天花粉蛋白對宮頸癌HeLa細胞順鉑化療增敏作用*

譚順梓,向珺昱,夏玉樺,尤程程,黃利鳴,黃益玲

(1.三峽大學醫學院腫瘤微環境與免疫治療湖北省重點實驗室,宜昌 443002;2.三峽大學臨床醫學系,宜昌 443002;3.湖北省恩施市中心醫院婦科,恩施 445000)

宮頸癌是婦科常見惡性腫瘤,發病率及病死率均居女性生殖系統惡性腫瘤第三位[1-2]。以順鉑為基礎的同步放化療 (concurrent chemoradiotherapy,CCRT)是目前治療晚期宮頸癌的標準方法,但相關臨床研究顯示,30%～40%患者達不到預期效果[3],化學治療(化療)藥物對非癌細胞的不良副作用和耐藥的產生成為常規化療的主要阻礙[4]。為解決這一問題,目前相對較新且有效的治療方法是聯合化療。植物提取物因對機體正常細胞毒性低、副作用小等優勢,成為研究聯合用藥化療增敏劑的主要對象[5]。在順鉑增敏的聯合用藥研究中,SAHIN等[6]發現,從豆科植物提取的植物蛋白金雀異黃素可通過抑制核因子κB(NF-κB)和Akt/mTOR信號通路促進腫瘤細胞凋亡,從而增強順鉑對宮頸癌細胞的殺傷效應;WANG等[7]發現,木犀草素(一種類黃酮類物質)能通過誘導細胞凋亡并抑制腫瘤細胞遷移增敏順鉑治療卵巢癌作用。天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)從栝蔞(葫蘆科植物)的塊根中提取而來,屬于Ⅰ型單鏈核糖體失活蛋白(ribosome-inactivating proteins,RIPs)[8]。近年來研究發現,TCS對宮頸癌、淋巴瘤、腦膠質瘤等多種腫瘤細胞生長具有抑制作用[9-11]。TCS與順鉑聯合用藥的研究報道筆者較少見到,本研究觀察TCS對順鉑治療宮頸癌HeLa細胞的增敏作用,并初步探討其機制,以期為臨床聯合用藥治療宮頸癌提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1實驗儀器 細胞孵育箱(美國Thermo Fisher有限公司,型號:Heracell VIOS 160i);全波長酶標儀[賽默飛世爾科技有限責任公司(中國),型號:Powerpac200型];光學顯微鏡(日本尼康株式會社,型號:T-DH);全自動倒置熒光顯微鏡(寧波舜宇儀器有限公司,型號:IRX60);高速冷凍離心機(美國貝克曼庫爾特股份有限公司,型號:Microfuge 20R);流式細胞儀(常州必達科生物科技有限公司,型號:EFXLOW-206);轉膜儀(北京剴元信瑞儀器有限公司,型號:MP-8005);顯影儀(上海勤翔科學儀器有限公司,型號:ChemiScope mini);pH計(上海精密儀器儀表公司,型號:PHS-3C)。

1.2細胞與試劑 宮頸癌HeLa細胞株(原始細胞購于武漢大學典藏中心,由湖北省腫瘤微環境與免疫治療重點實驗室保存與培養,批號:GDC0009),TCS(四川大學華西醫學院,自行提取),順鉑(美國Sigma公司,批號:PHR1624),改良杜氏伊格爾培養基(Dulbecco's modified eagle medium,DMEM)培養基干粉(美國Gibco公司,批號:812451),1640液體培養基(美國Gibco公司,批號:8121314),胰蛋白酶(美國Gibco公司,批號:BL512A),胎牛血清[FBS,武漢普諾賽(Procell)生命科技有限公司,批號:164210];細胞計數檢測試劑盒(cell counting kit-8,CCK8,日本同仁生物科技公司,批號:CK04);Cocktail蛋白酶抑制劑(購自美國Sigma公司,批號:B14001),二甲亞砜(DMSO,美國Sigma公司,批號:D2650),凋亡試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司,批號:KGA105),BCA蛋白濃度測定試劑盒(武漢科瑞生物技術有限公司,批號:2019120306),蛋白Mark(美國Thermo Fisher公司,批號:26616)),Trizol裂解液(美國Invitrogen公司,批號:15596026),羊抗鼠、羊抗兔二抗(武漢科瑞科技業有限公司,批號分別為GB23204、GB23301),增強型化學發光試劑(enhanced chemiluminescence,ECL)顯影液(北京普利萊基因生物技術有限公司,批號:GB23204、GB23301),細胞裂解液(radio-immunoprecipitation assay,RIPA)(北京普利萊基因技術有限公司,批號:C1053-100);一抗:β-actin(美國Cell Signaling Technology公司,批號:4970),促凋亡蛋白(Bax,美國Proteintech公司,批號:02701),抗凋亡蛋白(Bcl-2)、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[the poly(adp-ribose)polymerases,PARP](成都正能生物技術有限公司,批號分別為381702,381835)。

