腎癌來源的IL4I1 介導Treg 誘導與募集的實驗研究

來佳丹，魏詩瑤，李常穎

（天津醫科大學第二醫院泌尿外科，天津市泌尿外科研究所，天津 300211）

免疫治療是目前腎癌的重要輔助治療手段之一，免疫檢查點阻斷（ICB）治療如PD－1/PD－L1 免疫療法，被列入轉移性或不可切除性腎透明細胞癌（ccRCC）的一線/二線治療方案[1]，然而相當一部分患者難以從該療法中獲益。白細胞介素4 誘導蛋白1（IL4I1）是一種分泌性氨基酸代謝酶，因其能在B 細胞上被白細胞介素4 誘導表達而得名，在天然免疫中發揮多重免疫負性調節作用[2－5]。在一項應用帕博利珠單克隆抗體（單抗）聯合吲哚胺2，3－雙加氧酶1（IDO1）抑制劑治療晚期惡性黑色素瘤失敗的臨床研究數據中發現，免疫治療后腫瘤組織中IL4I1 的表達顯著增高，提示其表達可能是影響免疫治療效果的關鍵[6]。課題組前期研究發現，IL4I1高表達促進腎癌細胞的增殖和遷移，且與患者不良預后密切相關[7]。然而作為免疫調控因子，IL4I1 是否參與腎癌免疫抑制微環境形成、促進免疫逃逸，尚未見相關報道。本文著力探究IL4I1 在ccRCC 中的表達與其對ccRCC 中調節性T 細胞（Treg）誘導與募集的影響。

1 材料與方法

1.1 數據庫分析 利用在線腫瘤免疫浸潤數據庫TIMER2．0（http：//timer． cistrome．org/）分析ccRCC 中IL4I1 的表達水平與腫瘤中Treg 浸潤、Treg 的關鍵指標CD4、CD25（IL2RA）、FOXP3 以及趨化Treg 浸潤的關鍵趨化因子表達水平之間的相關性。

1.2 細胞系與試劑 人ccRCC 細胞系786－O、胎牛血清（Biological Industries），RPMI－1640 基礎培養基、青霉素－鏈霉素雙抗（源培生物），IL4I1 shRNA慢病毒載體（吉凱基因），TRIzol、IC 固定緩沖液、滲透緩沖液10X、反轉錄試劑盒（ThermoFisher Scientific），FS Universal SYBR Green Master（Roche），PCR 引物（生工生物），IL4I1 檢測試劑盒（酶聯免疫吸附試驗法）（CLOUD－CLONE），抗－IL－4I1/LAO 抗體（Abcam，ab222102），抗β－微管蛋白（C66）mAb（Abmart），PE 鼠抗人CD25、PE 小鼠抗人CD3（BD制藥），PE/Cyanine7 抗人CD4、APC 抗人FOXP3（e－Biocience）。

1.3 免疫組織化學法 本研究中使用的組織樣本經天津醫科大學第二醫院倫理審查委員會批準。40例原發性ccRCC 組織切片經過脫臘、水化和抗原修復后，轉移至濕盒，3% H2O2室溫避光孵育10 min以消除內源性過氧化物酶活性，5% BSA 室溫封閉15 min，滴加一抗4℃避光孵育過夜。滴加二抗37℃孵育30 min 后加入DAB 顯色、復染，染色結果于光學顯微鏡下觀察并判讀。

免疫組化結果判讀標準：IL4I1 表達于細胞質中，黃色或棕黃色染色定義為陽性表達。按蛋白表達強弱劃分染色強度：不表達，0 分；弱表達，1 分；中等表達，2 分；強表達，3 分。按陽性細胞占視野細胞數量的百分比判定染色面積：無陽性細胞，0 分；＜10%，1 分；10%～25%，2 分；25%～50%，3 分；＞50%，4 分。采用雙盲法讀片，評分=染色強度+染色面積，1～2 分為（－），3～4 分為（+），5 分為（++），6～7分為（+++）[8]。

1.4 構建IL4I1 敲低表達的腎癌細胞模型 由吉凱基因構建IL4I1 shRNA 慢病毒載體和陰性對照慢病毒載體并進行病毒滴度的檢測。人ccRCC 細胞系786－O 于RPMI1640 全培養基（含有10%胎牛血清、1%青霉素－鏈霉素）中培養。將786－O 以1×105個細胞/孔的密度接種于6 孔板中，至細胞匯合度到30%～50%，更換1 mL 加入5 μL 病毒及40 μL 相應感染增強液的全培養基，繼續培養12～16 h 后更換為常規培養基繼續培養。用含5 μg/mL 嘌呤霉素的完全培養基篩選具有嘌呤霉素抗性的786－O 細胞，得到實驗組786－O－sh 和對照組786－O－ctrl 細胞。所有細胞均置于5%CO2的37℃培養箱中培養。

