沸石咪唑框架納米復合顆粒對菌膜的清除研究

侯嘉欣　彭龍漩　楊得民　呂敏

摘要：近年來，新型納米抗菌材料因其特殊的理化性質和作用機制，在抗菌膜方面展示了不容忽視的潛力.但是，如何提高這些抗菌劑穿透菌膜胞外聚合物基質（EPS ）的能力，以達到低劑量、高療效的目的，仍是一個挑戰.為了解決這個難題，通過一鍋法成功合成了一種帶正電、靶向菌膜中胞外脫氧核糖核酸（eDNA ）的沸石咪唑框架納米復合顆粒（ZIF-8@D）.研究發現， ZIF-8@D 能夠迅速穿透菌膜，并在菌膜內部釋放脫氧核糖核酸酶 I （ DNase I ），DNase I 能水解菌膜中的 eDNA，以達到分散菌膜的目的.這項研究不僅為設計高穿透性的抗菌膜材料提供了新思路，而且拓展了沸石咪唑框架結構在生物醫學領域的應用.

關鍵詞：細菌耐藥性；沸石咪唑框架；銅綠假單胞菌；菌膜

中圖分類號：Q 939? 文獻標志碼：A?? 文章編號：1000-5137（2023）01-0053-07

Study on zeolitic imidazolate framework nanocomposites for biofilm eradication

HOU Jiaxin，PENG? Longxuan，YANG? Demin，LYU? Min*

（College of Chemistry and Materials Science，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China）

Abstract：In recent years，novel antibacterial nanomaterials show a non-negligible potential in anti-biofilm due to their specific physiochemical properties and mechanism of action. However，it is still a challenge to improve the ability of these antibacterial agents to penetrate the extracellular polymeric matrix（ EPS ） of the biofilm to achieve the goal of high efficacy at low dose . To solve this problem，we adopted the one-pot method to successfully synthesize a zeolitic imidazolate framework nanocomposite with positive charge and targeting extracellular deoxyribonucleic acid（ eDNA ） in the biofilm（ZIF-8@D）. The results showed that ZIF-8@D nanoparticles could quickly penetrate the biofilm and release deoxyribonuclease（ DNase I ） inside the biofilm，which hydrolyzed the eDNA to disperse the biofilm. This work not only provides a new insight into designing anti-biofilm materials with high penetrability，and also expands the application of zeolite imidazole frameworks in biomedicine .

Key words：antimicrobial resistance；zeolitic imidazolate framework；Pseudomonas aeruginosa；biofilm

0 前言

專家預測到2050年，全球每年將有1000萬人死于細菌耐藥性.除了抗生素濫用導致細菌產生耐藥基因外，細菌自身形成群體結構菌膜（biofilm）也是誘發細菌耐藥性的重要因素[1-2].研究表明，60%～70%的細菌感染與菌膜的形成有關，而菌膜誘發的細菌耐藥性與其自身結構密切相關[3-4].菌膜是一種有別于浮游細菌的生存方式，它是細菌為適應生存環境而吸附于材料表面，形成由細菌及其自身分泌的胞外聚合物基質（EPS ）組成的群體結構[5].EPS 是由胞外脫氧核糖核酸（eDNA ）、結構蛋白、胞外多糖和脂質等生物大分子通過纏結、靜電吸附等方式形成的類水凝膠結構[6].eDNA 在細菌的黏附和菌膜的形成中起關鍵作用，成為當前菌膜清除的重要靶點[7].大量報道證實，菌膜結構可以有效阻礙環境不利因素（例如抗生素、機械力和滲透壓等）對其內部細菌的直接傷害.臨床處理菌膜細菌所需的抗生素劑量是處理浮游細菌的10～1000倍[8-10].因此，如何提高抗菌劑穿透菌膜 EPS 結構的能力，精準靶向菌膜結構組分，實現高效解決細菌菌膜感染，成為生物醫學和材料學交叉研究領域的前沿熱點.

