茵陳蒿湯對阻塞性黃疸大鼠肝細胞ATF6/GRP78/CHOP凋亡信號通路的影響

孫一萌，劉浩，劉軍艦，吳艷麗，張西波，戚經天，李忠廉

（1．天津醫科大學研究生院，天津 300070；2．湖北省第三人民醫院腎內科，武漢 430033；3．天津市中西醫結合醫院肝膽胰外科二，天津 300100；4．東營市中醫院重癥醫學科，東營 257055）

阻塞性黃疸多因膽管結石、膽道閉塞、腫瘤壓迫等膽管機械性梗阻使膽汁淤積，無法排除所致。通常會引起肝功能指標異常和肝細胞損害以及高膽紅素血癥、高膽汁酸血癥、內毒素血癥、細菌移位等病理改變，造成多器官功能障礙，其中肝損傷首當其沖[1]。肝細胞凋亡是肝損傷最重要的基本發病機制之一，細胞凋亡是引起肝臟損傷和肝臟疾病的中心環節[2]。茵陳蒿湯的主要組成藥物是茵陳蒿、梔子、大黃，具有清熱利膽、保肝疏肝、抗纖維化、降低血糖、降低血脂、抗炎止痛、抑制肝細胞凋亡的多種功效，對治療肝損傷有很好的作用。近年來，內質網應激（ERS）在肝細胞凋亡中的作用機制是當前的研究熱點，目前尚未完全闡明。未折疊蛋白（UPR）應答是ERS 的一個重要信號轉導通路，它包括肌醇依賴性激酶（IRE）1α 和蛋白激酶R 樣內質網激酶（PERK）、轉錄活化因子6（ATF6）3 個內質網跨膜蛋白。葡萄糖調節蛋白78（GRP78）是ERS 誘導表達的關鍵蛋白，是ERS 與UPR 應答啟動的一個標志。課題組在前期實驗研究中發現，IRE1α、PERK 介導ERS 過程中可能存在阻塞性黃疸肝細胞凋亡現象，茵陳蒿湯肝臟保護機制也可能與ERS 在IRE1α 和PERK 介導下發揮相關作用有關[3-4]。本研究通過建立阻塞性黃疸肝損傷細胞模型，探討阻塞性黃疸的肝損傷機制與ATF6 介導的信號通路的關系，進一步闡明茵陳蒿湯減輕肝損害的可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物與細胞 健康SPF 級Sprague-Dawley（SD）大鼠12 只[許可證號：SCXK-（軍）2014-0001]，體重200 g 左右（北京華阜康生物科技股份有限公司），在室溫20～25℃，相對濕度（50±20）%，12 h/12 h明暗周期的環境下分籠飼養于動物實驗室。實驗細胞為大鼠正常肝細胞BRL-3A，購自中國科學院上海細胞庫，使用DMEM 高糖培養基+1%青鏈霉素培養。接種于直徑6 cm 的培養皿中，每2～3 d 傳代1次，取生長情況良好的細胞用于本次實驗。

1.1.2 主要試劑、藥物與儀器 茵陳蒿湯由茵陳蒿30 g、梔子20 g、大黃10 g 組成（天津市中西醫結合醫院）；DMEM 高糖培養基（Hyclone 公司，美國）；胎牛血清、胰蛋白酶（EDTA）（Gibco 公司，美國）；二甲基亞砜（DMSO）（Sigma 公司，美國）；Anti-actin、Anti-ATF6、Anti-CHOP、Anti-GRP78、兔二抗、鼠二抗（北京百奧思科公司，貨號分別為MD409、MD4830、MD4846、MD886、MD2141、MD2142）；cDNA 反轉錄試劑盒（Thermo Scientific 公司，美國，貨號K1621）；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time PCR）試劑盒（南京建成公司，貨號N117）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（MDL 公司，貨號MD913053）；TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒（德國羅氏，貨號11684795910）；大鼠谷丙轉氨酶（ALT）ELISA 試劑盒（澤葉生物公司，貨號ZY60182R）；大鼠天冬氨酸轉氨酶（AST）ELISA 試劑盒（澤葉生物公司）。BHC-1300ⅡA2 型超凈工作臺（蘇州金凈凈化設備科技有限公司）；311 型CO2恒溫培養箱（Thermo 公司，美國）；3-30型號K 低溫離心機（Sigma 公司，德國）；電熱恒溫水浴槽（上海醫用恒溫設備廠）；倒置相差顯微鏡（Olympus 公司，日本）；TS-100 型脫色搖床（海門其林貝爾儀器制造公司）；BG-sub MIDI 型電泳儀（北京百晶生物技術有限公司）；170-8280 型ChemiDoc MP 化學發光成像系統（Bio-rad 公司，美國）；Gel Doc-It310 型凝膠成像系統（UVP 公司，美國）；SDSPAGE 電泳系統（BIO-Rad 公司，美國）；QuantStudio 3 型PCR 擴增儀（ABI 公司，美國）；T100 型熱循環聚合酶鏈式反應（PCR）儀。