1.5 Western 印跡 十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）分離蛋白樣品后轉移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF 膜），用含5% 脫脂奶粉的TBST 室溫封閉1 h，加入一抗于4 ℃孵育過夜。用辣根過氧化物酶（HRP）耦聯的二抗將樣品室溫孵育1 h后曝光，顯影，利用Image J 進一步分析蛋白表達量。

1.6 實時熒光定量PCR（qPCR） 細胞在TRIzol 中重新懸浮和裂解，收集細胞總RNA 測定濃度后使用逆轉錄試劑盒反轉錄得到互補DNA（cDNA），加入Fast Start Universal SYBR Green Master 和目標基因引物，按照95℃預變性10 min，95℃15 s，53℃60 s，40 次循環的反應條件進行檢測。反應結束后根據△△Ct 法分析基因的相對表達量。所用引物序列見表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

1.7 有參轉錄組測序（RNA－Seq） 細胞長至90%左右密度，在培養瓶中加入1 mL Trizol，收集混合物至EP 管中，保存在－80℃備用；每組細胞準備3個重復樣，由聯川生物進行RNA 測序和初步分析。

1.8 細胞免疫熒光（IF） 細胞接種于滅菌細胞爬片上，4%多聚甲醛固定，0．5%Triton X－100 室溫透膜，1%BSA 溶液封閉，加入一抗后于4℃孵育過夜。復溫，滴加熒光二抗室溫避光孵育1 h，DAPI 孵育5 min 進行核染色，封片后，盡快于熒光顯微鏡下進行圖像觀察及采集。

1.9 酶聯免疫吸附試驗（ELISA） 收集48 h 細胞培養上清液，1 000×g 離心20 min 后收集上清，嚴格按照ELISA 試劑盒說明書操作，檢測實驗組和對照組細胞上清液中IL4I1、CCL4、CCL5 蛋白濃度。

1.10 外周血單個核細胞（PBMC）的體外培養 經醫院倫理委員會批準、簽署知情同意書后收集健康志愿者外周血，通過Ficoll 密度梯度離心法提取PBMC，細胞計數后按照腫瘤細胞∶PBMC=1∶2 的比例將PBMC 接種于含有貼壁786－O 細胞的6 孔板中，加入含有1 000 IU/mL IL－2 的STM 培養基，于37℃培養48 h 后收集細胞進行流式染色檢測其中Treg 細胞比例。

1.11 流式細胞術（FCM） 收集含有PBMC 的培養液，4℃PBS 洗滌兩遍后，用100 μL PBS 重懸細胞，加入膜蛋白流式抗體，混合均勻后于4℃避光孵育60 min。孵育結束后用預冷PBS 洗滌兩遍，加入IC Fixation Buffer 置于4℃冰箱固定30 min。洗滌后，用1×Permeabilzation Buffer 重懸細胞至100 μL，加入胞內蛋白流式抗體，避光，4℃，60 min。冷PBS 洗滌兩遍，重懸后上機檢測。

1.12 統計學處理 使用GraphPad Prism 9．0 進行統計學分析，以±s 來表示正態分布的計量資料，采用t 檢驗、χ2檢驗或方差分析進行組間比較，利用簡單線性回歸分析兩變量之間的關系，P＜0．05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 IL4I1 在ccRCC 中的表達 在前期研究中，課題組運用UALCAN 數據庫分析發現，不論從mRNA水平還是蛋白水平，ccRCC 中IL4I1 的表達均顯著高于正常腎組織。通過免疫組化進一步驗證，染色結果表明與癌旁組織相比，IL4I1 蛋白在腎細胞癌組織中表達水平升高（圖1A、B）。ccRCC 組織與癌旁組織中IL4I1 表達水平存在顯著差異（χ2=44．56，ν=3，P＜0．001），見表2。

圖1 IL4I1 在癌旁及腎透明細胞癌組織中的表達Fig 1 The expression of IL4I1 in paracancerous tissue and clear cell renal cell carcinoma tissue

表2 腎癌和癌旁組織中IL4I1 表達情況的比較[n（%）]Tab 2 Comparison of IL4I1 expression in renal carcinoma and paracancer tissue[n（%）]

2.2 腎癌中IL4I1 表達與Treg 浸潤水平的關系 通過TIMER2．0 數據庫發現，在ccRCC 中IL4I1 表達與Treg 浸潤及Treg 細胞關鍵指標CD4、IL2RA、FOXP3 都顯著正相關（圖2A）。免疫組化證實相較于IL4I1 低表達的腎癌組織，在IL4I1 表達增加的ccRCC 切片中可以觀察到更多的Treg 細胞浸潤（圖2B），通過簡單線性回歸分析發現，IL4I1 表達水平與浸潤Treg 細胞數量呈正相關（r2=0．264 8，F=13．69，P＜0．001）（圖2C）。

