GADD45A 通過端粒替代延長途徑調控骨肉瘤細胞增殖

韓鑫宇，李婷芳，王峰

（天津醫科大學基礎醫學院醫學遺傳學系，天津 300070）

骨肉瘤是一種起源于類骨質組織，常見于兒童和青少年的惡性骨腫瘤，具有極強的侵襲性并且常常在早期發生轉移，主要涉及股骨、脛骨和肱骨[1-2]。端粒延長是腫瘤生長所必需的關鍵過程，不同于絕大多數腫瘤通過激活端粒酶來維持端粒，以骨肉瘤為代表的10%～15%的人類腫瘤通過端粒延長替代途徑（alternative lengthening of telomeres pathway，ALT）來維持端粒。使用ALT 延長端粒的腫瘤細胞具有獨特的ALT 相關表型，例如含有端粒DNA 的大型早幼粒細胞白血病體（promyelocyte leukemia，PML），稱為ALT 相關PML 小體（ALT-related PML bodies，APBs）以及染色體外端粒DNA 環（C-circle）等[3-4]。

生長停滯和DNA 損傷誘導蛋白45a（GADD45A）定位于細胞核，其水平受周期調控，在G1 期最高而S期顯著降低。GADD45A 在細胞應激反應中起重要作用[5-6]。此外還有研究表明，GADD45A 參與了小鼠干細胞端粒DNA 損傷反應[7]。GADD45A 在細胞周期進展和停滯、DNA 修復和表觀遺傳修飾等多方面的作用與ALT 陽性腫瘤頻繁的DNA 損傷等特點高度相關[7-8]。因此本文旨在探討GADD45A 對骨肉瘤細胞生長、端粒功能和端粒延長替代途徑的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 人骨肉瘤細胞U2OS 為本實驗室保存，DMEM 培養基（美國Corning 公司），Opti-MEM培養基、胰蛋白酶（美國Gibco 公司），胎牛血清（烏拉圭Lonsera 公司），ChamQ Mix、逆轉錄試劑盒、dNTP Mix（南京諾維贊生物科技有限公司），DNA 提取試劑盒（Biomiga 倍沃醫學科技有限公司），RNA提取試劑盒（美國Promega 公司），無水乙醇、無水甲醇、異丙醇、冰乙酸（天津康科德生物化工公司），4%多聚甲醛、1 mol/L Tris-HCl（pH7.2）、牛血清白蛋白（BSA）、6×DNA loading buffer（北京索萊寶生物技術公司），國產甲酰胺、秋水仙素（上海生工生物技術股份有限公司），進口甲酰胺、TritonX-100、TWEEN-20、Gelatin from cold water fish（美國Sigma 公司），Blocking Reagent、DIG Easy Hyb Granules、CD-Star Ready-to-use solution、Anti-DIG-AP 抗體（瑞士Roche公司），TelC-FITC PNA 探針488/CY3（韓國Panagene公司），DAPI、Anti-γH2AX 抗體（德國Millipore 公司），Anti-PML 抗體（C-5）（Santa Cruz），Alexa 555 goat anti-Mouse 抗體、Lipofectamine RNAi-Max（美國Thermo 公司），siRNA（蘇州吉瑪基因有限公司），Phi 29 DNAPolymerase（美國NEB 公司），DNase/RNase free water（天根生化科技有限公司），細胞增殖-毒性檢測試劑盒CCK-8（蘭杰柯科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 將U2OS 細胞接種于10 cm 培養皿中，以DMEM 培養基（含10%胎牛血清）培養于37℃，5%CO2的培養箱中，待細胞密度達70%～80%時進行傳代。

1.2.2 siRNA 轉染 將U2OS 細胞接種于6 孔板中，待細胞生長至密度為40%時進行轉染。取兩支離心管加入Opti-MEM 后分別加入siRNA 和Lipofectamine RNAi-Max，震蕩混勻后將兩管混合，室溫靜置5 min 后逐滴加入對應細胞中，反應24 h 后棄去轉染液每孔加入2 mL 培養基，48 h 后收取細胞用于后續實驗。對應siRNA 序列見表1。