1.1.3 中藥及含藥血清制備 中藥冷水浸泡30 min后大火燒開，轉文火煎藥45 min，再次加水以文火煎30 min，保留湯藥。阻塞性黃疸血清：SD 大鼠麻醉后消毒，上腹正中切口入腹，膽總管中上1/3 行雙重結扎，7 d 后留取阻塞性黃疸模型大鼠血清。茵陳蒿湯含藥血清：根據茵陳蒿湯的臨床用量計算出大鼠的等效劑量，按每100 g 體重1 mL 茵陳蒿湯劑量給SD 大鼠灌胃[5]，2 次/d，連續灌胃7 d，末次給藥2 h 后采血，留取茵陳蒿湯含藥血清。下腔靜脈采血，3 000 r/min 離心15 min，分離血清，經56℃、30 min 滅火處理后，用0.22 μm 微孔濾膜過濾細菌，-80℃凍存備用。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組與處理 將濃度為2×105/mL 的BRL-3A 細胞接種到12 孔培養板中，每孔2 mL，共接種27 孔，置CO2恒溫箱中培養24 h，觀察細胞貼壁達80%左右后將培養板移至超凈工作臺，吸棄每孔中的培養基并用PBS 緩沖液洗2 次，27 孔被隨機分為3 組，每組9 孔，分別為對照組（S 組）：DMEM高糖培養基+15%胎牛血清常規培養；阻塞性黃疸組（O 組）：DMEM 高糖培養基+5%阻塞性黃疸血清+10%胎牛血清；阻塞性黃疸+茵陳蒿湯組（Y 組）：DMEM 高塘培養基+5%阻塞性黃疸血清+10%茵陳蒿湯含藥血清。3 組細胞加入含相應血清的培養基2 mL，分別在培養6、24、48 h，3 個時間點取細胞沉淀與上清液，每個時間點每組取3 孔。用Western 印跡法與q－PCR 測每組細胞中ATF6、GRP78、CHOP蛋白與基因含量，上清液中測ALT、AST 含量。

1.2.2 細胞一般形態觀察 將細胞培養板從培養箱中取出，觀察細胞培養液的顏色和清澈度，用20 倍物鏡觀察細胞的輪廓、形狀和內部結構。

1.2.3 實時熒光定量PCR（q－PCR）檢測BRL－3A細胞中ATF6、GRP78、CHOP mRNA 的水平 按照說明書裂解組織，提取總RNA 并檢測其濃度和純度。根據逆轉錄試劑盒將RNA 逆轉錄合成擴增前cDNA。以2 μL cDNA 為模板，甘油醛－3－磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參mRNA，用SYBR Green 按95℃順序預變性2 min，94℃變性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，共40 個循環，按照2－ΔΔCt法進行定量分析，PCR 引物由北京賽百盛基因技術有限公司設計，所需引物見表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

1.2.4 Western 印跡檢測BRL－3A 中ATF6、GRP78、CHOP 蛋白表達 根據BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白變性后，以每孔40 μg 的量進行上樣，進行電泳分析，轉膜，封閉，裁剪目的條帶，按照說明書配制稀釋比例均為1∶1 000，將剪取條帶置于一抗4℃條件下孵育過夜，TBST 洗膜，按照說明書以兔二抗1∶2 000 的稀釋比例配制二抗稀釋液，室溫孵育2 h，洗膜，成像儀上進行信號檢測，分析條帶。

1.2.5 原位末端標記法（TUNEL）檢測細胞凋亡情況 根據說明書，使用TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒進行TUNEL 染色，檢測細胞凋亡。通過末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）結合生物素化的脫氧核苷酸DNA 片段。用TACS Blue Label 檢測生物素化核苷酸。TUNEL 染色后，切片用4′－6－二氨基－2－苯基吲哚（DAPI）復染以檢測細胞核，呈藍色染色。TUNEL陽性細胞為綠色染色的細胞（波長488 nm）。

1.2.6 ELISA 試劑盒檢測培養液中ALT、AST 情況 收集得各孔細胞培養液，將細胞培養液經離心機3 000 r/min 離心10 min，取上層液使用全自動生化儀檢測各組血清ALT、AST 水平。

1.3 統計學處理 應用SPSS 26．0 軟件包分析數據。正態分布的計量資料用±s 表示，多組之間的比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t 檢驗，P＜0．05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞形態學變化 BCL－3A 大鼠肝細胞的正常形態特征如圖1A、1B、1C 所示。與S 組相比，O 組和Y 組細胞在所有時間點（圖1D、1E、1F）均明顯變小、變形，數量減少；但與O 組相比，Y 組細胞狀態在每個時間點（圖1G、1H、1I）均有顯著改善。