圖2 IL4I1 表達與腎癌內Treg 浸潤的關系Fig 2 Relationship between IL4I1 expression and Treg infiltration in renal carcinoma

2.3 敲低表達IL4I1 細胞系的構建與轉錄組測序的富集分析 前期實驗結果表明，相較于腎皮質近曲小管上皮細胞系HK－2，ccRCC 細胞系786－O 的IL4I1 表達水平增加[7]。Western 印跡、qPCR 結果顯示，轉染慢病毒敲低IL4I1 表達后，786－O－sh 組細胞IL4I1 的表達在蛋白水平和mRNA 水平上均比786－O－ctrl 組顯著降低（t=17．20，P＜0．001）（圖3A、B）。細胞免疫熒光的觀察結果也顯示，與對照組相比，IL4I1 的表達在實驗組786－O 細胞中顯著減少（圖3C）。利用聯川生物平臺云工具對RNA－seq 數據進行GSEA 富集分析，結果顯示，實驗組（786－Osh）和對照組（786－O－ctrl）的差異轉錄譜在與細胞因子和趨化因子產生及其負性調節相關的基因本體論生物學過程（GOBP）顯著富集（P．adjust=9．2×10－4、7．5×10－4、7．7×10－4、2．67×10－2）（圖3D、E）。

圖3 穩定敲低IL4I1 細胞系的構建及差異轉錄譜的富集分析Fig 3 Verification of a stable IL4I1 knockdown cell line model and enrichment analysis of transcript differential expression

2.4 IL4I1 表達與Treg 細胞募集的關系 TIMER2．0數據庫分析發現，多個與Treg 募集相關的趨化因子CC 亞家族成員與IL4I1 表達呈正相關（圖4A）。通過qPCR 檢測mRNA 水平上相關趨化因子的變化，觀察到敲低IL4I1 表達的腎癌細胞中CCL3、CCL4、CCL5、CCL8、CCL17、CCL19 的表達水平顯著下調（t=6．250、7．716、20．640、5．324、6．360、3．484，均P＜0．05）（圖4B）。相同條件下培養48 h，786－O－sh 組細胞上清中CCL4、CCL5 的濃度明顯低于786－O－ctrl 組（t=6．773、13．64，均P＜0．05）（圖4C）。

圖4 IL4I1 表達與Treg 募集的關系Fig 4 Relationship between IL4I1 expression and Treg recruitment

2.5 腎癌分泌的IL4I1 對于Treg 的誘導 ELISA結果表明，培養48 h 后，實驗組細胞培養上清中IL4I1 濃度低于對照組（t=18．11，P＜0．01）（圖5A）。沉默IL4I1 基因表達后，將對照組和實驗組細胞分別與PBMC 按1∶2 的比例共培養，與對照組相比，實驗組PBMC 中Treg 細胞的比例減少（t=3．843，P＜0．05）（圖5B～5D）。

圖5 腎癌來源IL4I1 對Treg 的體外誘導Fig 5 In vitro experiment of Treg differentiation induced by IL4I1 derived from renal cancer

3 討論

腎細胞癌是最常見的泌尿系統腫瘤之一，對傳統的細胞毒性化學治療不敏感。ccRCC 是最常見的腎癌亞型，與非透明細胞腎細胞癌和其他腫瘤類型相比，它是一種高度免疫炎癥性腫瘤。豐富的腫瘤浸潤淋巴細胞和腫瘤細胞、細胞外基質、分泌的細胞因子等共同構成了與腎癌發生、發展和轉移相關的腫瘤免疫微環境。其中，包括Treg 在內的多種免疫細胞直接影響著腎癌免疫治療療效和轉歸。免疫細胞的募集浸潤、表型功能受多種因素的調控，如趨化因子、細胞因子等。