近年來，金屬有機框架材料（MOF ）因其可控的粒徑、高比表面積、可調的孔徑和良好的生物相容性，在藥物遞送、生物成像和疾病治療等方面表現出極大的應用前景[11-14].沸石咪唑框架（ZIF-8）因具有多孔、高負載、低毒性，以及對 pH 敏感等特點，常作為藥物和生物大分子（蛋白質、DNA 和酶等）的載體[15]，用于腫瘤和細菌感染等疾病的治療.例如，BAGCHI 等[16]利用藥物方酸（SQ）修飾的金屬有機框架 ZIF-8，增強光動力（PDT ）對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA ）和菌膜的療效；SU 等[17]開發了一種內置伏立康唑的沸石咪唑框架（V-ZIF ），鋅離子（Zn2+）與伏立康唑的配位結合可減少伏立康唑的意外泄漏，實現了伏立康唑的零級釋放動力學，有助于穿透白色念珠菌菌膜，并殺死念珠菌.目前，ZIF-8在抗菌膜方面的應用主要聚焦于運載抗生素進入菌膜，通過殺死細菌破壞菌膜.然而，精準靶向菌膜結構組分，通過物理或化學方法破壞生物大分子間的相互作用以實現菌膜清除的報道還較為少見.

因此，本研究選擇革蘭氏陰性菌銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PAO1）為模式生物構建菌膜，以菌膜中的 eDNA為靶點構建新型抗菌膜策略.銅綠假單胞菌是一種常見的條件致病菌，可感染人體的任何組織和部位，引起手術切口和燒傷組織感染、中耳炎[18]、角膜炎[19]、尿道炎[20]、肺炎[21]和心內膜炎[22-23]等疾病，常被用于實驗室研究菌膜行為的模式生物.本研究設計了一種新型抗菌膜材料，即用 ZIF-8納米顆粒吸附脫氧核糖核酸酶 I（ DNase I ）形成沸石咪唑框架納米復合顆粒 ZIF-8@D.該材料與菌膜間存在靜電作用，能夠增強材料在菌膜中的穿透性，菌膜內部酸性環境可以刺激 ZIF-8降解，釋放 DNase I 和 Zn2+. DNase I 能水解 eDNA 以破壞菌膜結構和實現 Zn2+抗菌，實現高效清除菌膜的目的.本研究為深入了解菌膜與抗菌劑之間的相互作用提供了理論指導，也為治療臨床中的菌膜感染提供了新策略.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

DNase I （脫氧核糖核酸酶 I 來源于牛胰腺）、結晶紫（CV ）購于 Sigma-Aldrich 公司；2-甲基咪唑、硝酸鋅六水合物（Zn （ NO3）2·6H2 O ）購于上海國藥集團化學試劑有限公司；熒光染料 Alexa flour 647，SYTO 9購于 Invitrogen 公司；LB肉湯培養基、Agar 瓊脂粉購于生工生物工程（上海）股份有限公司；銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）購于中國普通微生物菌種保藏管理中心；超純水用Aquapro系統（電阻率為18 MΩ·cm）制備.

1.2 實驗儀器

場發射掃描電子顯微鏡（FE-SEM，Hitachi S-4800）；動態光散射（DLS）分析儀（Malvern Nano-ZS90）；紫外分光光度儀（Shimadzu UV-1800）；熒光分光光度儀（Hitachi F-7000）；酶標儀（ThermoMultiskan MK3）；激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP8）；pH計（MSC-100）；離心機（Eppendorf Centrifuge 5424 R）；超聲機（XM300UHP）；生化培養箱（LRH-70F）；X 射線衍射儀（XRD，BRUKER/AXS，D8 ADVANCE）；恒溫振蕩器（THZ-C-L ）.

1.3 實驗方法

1.3.1 ZIF-8@D 的合成

2-甲基咪唑（0.28 g）充分溶解于1 mL 水中，Zn （ NO3）2·6H2O （0.015 g）充分溶解于100μL 水中；兩者充分混勻后，室溫（25℃）靜置2 h；再向上述混合溶液中加入100μL DNase I 溶液（1.2 mg ·mL-1），充分混勻后室溫（25℃）靜置2 h；10000 r ·min-1離心10 min 得到 ZIF-8@D.

1.3.2 ZIF-8@D 的表征

FE-SEM 表征 ZIF-8和 ZIF-8@D 的形貌和粒徑大小.DLS 表征 ZIF-8和 ZIF-8@D 的 Zeta 電位；在8 d 內測定 ZIF-8@D 水合粒徑，確定材料的穩定性.XRD 表征 ZIF-8和 ZIF-8@D 的晶體結構.

