關節鏡聯合脛骨高位截骨術促進膝關節內側間室骨性關節炎軟骨再生的機制研究

吳疆，趙斌，陳嘯，趙謙，駱巍，任富繼，黃競敏

（天津市天津醫院運動損傷與關節鏡二病區，天津 300211）

隨著中國老齡化進程的加劇，膝骨關節炎正成為中老年人群中常見的退行性疾病之一，給患者造成了嚴重的身心痛苦并加重了社會負擔[1]。膝骨關節炎通常會導致關節軟骨的磨損，因此對膝關節功能造成嚴重損傷[2]。膝蓋部位的關節炎通常只累及一側，累及側往往由于長期受到較大負荷，導致關節對合不良[3]。在股骨和脛骨內側部位，關節對合不良和縱向軟骨丟失均具有明顯的關聯[4]。

目前，國際上廣泛采用脛骨高位截骨術（HTO）治療膝骨關節炎合并膝內翻，并取得了較好的臨床療效。截骨術能夠有效降低內側間室壓力以及疼痛，并且能夠延緩骨關節炎的進一步發展及需要進行全膝關節置換術的時間[5-6]。HTO 可以通過修正脛骨，降低患者膝蓋內關節軟骨的受力程度，改變患者下肢的負重軸線，從而減輕受累側的負荷[7]。Jung等[8]發現，在經開放楔形脛骨高位截骨術糾正膝內翻之后，即使不采取軟骨再生手段，經過兩年左右時間，股骨內髁和脛骨內側平臺中退化的軟骨仍能夠部分覆蓋有新生軟骨。

研究表明，關節鏡聯合HTO 能夠促進骨關節炎患者的軟骨再生[9-10]，然而介導此現象的生物學機制仍不清楚。細胞外信號調節激酶（ERK）信號通路與關節軟骨細胞的增殖、分化、遷移、凋亡及應激反應等生理過程密切相關，參與骨關節炎發病的整個過程[11-13]。因此，深入研究ERK 信號通路在關節鏡聯合HTO 治療骨關節炎疾病中的作用機制具有重大意義。本研究對內側間室骨性關節炎患者進行關節鏡聯合HTO 手術治療，術后1 年，在對上述患者取內固定的同時再次進行關節鏡檢查，觀察術后1 年膝關節內側間室軟骨再生情況；同時取部分新生軟骨進行組織病理學檢測及分子生物學檢測，研究成果有望為骨關節炎臨床治療提供新的思路和方法。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究共納入天津市天津醫院關節鏡科2020 年8 月—2021 年8 月50 例患者。其中男11 例，女39 例。患者平均年齡為（56.0±3.4）歲（54～63 歲），平均體重指數（23.4±3.8）kg/m2（19.6～33.0 kg/m2）。其中包含9 例左膝骨性關節炎以及11例右膝骨性關節炎。所有患者均為膝關節骨性關節炎合并膝內翻，且分級低于Ahlback Ⅱ級，術前膝內翻角平均為192.6°±3.8°（189°～198°）。所有患者均無明顯關節不穩，可以進行正常程度的運動。對患者進行關節鏡清創聯合HTO。術前規劃、手術方案以及術后康復訓練按照已發表的文獻實施[14-16]。患者術后傷口恢復均良好，且1 年內無感染、骨愈合不良、或指甲板斷裂等并發癥出現。所有患者在進行鋼板或螺絲移除時接受二次關節鏡檢查。納入患者均知情同意且該研究通過天津市天津醫院倫理審查，倫理編號：2020 醫倫理085。

納入標準：（1）膝關節疼痛，活動受限，但日常生活均能獨立完成。（2）參加本項研究前2 周未曾服用過消炎鎮痛藥物。（3）無明顯外傷史。（4）影像資料顯示單純膝關節內側間室骨性關節炎。排除標準：（1）1 年內接受過正規的臨床治療。（2）1 年內有過膝關節手術史。（3）半年內進行過關節內注射治療。（4）存在全身其他關節疾病。（5）存在神經系統疾病（癲癇等）。（6）存在前庭器官疾病和嚴重的其他系統疾病。

1.2 方法

1.2.1 關節鏡評估 術前對脛骨內側平臺和股骨髁關節軟骨進行關節鏡觀察，術后1 年進行再次觀察。采取國際軟骨修復協會軟骨損傷分級系統（ICRS）對軟骨再生進行評分[17]。標準如下：1 級為可見表面細紋或裂縫，或淺表病變；2 級為病變不超過軟骨厚度的50%；3 級為病變超過軟骨厚度的50%，但是不累及軟骨下骨；4 級為病變累及軟骨下骨。