作為一種分泌蛋白，IL4I1 可以被免疫細胞或腫瘤細胞合成并釋放到腫瘤微環境中，協助免疫抑制性微環境的形成、促進腫瘤進展。在課題組已發表的論文中，筆者通過劃痕實驗、CFSE 增殖實驗證明了IL4I1 高表達對腎癌腫瘤細胞遷移和增殖的促進作用[7]。既往研究證實，IL4I1 可以抑制T 細胞受體（TCR）信號轉導，調節幼稚T 細胞分化，限制效應T 細胞增殖，增加T 細胞活化的閾值，參與塑造免疫抑制性腫瘤微環境并削弱抗細胞毒性T 細胞反應，促進腫瘤的免疫逃逸[2，9]。通過γδT 細胞非依賴性的方式，IL4I1 促進髓源性抑制細胞和腫瘤相關巨噬細胞在腫瘤部位的募集。Yue 等[3]研究顯示，IL4I1 可以誘導包括Fizzl、Arg1、MR、YM-1 在內的巨噬細胞標志物的表達，通過抑制M1 型巨噬細胞相關細胞標志物的表達、促進巨噬細胞向M2 型分化，抑制免疫殺傷功能，從而促進癌癥的進展[3]。還有研究表明，IL4I1 具備促進T 細胞分化為CD25highFoxp3+CD4+T 細胞（Treg）的能力，黑色素瘤中IL4I1陽性細胞的浸潤與Treg 的存在正相關，與腫瘤患者的總生存期呈負相關[10-11]。

課題組運用UALCAN 數據庫發現，與正常組織相比，IL4I1 在ccRCC 中的表達升高[7]。TIMER2.0 數據庫的分析結果表明，ccRCC 中IL4I1 的表達不僅與腫瘤內Treg 的浸潤成正比，也與Treg 的細胞標志物CD4、CD25（IL2RA）、FOXP3 表達正相關。通過免疫組織化學法，筆者驗證了IL4I1 在腎癌腫瘤組織中存在高表達；對腫瘤組織連續切片進行IL4I1及Treg 關鍵分子（CD4 和FOXP3）免疫組化顯色，發現在表達IL4I1 的ccRCC 組織中浸潤Treg 細胞數量明顯多于不表達IL4I1 的ccRCC 組織，即ccRCC 腫瘤組織中IL4I1 的表達與浸潤Treg 細胞數量呈正相關，提示IL4I1 可能參與了腎癌中Treg 細胞的募集和表型調控。

IL4I1 是通過何種機制參與了Treg 的募集，值得進一步探究。既往研究表明，可溶性細胞因子、趨化因子可以調控ccRCC 中免疫細胞的募集，在塑造ccRCC 腫瘤微環境和調控免疫細胞浸潤中發揮重要作用。血管內皮生長因子A（VEGF-A）表達的增加與ccRCC 中免疫細胞浸潤減少相關[12-13]。白細胞介素-8 的增加則有助于形成以中性粒細胞、單核細胞浸潤增加，T 細胞浸潤和干擾素-γ 減少為特征的免疫抑制性腫瘤微環境[14-16]。Treg 的募集也受細胞因子和趨化因子的調控。在成功構建IL4I1 穩定敲低的786-O 細胞模型后，由聯川生物對實驗組786-O-sh 細胞和對照組786-O-ctrl 細胞進行RNA 測序。GSEA 發現兩組細胞轉錄本表達譜的差異主要富集在細胞因子產生和趨化因子的產生上，并且與對照組相比，IL4I1 敲低組細胞在細胞因子和趨化因子產生負調節相關的生物學過程轉錄本中富集。利用在線數據庫，筆者分析了ccRCC 中與腫瘤內Treg 浸潤相關的趨化因子CC 亞家族成員和IL4I1表達之間的關系。qPCR 結果表明，與786-O-ctrl 組相比，在786-O-sh 組（即IL4I1 敲低表達組）中，CCL3、CCL4、CCL5、CCL8、CCL17、CCL19 的mRNA表達水平顯著降低；通過ELISA 進一步證實，786-O-sh 組細胞培養上清中CCL4 和CCL5 濃度明顯降低，兩項結果均提示IL4I1 高表達的腎癌中Treg 募集相關的趨化因子表達增高可能導致了Treg 浸潤的增加。

研究發現，IL4I1 具備促進T 細胞分化為CD25highFOXP3+CD4+T 細胞（Treg）的能力。由此推測腎癌微環境中增加的Treg 也可能是由腫瘤內浸潤CD4+T 細胞誘導分化而來。為了探究分泌性蛋白IL4I1 能否將CD4+T 細胞向Treg 誘導，筆者將實驗組和對照組細胞分別與PBMC 共培養，結果顯示，與786-O-sh 組細胞共培養的PBMC 中Treg 比例明顯低于786-O-ctrl 組，提示IL4I1 在CD4+T 細胞向Treg 細胞的分化中起一定的作用。

課題組在之前的研究已經證實IL4I1 可以增強ccRCC 的增殖和遷移能力。本研究發現，IL4I1 除了可以增強腫瘤細胞的惡性表型外，還可以促進Treg分化、通過影響腫瘤微環境中趨化因子的表達調控Treg 浸潤，從而影響ccRCC 的進展，進一步提示IL4I1是一個潛在的ccRCC 治療靶點，為腎癌的治療方案提供了新思路。