VAVs基因家族在肝癌中的表達及臨床意義

蔡慧欣，項思博，楊文軍

溫州醫科大學附屬第一醫院 肝膽胰外科，浙江 溫州 325000

肝癌是當今世界上最常見的消化道惡性腫瘤之一，根據2020年全球癌癥統計報告，全球肝癌新發病例超90萬例，死亡病例超80萬例，分別占所有癌癥新發病例和死亡病例的4.7%和8.3%[1]，是人類死于癌癥的第三大常見原因。早期肝癌通常采用根治性治療，包括切除、移植和消融，但由于肝癌的高復發率，5年生存率仍舊較低[2]。并且肝癌的多灶性進展和早期遠處轉移使大多數肝癌患者錯過了外科治療最佳時機，且晚期肝癌治療方案有限。因此，闡明肝癌復發轉移的分子機制，尋找有效的靶點對提高肝癌患者預后生存時間至關重要。

Rho GTP酶作為分子開關，調節各種細胞過程且調節的活動范圍廣泛，因此Rho GTPase信號的異常被認為與許多惡性腫瘤有關。Rho GTP酶循環于GDP和GTP之間，VAVs作為一個特定的GDP/GTP核苷酸交換因子，嚴格受酪氨酸磷酸化的調控。其家族中包括VAV1、VAV2、VAV3基因，分別位于人染色體中的19p13.3、9q34.2、1p13.3[3]。VAV1基因編碼的蛋白主要作用于調整細胞骨架，以及調控T、B淋巴細胞的功能，VAV2基因主要參與多種轉錄過程，VAV3基因編碼的蛋白結合Rho蛋白家族的成員而發揮作用。近些年來，大量的研究證明了VAVs基因在惡性腫瘤發生發展過程中的重要性，也對VAVs基因在腫瘤中的表達模式有了充分的認識，但確切功能和作用機制仍存在許多未知[4-6]。其在肝癌中的表達與功能尚未進行研究。本研究基于腫瘤基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫，分析VAVs家族基因表達對肝癌診斷和預后的價值，以期為肝癌的臨床診斷治療提供新的靶點。

1 資料和方法

1.1 數據庫資料

從TCGA數據庫（http://portal.gdc.cancer.gov）下載關于肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者VAVs RNASeq-HTSeq-Counts測序數據及相關臨床病理和預后資料，合并后共有374 例HCC腫瘤樣本和50 例癌旁組織樣本。剔除臨床或生存資料缺失的腫瘤樣本后最終各基因分別納入342 例HCC腫瘤樣本和50例癌旁組織樣本。按VAVs mRNA表達量的中位值（VAV1 中位值=0.74，VAV2 中位值=13.48525，VAV3中位值=0.32105），分別將按各基因納入的342例HCC患者分為高表達組（n=171）與低表達組（n=171）。

1.2 病例資料

對來自溫州醫科大學附屬第一醫院肝膽胰外科實驗室20個肝癌組織標本和20個癌旁組織樣本進行VAVs mRNA免疫組化染色，觀察VAVs蛋白在HCC患者癌組織和癌旁組織中的表達差異。

1.3 列線圖的構建及驗證

篩選出陽性作用基因VAV2并通過R語言中的RMS包將VAV2的表達水平、性別、年齡、T、N、M、臨床分期及病理分級重新建立預后模型，并可視化為預測未來1、2、3年存活率的列線圖。對照該列線圖，每例HCC患者可以根據自身臨床病理特征獲得相應的評分，再將每位HCC患者各臨床病理特征對應的分數相加，最終得到總的風險評分。我們可以根據最終分數，獲得相應1 年、2 年、3 年的預后風險，為監測HCC的復發或進展提供指導[7]。使用一致性指數（concordance index，C-index）、校準曲線（calibration curve）對生成的列線圖進行測試和評估，以確定其區分度[8-9]和一致性[10]。

1.4 統計學分析

采用R語言R-4.0.3軟件處理數據并進行統計學分析。計量資料不符合正態分布，采用M（P25，P75）表示，組間比較采用Wilcoxon檢驗，計數資料采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制患者生存曲線。HCC患者臨床病理特征和預后的關系采用單因素及多因素Cox回歸分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 VAVs mRNA及蛋白在肝癌及癌旁組織中的表達情況

