度和選擇性，在傳感器構建過程中，將具有良好導電性和大比表面積的 MWCNTs 摻入 g-C3N4NSs 中，同時引入對 DA 具有高識別能力的 MIP 膜，大大改善了傳感器的靈敏度和選擇性.與常見的由2種發光物質或2個工作電極構成的比率體系相比較，該體系最大的優點是只用了一個發光物質和一個工作電極，體系組成及儀器結構都更加簡單，操作也更方便.實驗結果也證明，所構建的傳感器對 DA 表現出良好的選擇性響應，和單信號的非比率法相比較，比率法的重現性有較大提高.

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（責任編輯：郁慧，包震宇）