患者在移除鋼板或螺絲時進行二次關節鏡檢查，對脛骨內側平臺和股骨髁關節進行再生評分[18-19]。標準如下：1 級為無再生；2 級為具有白色分散的纖維軟骨，或者纖維軟骨的局部或均勻覆蓋。

1.2.2 病理學檢測 在患者進行二次關節鏡檢查時，采集新生骨組織進行病理學分析。用于病理分析的樣本，將組織進行固定、脫水并用石蠟包埋后，進行HE、甲苯胺藍、番紅O 固綠染色。此外，對樣本進行Ⅱ型膠原的免疫組化染色以確認新生組織為軟骨樣組織。

1.2.3 qRT-PCR 采用正常軟骨作為對照組（A）；術后新生組織作為實驗組（B）。采用Trizol 法提取所獲得的軟骨樣組織總RNA，使用ReverTra Ace qPCR 逆轉錄試劑盒，根據說明書將RNA 逆轉錄為cDNA。待檢測靶分子引物序列如下：β-actin：F5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′，R5′-GGCGGCAC CACCATGTACCCT-3′；Collagen Ⅱ：F5′-GCCTGGT GTTCATGGGTTT-3′，R5′-GTCCCTTCTCACCAGGT TTG-3′。根據SYBR?GreenRealtime PCR Master Mix說明書進行qRT-PCR，具體條件：95℃預變性2 min，然后95℃30 s，55℃30 s（記錄熒光信號），共40 個循環。β-actin 作為內參，根據公式2-ΔΔCt進行半定量計算[20-21]。

1.2.4 Western 印跡 分析采用正常軟骨作為對照組（A）；新生組織作為實驗組（B）。對所獲取的軟骨組織，采用RIPA 裂解法提取總蛋白，并用BCA 法測定蛋白含量。之后取10 μg 蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（10% SDS-PAGE），轉膜至0.45 μm 的PVDF 膜，經5%脫脂牛奶封閉后，與β-actin（1∶5 000）、collagenⅡ（1∶2 000）、絲裂原活化蛋白激酶激酶（MEK，1∶1 000）、磷酸化絲裂原活化蛋白激酶激酶（p-MEK，1∶1 000）、細胞外調節蛋白激酶（ERK，1∶2 000）或磷酸化細胞外調節蛋白激酶（p-ERK，1∶1 000）一抗4 ℃孵育過夜。次日與相應的HRP 耦聯二抗（1∶3 000）孵育，之后利用ECL 化學發光法進行成像分析，采用Image J 軟件進行灰度分析[22]。

2 結果

2.1 關節鏡評估 新生軟骨情況在接受首次關節鏡檢查時，根據ICRS 分級系統，10 例患者（10%）的脛骨內側平臺或股骨髁關節軟骨具有3 級病變，37例患者（74%）具有2 級病變，3 例患者（6%）具有1 級病變。在二次關節鏡檢查時，2 例患者（4%）為3級病變，26 例患者（52%）為2 級病變，22 例患者（44%）為1 級病變。依據再生評分，在二次關節鏡檢查時，有47 例患者（94%）能夠觀察到新生軟骨（2 級），僅有3 例患者（6%）未觀察到新生軟骨（1級）（圖1）。

圖1 關節鏡檢測Fig 1 Arthroscopic examination

2.2 病理學及分子生物學評估 新生軟骨組織HE和甲苯胺藍染色結果表明，新生組織周圍具有關節軟骨的結合或覆蓋，并可見明顯的纖維化軟骨或軟骨陷窩（圖2A、2B）。番紅O 固綠染色結果顯示，新生組織內可見呈紅色的軟骨組織及軟骨陷窩，亦可見呈綠色的骨組織（圖2D）。免疫組化結果顯示，Ⅱ型膠原呈陽性表達（圖2C）。

圖2 HTO 術后新生組織的病理學染色分析Fig 2 Pathological staining of regenerated tissues after HTO surgery

2.3 新生組織與正常軟骨組織CollagenⅡmRNA 表達差異 采用qRT-PCR 檢測新生組織（b）與正常軟骨組織（a）內CollagenⅡmRNA 的表達情況，結果顯示（圖3A）：新生組織內CollagenⅡ的相對表達量與正常軟骨組織間差異無統計學意義（t=0.00，P＞0.05）。