1.4 細菌培養

從4℃保存的細菌平板挑取單菌落接種于3 mL LB 液體培養基中，37℃搖床（220 r ·min-1）振蕩培養過夜.收集菌懸液，10000 r ·min-1離心菌液1min，去除上清液，并用生理鹽水（NaCl，質量分數為0.9%）重懸沉淀，用紫外分光光度計測定菌液在600 nm 處的光密度值（OD600），稀釋菌液濃度至109 CFU ·mL-1備用.

1.5? ZIF-8@D 抗菌膜性能測定

1.5.1 菌膜生長

24孔板中加入濃度為107 CFU ·mL-1細菌懸液，37℃靜態生長24h.培養結束后，輕輕吸去上部菌液，并用1 mL 磷酸鹽緩沖液（PBS ）輕輕清洗孔板底部的菌膜.然后，每孔加入200μL 的不同材料（DNase I， ZIF-8和 ZIF-8@D），37℃共同孵育2 h.

1.5.2 CV 染色

菌膜與 ZIF-8@D 共孵育2h 后，吸去上清液，用1 mL PBS 輕輕沖洗菌膜1次并風干.然后加入300μL 質量分數為0.1%的CV 染色，染色15 min，吸去上清，PBS 輕輕洗滌3次.用數碼相機對菌膜進行拍照.最后，每孔加入1 mL 95%（質量分數）乙醇洗脫15 min，酶標儀測量細菌在595 nm 處的光密度值（OD595）.

1.5.3 激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM ）成像

紅色熒光染料 Alexa Fluor 647（10μmol·mL-1）與 ZIF-8@D 在300 r ·min-1振蕩結合2 h，ZIF-8@D 被標記為紅色.

培養24 h 的菌膜，吸去上清液后，用1 mL PBS 輕輕清洗1次，每孔加入300μL SYTO 9（20μmol·mL-1，綠色熒光，標記細菌）染色15 min.吸去上清，用 PBS 輕輕洗去殘留的 SYTO 9，再將200μL Alexa Fluor 647標記過的 ZIF-8@D 加到每孔中，共孵育2h，吸去上清液，用1 mL PBS 輕輕沖洗菌膜1次.隨后用 CLSM 成像觀察.SYTO 9和 Alexa Fluor 647的激發光/發射光波長分別為480 nm/500 nm 和650 nm/666 nm.通過沿 Z 軸以0.1μm 間隔掃描菌膜獲取3D 圖像.

2 結果與討論

2.1? ZIF-8@D 的合成及表征

首先，采用水相合成的方法制備 ZIF-8[24]，然后利用 ZIF-8的多孔和吸附能力，簡單混合，將 DNase I 吸附到框架表面合成 ZIF-8@D，如圖1所示.

用 FE-SEM 觀察 ZIF-8和 ZIF-8@D 的形貌，如圖2（a）～2（d）所示，合成的 ZIF-8和 ZIF-8@D 為多面體結構.粒徑統計分析結果如圖2（e）～2（f）所示，ZIF-8的尺寸約為（59.1±11.7） nm，ZIF-8@D 尺寸約為（64.6±10.0） nm. DNase I 的分子質量為32 ku，ZIF-8@D 直徑的增大歸因于 ZIF-8和 DNase I 的復合.

用 Zeta 電位分析測量 ZIF-8和 ZIF-8@D 的電勢，2種樣品電位分別為（37.4±0.7） mV和（36.2±4.2） mV，均帶正電荷，有利于材料與帶負電的菌膜相互作用.DNase I 的等電點為4.7，在中性溶液中帶負電，其吸附于 ZIF-8表面時，并不會導致顯著的電荷變化.用 XRD 分析 ZIF-8和 ZIF-8@D 的晶體結構，如圖3所示，晶向指數符合文獻報道的 ZIF-8晶型，說明在合成過程中材料的結晶度未受損[25].此外，如圖4所示，該材料在8 d 時間內的水合粒徑幾乎沒有變化，證明 ZIF-8@D 具有良好的水分散性和穩定性.