表1 目的基因siRNA 序列Tab 1 siRNA sequences of the target gene

1.2.3 穩定敲低細胞系構建 使用pLKO.1 質粒構建shGADD45A 敲低細胞系。shRNA 序列見表2。用293T 細胞對質粒進行包被，吸取過濾病毒上清感染U2OS 細胞構建穩定敲低細胞系。

表2 shRNA 序列Tab 2 Sequence of shRNA

1.2.4 實時熒光定量PCR 收取細胞，試劑盒提取RNA。測量RNA 濃度后根據逆轉錄試劑盒將1 μg RNA 逆轉合成cDNA，稀釋5 倍后用于后續實時熒光定量PCR。按照primer F 0.4 μL、primer R 0.4 μL、ChamQ Mix 10 μL、無核酸酶水7.2 μL 的體系按照程序進行擴增（表3）。根據熒光曲線的ct 值用2-ΔΔCt計算siRNA 敲低效率。

表3 PCR 引物序列Tab 3 Primer sequence for PCR

1．2．5 CCK－8 增殖實驗 牛鮑汁計數板計數U2OS細胞，96 孔板每孔接種1 000 個細胞，每個處理組設置6 組重復。分別測量轉染后第1、3、5、7 天的450 nm 處吸光度值。

1.2.6 克隆形成實驗 牛鮑汁計數板計數U2OS 細胞，6 cm 皿接種5 000 個細胞，每3 天換1 次液，第7 天收取培養皿。吸棄培養基并用超純水潤洗，然后加4%組織固定液固定20 min。洗凈固定液后加入0．5%結晶紫染液，染色20 min。洗凈多余染液，在吸水紙上倒扣瀝干水分，拍照保存用于后續分析。

1.2.7 細胞中期分裂相－熒光原位雜交（Metaphase－FISH） 直接接種穩定敲低細胞或將U2OS 接種于6 cm 培養皿，進行siRNA 轉染，收取細胞前10 h更換含秋水仙素的DMEM 培養基（秋水仙素∶培養基=1∶100）。細胞沉淀加入PBS 重懸，邊震蕩邊加入10 mL 37℃預熱的0．075 mol/L Kcl，37℃水浴孵育30 min，然后加入5 滴預冷固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1），室溫靜置5 min，900 r/min 離心8 min。吸棄上清液，邊震蕩邊加入10 mL 預冷固定液，室溫靜置30 min，900 r/min 離心8 min。吸棄上清液，加1 mL 固定液重懸并取50 μL 滴片，靜置1 晚。第2 天用4%多聚甲醛固定細胞，脫水后用TelC－FITC PNA 探針CY3 雜交端粒3 h，洗滌封片，－20℃保存用于后續拍攝統計。

1.2.8 免疫熒光－熒光原位雜交（IF－FISH） 將無菌蓋玻片放入六孔板中，直接接種穩定敲低細胞或接種U2OS 細胞并進行siRNA 轉染。收取蓋玻片洗滌固定，脫水后用TelC－FITC PNA 探針488 雜交端粒3 h，PBG 封閉1 h（PBS∶BSA∶Gelatin=1∶1∶100），加入一抗室溫孵育1 h（PML∶PBG=1∶1 000，γH2AX∶PBG=1∶1 000），洗滌后二抗室溫孵育30 min（Alexa 555 goat anti－Mouse∶PBG=1∶1 000），DAPI 封片，熒光顯微鏡拍攝并進行統計。

1.2.9 C－circle 實驗 收取細胞提取DNA，測濃度后稀釋至30 ng/μL 并按DNA template 1 μL、BSA 0．4 μL、dNTP Mix 2 μL、Phi 29 DNA Polymerase 0．5 μL、Phi 29 buffer 0．4 μL、無核酸酶水14．1 μL的體系進行PCR 反應擴增，反應程序為30℃，8 h；65℃，20 min。將擴增產物進行斑點雜交，紫外交聯固定后雜交過夜。第2 天回收雜交液并洗膜、封閉，孵育DIG 抗體8～10 h。孵育結束后洗膜最后用CDStar 顯色液曝光。