圖1 細胞形態學變化（100×）Fig 1 Changes in cell morphology（100×）

2.2 TUNEL 法檢測細胞凋亡 TUNEL 陽性染色結果如圖2 所示。與S 組相比，O 組和Y 組在每個時間點的凋亡指數均升高；與O 組相比，Y 組在各時間點的凋亡指數均下降（均P＜0．05），見表2。

圖2 TUNEL 法檢測細胞凋亡（100×）Fig 2 Apoptosis detected by TUNEL（100×）

表2 BCL-3A 大鼠肝細胞凋亡指數（%，±s）Tab 2 Hepatocyte apoptosis index in BCL-3A rats（%，±s）

表2 BCL-3A 大鼠肝細胞凋亡指數（%，±s）Tab 2 Hepatocyte apoptosis index in BCL-3A rats（%，±s）

注：O 組：阻塞性黃疸血清配制的培養基培養的阻塞性黃疸組；Y 組：梗阻性黃疸血清+茵陳蒿湯含藥血清配制的培養基培養的阻塞性黃疸+茵陳蒿湯組

時間點S 組O 組Y 組FP 6 h2．47±0．91 10．40±1．41 4．66±0．7351．94 ＜0．001 24 h8．73±1．76 24．56±1．96 13．93±1．91 46．62 ＜0．001 48 h15．64±1．29 50．95±3．04 21．79±2．70 241．4 ＜0．001

2.3 mRNA 的表達水平 q－PCR 顯示，在每個時間點，O 組和Y 組的ATF6、GRP78 和CHOP 的mRNA表達水平均高于正常組（均P＜0．05）。與O 組相比，Y 組在各時間點的ATF6、GRP78 和CHOP mRNA表達水平均顯著降低（F=52．46、129．5、280．9，91．87、81．36、108．4，79．95、62．98、43．40，均P＜0．05），見圖3。

圖3 茵陳蒿湯對ATF6、GRP78 和CHOP mRNA 表達的影響Fig 3 Effects of Yinchenhao decoction on the expression of ATF6，GRP78 and CHOP mRNA

2.4 蛋白質表達水平 Western 印跡顯示，與S 組比較，O 組和Y 組的CHOP、ATF6 和GRP78 蛋白表達水平在各時間點均高于S 組（均P＜0．05）。與O 組相比，Y 組的CHOP、ATF6 和GRP78 蛋白表達水平在各時間點均顯著降低（F=88．36、59．90、46．07，127．7、111．2、107．1，71．09、107．0、154．3，均P＜0．05），見圖4。

圖4 Western 印跡檢測蛋白質的表達水平Fig 4 The expression of the protein detected by Western blotting

2．5 各時間點培養液中ALT、AST 測定結果 與S組比較，O 組與Y 組在各時間點AST、ALT 水平均高于S 組（均P＜0．05）；與O 組比較，Y 組在各時間點AST、ALT 水平均低于O 組，但較S 組高（均P＜0．05），見表3。

表3 ALT、AST 測定結果Tab 3 Results of ALT and AST determination

3 討論

長期膽道梗阻可使膽汁阻塞無法正常排出，膽汁瘀滯不暢使膽管增寬擴張，含毒素膽汁也隨流入血中，肝臟在毒素作用下產生炎癥，毒素在膽道梗阻的作用下因不能排出體外而形成內毒素血癥，內毒素與肝損傷的形成有直接關系，進而可能導致肝纖維化，嚴重者會導致肝功能衰竭[6－7]。從中醫理論來講，黃疸多以感染濕熱、疫毒、寒濕為主，皮膚橘黃、顏色鮮明為多陽黃，病因以感受濕熱之邪，邪濕內蘊為主，發病較急，病程較短；皮膚雖黃但顏色晦暗多為陰黃，多以感受寒濕之邪為主，發病較緩，病程較長。梗阻性黃疸的病因若持續存在，會升高膽紅素，引起皮膚鞏膜黃染，嚴重時可能會引起肝細胞損害，因此利用茵陳蒿湯降低膽紅素，進而褪去黃疸和治療肝損害成為治療本病的關鍵。茵陳蒿湯作為古今清熱、利濕、退黃的代表方劑，主要用于治療濕熱證為主的黃疸病。雖用藥頗簡，配伍卻十分嚴謹。此方茵陳為君藥，藥量達6 兩，重取其清熱利濕、利膽退黃之功效，從而利小便排出濕熱之邪。梔子作為臣藥，用量14 枚以清利中焦與下焦的濕熱之邪，佐以大黃2 兩，增強其清熱瀉火退黃、瀉下攻積之功效，使谷疸不留于宿食，濕熱瘀積之邪褪去，黃疸則消。現代藥理學研究表明，茵陳色原酮可以阻滯細胞周期從而抑制前列腺癌細胞增殖[8]，茵陳蒿中乙酸乙酯能夠通過阻斷磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B 信號通路來誘導肝癌細胞的凋亡[9]。梔子中的藏紅花素在腸道內的水解為西紅花酸，有研究顯示，西紅花酸可顯著抑制乙醛誘導的大鼠肝星狀細胞增殖模型，降低Ⅰ型及Ⅲ型膠原的合成并通過調控肝星狀細胞Bax、Bcl－2 的表達，促進細胞凋亡[10]。