對TCGA數據庫資料分析顯示，肝癌組織和癌旁組織中VAV1、VAV2、VAV3 mRNA表達量散點圖見圖1，其中VAV2 mRNA表達水平比其癌旁組織高[13.48525（2.5748，55.3636）vs10.31165（6.7191，17.386），Z=4.577，P＜0.0001]。我中心肝癌樣本的免疫組化結果顯示，與癌旁組織相比，VAV2蛋白質在肝癌組織中的表達增加，見圖2。

圖1 TCGA數據庫中VAVs mRNA在肝癌組織與癌旁組織中的表達

圖2 本中心肝癌樣本VAVs蛋白（棕黃色）在肝癌組織和癌旁組織中的表達（免疫組化，×400）

2.2 HCC患者臨床病理特征與VAVs mRNA表達的關系

VAV2、VAV3 mRNA高表達與低表達HCC患者性別、臨床分期有統計學差異（P＜0.05），女性中VAV2 及VAV3 mRNA高表達的比例顯著高于男性，肝癌臨床分期Ⅲ期患者中VAV2 mRNA高表達的比例顯著高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ期。VAVs mRNA高表達與低表達HCC患者在年齡、生存狀態、病理分級、T分期、N分期、M分期差異無統計學意義（P＞0.05），詳見表1。

表1 HCC患者VAV2 mRNA表達與臨床病理特征的關系（例）

VAV2 mRNA在性別、不同肝癌臨床分期、T分期HCC患者肝癌組織的表達量差異有統計學意義（P＜0.05），Ⅲ期中VAV2表達高于Ⅱ、Ⅳ分期[17.27（4.64，51.14）vs13.86（2.57，37.31）vs10.98（6.28，22.73）]（圖3A），女性VAV2 mRNA表達高于男性 [17.40（2.57，55.36）vs14.41（4.57，43.25）]（圖3B），T3 期中VAV2 mRNA表達高于T2 期[15.98（4.64，43.25）vs13.66（2.57，37.31]（圖3C）。

圖3 VAVs mRNA在不同臨床分期（A）、性別（B）、T分期（C）表達量比較

2.3 VAV2 mRNA表達與預后模型

Kaplan-Meier分析顯示，VAV2 mRNA高表達的患者中位生存期明顯短于低表達患者（P=0.014，圖4B）。對HCC患者的年齡、性別、臨床分期、腫瘤分級 及VAVs mRNA表達量對預后的影響進行單因素Cox回歸分析，結果表明，T分期、肝癌臨床分期以及VAV2 mRNA表達量對HCC患者預后存在顯著影響，見表2。進一步多因素回歸分析結果表明，肝癌臨床分期（HR=1.626，95%CI1.083-2.442，P＜0.05）及VAV2 mRNA表達量（HR=1.031，95%CI1.009-1.054，P＜ 0.05）是HCC患者預后的獨立危險因素。VAV2 mRNA表達水平越高提示肝癌不良預后的可能性越大。

表2 HCC患者總生存率的單因素和多因素Cox回歸分析

圖4 TCGA數據集中VAV1（A）、VAV2（B）、VAV3（C）mRNA的Kaplan-Meier生存曲線

2.4 列線圖及驗證結果

根據對HCC患者的年齡、性別、肝癌臨床分期、VAVs mRNA構建列線圖（圖5），該列線圖C指數為0.731，大于0.7，表明該列線圖數據集的區分度較好。1年、2年、3年ROC曲線下面積分別為0.772、0.683、0.650（圖6A），另外從校準曲線圖可見，HCC患者的第1 年總生存率的實際觀測值與預測值具有較好的一致性，圖中灰線表示預測值=實際值，表明該列線圖的準確度良好（圖6B）。

圖5 基于VAV2 mRNA建立肝癌生存預后列線圖

圖6 VAV2 mRNA相關性的HCC患者的ROC曲線（A）和校準曲線（B）

3 討論

原發性肝癌作為我國一種高發并且危害性較大的惡性腫瘤，其發生發展是一個多步驟、多途徑的過程。如果患者在早期診斷為肝癌，通過手術干預如肝部分切除或肝移植可得到有效治療，中位5年生存率約為70%[11-13]。但是術后5年復發率較高，為40%～70%，并且復發后的中位5 年生存率只有20%～35%[14-15]。當前的現狀是，大多數肝癌在晚期確診，而晚期肝癌的治療往往只能是控制病情，患者的生活質量往往較差。