1.3 統計學處理 采用GraphPad Prism6 和Image J 軟件進行統計學分析和作圖，所有實驗數據為重復3 次實驗結果。統計結果采用t 檢驗，P＜0．05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GADD45A 對骨肉瘤細胞生長增殖的影響 實時熒光定量PCR 檢測siRNA 和shRNA 對GADD45A的敲低效率。與對照組相比，siRNA 敲低GADD45A后mRNA 水平顯著降低（t=25．96，P＜0．000 1）；與shscramble 組相比，shGADD45A－1 和shGADD45A－2兩細胞系GADD45A 的mRNA 水平下降（t=21．12、18．37，均P＜0．000 1）（圖1）。CCK－8 增殖實驗結果表明，在siRNA 敲低GADD45A 后或穩定敲低細胞系shGADD45A－1 和shGADD45A－2 中，與對照組相比，骨肉瘤細胞存活率明顯下降（t=5．051、6．192、3．775、14．86、22．93、3．013、14．61、20．93，均P＜0．05）（圖2A、2B）。克隆形成實驗結果表明，在siRNA 敲低GADD45A 后以及shGADD45A－1 和shGADD45A－2兩組穩定敲低細胞系中，骨肉瘤細胞增殖能力受到明顯抑制，克隆形成減少（t=46．68、23．73、24．98，均P＜0．000 1），見圖2C～2D。

圖1 實時熒光定量PCR 檢測GADD45A mRNA 水平Fig 1 Expression of GADD45A mRNA detected by real-time fluorescence quantitative PCR

圖2 GADD45A 對骨肉瘤細胞增殖的影響Fig 2 The effect of GAD45A on the proliferation of osteosarcoma cells

2.2 GADD45A 對骨肉瘤端粒功能的影響 細胞中期分裂相－熒光原位雜交實驗顯示，siRNA 敲低GADD45A 與shGADD45A－1 和shGADD45A－2 穩定敲低處理后結果相同，染色體末端多端粒信號（Multiple Telomere Signals，MTSs）比例明顯升高（t=24．04、7．243、27．93，均P＜0．01），端粒信號丟失（Telomere Signal Free Ends，SFEs）頻率也相應增加（t=8．222、16．61、6．781，均P＜0．01）（圖3）。

圖3 GADD45A 對骨肉瘤細胞端粒功能的影響Fig 3 The effect of GADD45A on the telomere function of osteosarcoma cells

2．3 GADD45A 對骨肉瘤端粒損傷造成的影響 免疫熒光－熒光原位雜交實驗結果顯示，在使用siRNA敲低GADD45A 和shGADD45A－1、shGADD45A－2 兩細胞系中，DNA 損傷指標γ－H2AX 與端粒共定位均上調（t=19．16、14．71、24．03，均P＜0．000 1）（圖4）。

圖4 GADD45A 對骨肉瘤端粒損傷造成的影響Fig 4 The effect of GADD45A on the telomere damage of osteosarcoma cells

2.4 GADD45A 對骨肉瘤細胞ALT 活性的影響 C－circle 實驗結果表明，使用siRNA 敲低GADD45A 時，骨肉瘤細胞中C－circle 水平明顯上升（t=41．27，P＜0．000 1）（圖5A）。采用shGADD45A－1 和shGADD45A－2 兩細胞系也顯示C－circle 水平升高（t=14．06、4．539，均P＜0．05）（圖5B）。另一方面，通過免疫熒光－熒光原位雜交實驗，siRNA 和shRNA 的處理均導致PML 與端粒共定位顯著增多（t=10．65、16．69、18．10，均P＜0．000 1），見圖5C～5D。

圖5 GADD45A 對骨肉瘤細胞ALT 活性的影響Fig 5 The effect of GADD45A on the ALT activity of osteosarcoma cells