2.2? ZIF-8@D 對菌膜結構的清除效果

本研究致力于構建一種具有良好穿透力和高效清除菌膜的抗菌膜材料.根據銅綠假單胞菌 PAO1菌膜生長動力學，選取培養24 h 后的成熟菌膜作為研究對象.預實驗結果顯示共孵育2 h 的效果較為合適，且此后延長時間均無顯著性差異，故將 ZIF-8@D 與成熟菌膜共孵育2 h，然后進行 CV 染色，分析菌膜生物量.如圖5（a）所示，DNase I，ZIF-8和 ZIF-8@D 都能夠破壞菌膜，破壞率分別為63.9%，69.3%和87.8%. DNase I 可以降解菌膜 eDNA，然后破壞菌膜的穩定性[26].ZIF-8對菌膜造成破壞可能緣于其釋放的 Zn2+可以抗菌，細菌死亡導致菌膜結構分解[27].與 DNase I 和 ZIF-8相比，ZIF-8@D 對成熟菌膜的高破壞率表明，DNase I 和 ZIF-8復合后產生了協同抗菌膜效應.

圖5（b）為用激光共聚焦顯微技術分析的ZIF-8@D 材料在菌膜中的穿透和分布情況（紅色熒光為 ZIF-8@D，綠色熒光為菌膜）.ZIF-8@D 穿透菌膜過程中，隨機選取一個區域，進行正交剖面觀察，攜帶紅色熒光的 ZIF-8@D 嵌入綠色菌膜中，表明 ZIF-8@D 能夠順利穿透菌膜.從如圖5（c）所示的菌膜3D 圖中觀察到黃色熒光，這說明 ZIF-8@D（紅色熒光）和菌膜細菌（綠色熒光）相互作用，證明 ZIF-8@D 穿透了表面 EPS 結構自主進入菌膜內部.其中的菌膜內部黑色部分表示 ZIF-8@D 對菌膜進行了一定程度的破壞.對3D 熒光圖進行量化后，紅綠熒光的趨勢隨菌膜縱深保持一致，表明在菌膜不同深度的 ZIF-8@D 與菌膜嵌入結合的情況良好，如圖5（d）所示.

綜上，與其他復合材料所需的6 h 相比[28]，ZIF-8@D 能夠在更短的時間內迅速穿透菌膜，并進入菌膜內部，而其吸附的 DNase I 能夠水解菌膜 eDNA，達到分散菌膜的目的.

2.3? ZIF-8@D 對菌膜的作用機制

結合 ZIF-8@D 的理化性質和對菌膜的作用效果，推測 ZIF-8@D 破壞成熟菌膜的機制包括以下幾個階段，如圖6所示：首先，帶負電的菌膜通過靜電相互作用將帶正電的 ZIF-8@D 運輸穿透 EPS[29]；同時， ZIF-8@D 的粒徑小于菌膜類凝膠的形成孔徑（500 nm），因此可以快速進入菌膜內部[30]；接著，當ZIF-8@D 材料進入菌膜后，響應菌膜內部的酸性環境裂解框架，釋放出 DNase I 和 Zn2+[27]；最后，DNase I 特異性識別底物，即菌膜中的 eDNA，并進行水解 eDNA，進而瓦解 EPS 結構，達到分散菌膜的目的[26，31].

3 結論

抗菌劑難穿透細菌菌膜是阻礙其發揮高療效的重要原因.本研究通過簡單的一步合成法制備了穩定性和分散性良好的新型納米復合顆粒 ZIF-8@D. ZIF-8@D 既保持了 DNase I 的催化活性，而且能夠攜帶酶快速穿透菌膜.進入菌膜后，ZIF-8@D 可響應菌膜酸性環境，釋放 DNase I，水解 eDNA，分散菌膜，最終達到抗菌膜的功效.盡管 ZIF-8@D 可以在2 h 內穿透并清除大約90%菌膜，但是剩余10%的菌膜依然具有生長為體積更大菌膜的潛在風險和危害.因此，進一步提高 ZIF-8@D 分散能力和增強其殺死細菌能力是未來需要解決的問題.本研究不僅為清除菌膜提供了一種新型納米材料，也為解決細菌耐藥性問題提供了新思路.

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（責任編輯：郁慧，顧浩然）