圖3 再生組織與正常軟骨組織ERK 信號通路變化分析Fig 3 Changes of ERK signaling pathway in regenerated tissues and normal cartilage tissues

2.4 新生組織與正常軟骨組織CollagenⅡ和MEKERK 信號通路表達差異 Western 印跡結果顯示，新生組織（b）與對照組（a）CollagenⅡ表達無明顯統計學差異（t=0.00，P＞0.05，圖3B、3C）。同時，新生組織（b）內p-ERK 和p-MEK 蛋白呈高表達（圖3B），兩組間表達差異具有明顯統計學意義（t=12.8、15.44，均P＜0.05，圖3D）。

3 討論

軟骨退變是骨性膝關節炎的常見癥狀。根據軟骨的組織學特點，軟骨退變通常被認為是不可逆過程。然而，臨床研究發現，骨性膝關節炎患者的骨贅面軟骨能夠分泌Ⅱ型膠原，這些軟骨被稱作纖維化軟骨[17]。作為關節退化的代償性反應，纖維化軟骨可以從關節軟骨遷移至外周骨，使得退化的軟骨表面得以穩定和恢復，使一些骨性膝關節炎患者的癥狀逐漸減輕甚至消失[23]。在經截骨術改善患者關節的負重力線后，關節軟骨的退行性病變亦可以逐漸減緩或者消失[24]。這些現象說明，退變軟骨具有自我修復的潛能。

關節軟骨所處的解剖學部位具有十分復雜的生理學和力學微環境，機械刺激對于維持關節軟骨正常的結構和功能具有非常重要的意義[25]。Xu 等[26]通過給予大鼠終板軟骨細胞間歇周期性機械拉伸發現（0.5 Hz，10%強度，4 h/d，5 d/周），拉伸刺激促進了終板軟骨細胞的增殖。Fukuda 等[27]給予終板軟骨細胞以不同強度的周期性拉伸，發現低強度的拉伸能促進終板軟骨細胞增殖及糖胺多糖合成，然而高強度的拉伸則抑制了軟骨細胞增殖及糖胺多糖合成。由此可見，在適度的拉伸強度下，終板軟骨細胞的增殖以及合成代謝都得到了增強，有利于軟骨結構和功能的維持。然而當拉伸強度超過一定限度時，軟骨細胞的增殖則受到抑制，導致關節軟骨結構完整性和功能的破壞。在膝關節內側間室骨性關節炎患者中，內側間室面的軟骨受到超負荷的機械拉伸刺激，引起軟骨損傷[26]。HTO 能夠降低下肢軸線異常引起的膝內側間室的負荷，將其轉移至膝蓋外側，從而促進膝內側間室面軟骨再生，緩解膝骨關節炎的癥狀[28]。

本研究采用關節鏡發現，在膝內側間室的軟骨損傷處具有新生組織生成。接著，通過HE 染色、甲苯胺藍染色、Ⅱ型膠原免疫組化確認了這些新生組織為軟骨組織。在分子機制層面，發現HTO 術后內側間室新生組織的Ⅱ型膠原含量與正常軟骨相比，沒有明顯統計學差異，進一步說明HTO 有可能促進缺損部位軟骨的修復與再生。另外，通過Western 印跡發現這些組織中高表達磷酸化形式的ERK。ERK分子屬于絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族，在多種細胞中均具有重要信號轉導作用[11]。

ERK 被磷酸化之后進入細胞核，啟動一系列下游基因的轉錄，從而影響細胞的增殖和分化過程[29]。Shakibaei 等[30]發現，姜黃素和白藜蘆醇可以誘導軟骨細胞中ERK 的活化，促進軟骨細胞的生存以及增殖，并且抑制了白細胞介素（IL）-1β 誘導的細胞凋亡。相反，ERK 抑制劑則能夠抑制軟骨細胞增殖。目前尚不清楚ERK 信號是否參與調控接受關節鏡聯合HTO 的膝骨關節炎患者術后的軟骨再生。本研究發現，絕大多數患者在術后1 年左右均出現損傷處的軟骨再生，新生組織呈Ⅱ型膠原和磷酸化ERK 高表達。綜上得出結論：在膝關節內側間室骨性關節炎患者中，關節鏡聯合HTO 能夠引起膝關節軟骨細胞中ERK 信號通路的活化和細胞增殖，從而促進軟骨再生。