內質網可以通過一系列協同適應性反應，使內環境處于穩定狀態，當細胞受到缺氧、鈣平衡紊亂、氧化應激或毒物反應等刺激時，會影響內質網折疊修飾蛋白質的功能，導致未折疊蛋白在內質網腔內聚集，稱為ERS。研究發現，許多肝臟疾病的發生、發展過程與ERS 誘導的肝細胞凋亡均有密切關系。ERS 作為細胞對內質網壓力反應的自我保護機制，具有重要意義，適度的ERS 可通過UPR 來減輕內質網蛋白質負荷，保護內質網功能，而UPR 在內質網中的長時間積聚則會損傷內質網功能，細胞會以凋亡的形式消除受損細胞。

ATF6 是一種Ⅱ型跨膜感受蛋白，存在于真核細胞內質網膜上，是CREB/ATF 轉錄因子家族的一員。在非應激狀態下，ATF6 以酶原的形式處于抑制狀態，在應激狀態下時，激活的ATF6 在高爾基體上轉位后發生切割。之后，裂解的ATF6 移動到細胞核，作為一個活性轉錄因子，上調GRP78 蛋白的轉錄，使X－盒結合蛋白1（XBP1）與CHOP 等內質網相關伴侶分子蛋白的表達增加，提高了細胞對UPR的處理能力[11]。GRP78 作為分子伴侶主要存在于真核生物中的內質網膜上，它與錯誤折疊的蛋白質和未組裝的復合物結合，并啟動負責UPR 調節的內質網相關降解（ERAD）[12－14]。在非應激狀態下，GRP78與ATF6、PERK、IRE1 以非活性形式相結合，在細胞接觸內質網內累積的未折疊蛋白質后，GRP78 被釋放出來，在消耗能量后促進蛋白的正確折疊，與此同時，GRP78 過量表達可以減少內質網內鈣離子水平，減輕ERS，在內質網穩態中發揮重要作用[15－16]。非應激狀態下，細胞內CHOP 的含量極少，當ERS誘導細胞凋亡時，活化的ATF6 在胞核內與ERS 反應元件結合，啟動CHOP 轉錄與表達并積聚于細胞核內，作為轉錄因子，CHOP 能調節如Bcl－2、TRB3、GADD34 等許多促凋亡因子的表達，進而誘導細胞凋亡[17－18]。

本研究結果顯示，與S 組比較，O 組肝細胞在各時間點肝功能指標及凋亡指數均高于S 組，O 組肝細胞在各時間點ATF6、GRP78、CHOP 蛋白與mRNA 表達水平均高于S 組，提示阻塞性黃疸肝損傷中存在ERS 的激活，ERS 中的ATF6 信號通路及細胞凋亡途徑在阻塞性黃疸肝損傷細胞中被激活。與O 組比較，Y 組肝細胞在各時間點肝功能指標及調往指數均明顯降低，Y 組肝細胞在各時間點ATF6、GRP78、CHOP 蛋白與mRNA 表達水平均低于O組，提示茵陳蒿湯含藥血清干預阻塞性黃疸肝損傷細胞模型后GRP78 表達下調，使ERS 得到一定程度緩解，茵陳蒿湯含藥血清一定程度上抑制了阻塞性黃疸肝損傷細胞中ATF6 的表達，從而降低了其對下游信號分子CHOP 的激活，減少了ERS 誘導的肝細胞凋亡，進而改善阻塞性黃疸肝功能損傷。

綜上所述，ERS 中的ATF6 信號通路可能被激活并參與了阻塞性黃疸誘導的肝細胞凋亡病理過程，茵陳蒿湯含藥血清可改善阻塞性黃疸細胞模型的肝功能情況，其機制可能與其下調ATF6、GRP78和CHOP 的表達，進而緩解ERS 進而抑制肝細胞凋亡相關。