Rho GTP酶途徑參與了廣泛的細胞增殖、細胞存活和凋亡過程，并且在許多組織中調節免疫反應、血管生成和神經發生的細胞特異性。因此，這些通路的改變參與了許多相關的病理過程，包括惡性轉化和癌癥進展[16-17]。Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子（Rho GEF）通過催化GTP與GDP的交換促進Rho GTP酶活性的GTP結合狀態的形成。Rho GTP酶的交換因子有兩類：典型的DBL相關交換因子[18]和非典型的Dock家族交換因子[19]。DBL家族主要構成部分為Pleckstrin同源（PH）結構域以及200個氨基酸組成的DBL同源（DH）結構域。水解域具有GEF催化活性，而PH域參與細胞內對水解域的靶向作用[20]。DH域和PH域負責催化Rho蛋白中的GDP-GTP交換反應。當受到刺激時，許多DBL家族的GEF被蛋白激酶磷酸化以促進其激活，代表性的例子是VAV[21]。

VAVs家族基因是一組由酪氨酸激酶調節的基因，其主要是在細胞調節中以鳥嘌呤核苷酸交換因子（guanosine nucleotic exchange factors，GEFs）發揮作用。VAVs蛋白的生物學活性受磷酸化依賴的構象變化控制。因此，在非刺激細胞中，非磷酸化的VAVs蛋白以一種自身抑制的構象不活躍，但當位于ac、zf和csh3 區域的特定酪氨酸殘基被跨膜或胞質蛋白酪氨酸激酶（Ptk）磷酸化后，這種自抑制結構就會向“開放”和活躍的方向轉變[22]。因此，VAVs蛋白可以表現出各種催化依賴和獨立的生物反應，這對神經、心血管和免疫系統的動態平衡至關重要[23]。這些功能也被稱為“規范活動”，代表了VAV GEFs家族中常見的和公認的特征。

最近，有研究表明，VAVs在人類癌癥中高度表達，并與各種惡性腫瘤包括乳腺癌、胃癌、食管癌的發生、發展和轉移有關。Wang等[24]研究發現，miR-195抑制VAV2在肝癌細胞中的表達，從而抑制HCC的血管生成及轉移。這間接證實了VAV2 在促進肝細胞癌的進展中發揮了作用，但VAV2與肝細胞癌之間存在關聯，其細節仍需要進一步的實驗研究。

本研究探討了VAVs mRNA在肝癌中的表達及意義，發現VAV2 mRNA及蛋白質在肝癌組織中的表達高于癌旁組織。而VAV1 和VAV3 mRNA和蛋白質水平在肝癌及癌旁組織中表達差異無統計學意義。探究HCC患者的臨床病理特征與VAVs mRNA表達之間的關系，發現VAV3 高表達與性別有相關性（P＜0.05），VAV2高表達與性別（P＜0.001）、肝癌臨床分期（P＜0.05）有顯著的相關性，而VAV1表達與患者臨床病理特征無顯著相關性。且臨床分期Ⅲ期比Ⅱ期和Ⅳ期、女性比男性、T3分期比T2分期，VAV2 的表達升高，這對肝癌有一定的診斷價值。VAV2 mRNA高表達的肝癌患者總生存率低于VAV2 mRNA低表達肝癌患者，VAV2 mRNA高表達與肝癌患者預后不良有關，而VAV1 mRNA和VAV3 mRNA高、低表達組總體生存率差異無統計學意義。肝癌臨床分期以及VAV2 mRNA的表達量是肝癌患者預后的獨立危險因素，在此基礎上構建的肝癌預后預測模型的C指數為0.731，1 年、2 年、3 年ROC曲線下面積分別為0.772、0.683、0.650，區分度較好且具有較好的一致性，具有一定的臨床使用價值。因此VAVs家族中VAV2可作為生物標志物來識別高危的HCC患者，并可能成為HCC一個新的治療靶點和預后監測指標。