3 討論

本研究發現敲低GADD45A 后抑制了骨肉瘤細胞的增殖，導致骨肉瘤細胞存活率下降。而端粒延長是腫瘤細胞維持增殖所必需的關鍵特征[9]。與端粒酶陽性腫瘤不同，ALT 陽性腫瘤端粒存在頻繁的DNA損傷。并且已有文獻報道GADD45A 參與了造血干細胞的DNA 損傷反應[10]。因此，本文通過H2AX 組蛋白變體（γ－H2AX）與端粒的定位來表征端粒損傷信號，首次發現敲低GADD45A 會引起骨肉瘤端粒損傷加劇。另一方面，本研究首次發現敲低GADD45A 會引起骨肉瘤細胞MTS 和SFE 顯著升高，表明GADD45A缺失會導致骨肉瘤端粒功能紊亂和復制性衰老并且引起端粒不穩定，加重脆性端粒的產生。

目前已有的研究表明，在間充質來源的腫瘤中，如中樞神經系統腫瘤和多種亞型的肉瘤，往往存在更高比例、更高水平的ALT 表型，這之中又以骨肉瘤最為突出[11]。APBs 是由早幼粒細胞白血病體（PML）、成簇聚集的端粒和一系列與DNA 復制、重組等功能相關的蛋白形成的復合體，是ALT 途徑延長端粒的場所。PML 是ALT 細胞形成APBs 并進一步維持端粒長度，造成端粒長度異質性的必要組分[12]。為了探究GADD45A 對ALT 的影響，筆者通過免疫熒光觀察PML 與端粒的共定位，發現在敲低GADD45A后，PML 與端粒的共定位明顯增多，說明GADD45A抑制了端粒到PML 的聚集，在ALT 途徑中發揮了負向調控作用。除此之外，C－circle 作為ALT 陽性腫瘤中的一種特異性且可定量的指標，可以更清晰地反映ALT 活性的變化。C－circle 是染色體外的CCCTAA 重復序列，來自于端粒的后隨鏈，與端粒TTAGGG 重復序列相對應[4]。本研究首次發現在敲低GADD45A 后，C－circle 水平顯著升高，與前面結果一致，說明GADD45A 抑制骨肉瘤細胞C－circle形成，限制了ALT 途徑發生。有文獻報道，ALT 途徑的過度激活會抑制ALT 細胞的生長[13-14]。本研究結果發現，敲低GADD45A 后，ALT 表型明顯增加，ALT 活性增加，細胞增殖受到抑制，有可能是因為GADD45A 的缺失導致ALT 被過度激活，這也會導致ALT 細胞的死亡。

目前研究認為，ALT 是一種以類似于同源重組的斷裂誘導復制（BIR）的方式進行端粒延長的途徑[15]。在端粒DNA 損傷斷裂后會激活RFC-PCNAPol δ 軸來促進APB 的組裝，開始后續RAD52 依賴和不依賴的兩種BIR 通路，整個過程還涉及BRCA1、RAD51 等多個同源重組相關蛋白[16-18]。本文已經證實GADD45A 確實參與了骨肉瘤的ALT 進程，結合以往文獻報道GADD45A 與PCNA 存在相互作用，提示其可能影響了DNA 損傷反應進而抑制骨肉瘤ALT 活性[19]。此外，已有研究表明GADD45A 可以與R-loop 結合介導CpG 島的局部去甲基化[20]。亞端粒區豐富的CG 含量提示這一過程在亞端粒位置同樣有可能實現[21]。GADD45A 介導的去甲基化過程可能抑制端粒區的異染色質化，使染色質收縮，從而阻礙ALT 相關蛋白與端粒的結合。這與過往研究中提到的ALT 端粒處松弛的染色質結構這一特點有所呼應[22]。另一方面，筆者推測GADD45A 與BRCA1的相互作用也有助于GADD45A 與R-loop 的結合，R-loop 進一步刺激同源重組過程也是引起ALT 相關表型變化的原因[19，23]，后續筆者會對GADD45A 如何調控ALT 進行深入的探究。

綜上所述，GADD45A 缺失能夠抑制骨肉瘤增殖，并通過參與骨肉瘤ALT 徑影響端粒功能，造成端粒功能紊亂，加劇端粒DNA 損傷。