1.3實驗方法

1.3.1細胞的培養及實驗分組 將含HeLa細胞的懸液用DMEM完全培養基(含10%FBS的DMEM培養基)均勻培養于無菌細胞培養皿,培養皿置37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培養箱培養,3～5 h內不動,待細胞貼壁。將對數生長期HeLa細胞分為4組:對照組不做處理;TCS組加入0.7 μg·mL-1TCS,順鉑組加入2 μg·mL-1順鉑,TCS+順鉑組加入0.7 μg·mL-1TCS及2 μg·mL-1順鉑,誘導48 h后用于后續實驗。

1.3.2CCK-8法檢測細胞活力 收集對數生長期細胞,調整細胞密度至2.5萬個·mL-1,96孔板每孔加入細胞懸液200 μL,置細胞培養箱過夜。第2天按“1.3.1”項分組,換液加藥處理,TCS組與順鉑組均設濃度梯度7個,TCS組:TCS 0,0.1,0.2,0.4,0.8,1.6,3.2 μg·mL-1,順鉑組:順鉑 0,0.5,1.0,2.0,4.0,8.0,16.0 μg·mL-1,TCS+順鉑組TCS+順鉑(0.1+0.5)、(0.2+1.0)、(0.4+2.0)、(0.8+4.0)、(1.6+8.0)、(3.2+16.0) μg·mL-1。每個濃度設復孔5個,重復實驗3次,檢測時間均為48 h。各組細胞培養達到48 h,吸棄細胞培養基,以基礎培養基將CCK8原液稀釋成10%CCK8工作液。每孔加入CCK8工作液100 mL,再置細胞培養箱避光。孵育30 min,取出96孔板,全波長酶聯免疫檢測儀檢測波長460 nm處各孔吸光度(A)值。藥物對細胞生長抑制率計算公式:藥物對細胞生長抑制率(%)=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.3.3人工劃痕實驗 收集對數生長期狀態良好細胞,計數,按每孔20萬個細胞接種于6孔板,完全培養基培養過夜。倒置顯微鏡觀察,細胞生長融合度達70%時劃痕。200 μL槍頭順直尺垂直劃線,PBS輕輕吹洗細胞2次,去除劃下細胞,按照實驗分組加入提前準備好的含藥低濃度培養基6 mL(含2%FBS培養基),并設對照組(貼壁細胞與2%FBS低濃度培養基)。立即在光學顯微鏡下攝影留存,再置細胞培養箱培育,分別于培育24,48 h后立即采集攝影。

1.3.4Transwell遷移實驗 按實驗分組處理細胞48 h,分組收集活細胞,調整細胞密度至20萬個·mL-1。分別取細胞懸液200 μL,置Transwell上室(室內無基質膠),24孔板內擇4孔作為下室,各加入含20%FBS的培養基800 μL,將上室與下室重合后放回細胞培養箱繼續培養。24 h后取出24孔板內上室,棉簽輕輕將上室濾膜上層細胞抹去,甲醇固定30 min。固定后的上室以PBS輕輕清洗3次,再置于0.1%結晶紫染色溶液染色30 min。光學顯微鏡下放大200倍,觀察記錄已穿過的細胞數量,取圖保存。

1.3.5流式細胞術檢測細胞凋亡 取對數生長期細胞,以每孔2×105個接種于6孔板,待細胞貼壁后,分組加入含不同濃度藥物的培養基至6 mL,48 h后冷PBS洗滌,分組收集細胞沉淀。將收集的細胞按照凋亡試劑盒說明書染色處理,3個加藥組EP管內加入Binding buffer工作液懸浮細胞300 μL,空白對照組加入Binding buffer工作液懸浮細胞1.2 mL,均勻分成4份,分裝入4個新EP管,分別行不加任何染料、FITC-Annexin V單染、PI單染、FITC-Annexin V+PI雙染處理,作為4個對照組。加藥組細胞懸液避光加入Annexin V-FITC染色液5 μL,輕輕混勻后避光孵育5 min。隨后每管樣品避光加PI染色液2 μL,輕輕混勻,繼續避光孵育。30 min內流式細胞儀檢測凋亡指標,分析圖像。

1.3.6Western blotting實驗 按實驗分組收集已用藥物處理48 h的細胞,在冰上用蛋白裂解液充分裂解細胞30 min,4 ℃高速離心,取上清液,收集蛋白樣品。按BCA試劑盒說明書配比蛋白樣品,置酶標儀,在波長562 nm處測定蛋白樣A值,根據標準曲線(標準曲線:Y=937.7X-20.855)計算蛋白濃度。根據蛋白定量和所測得的蛋白濃度計算所需蛋白上樣體積。將蛋白樣與上樣緩沖液按體積比4：1加入上樣緩沖液,沸水浴煮沸10 min后進行十二烷基磺酸鈉(sodium dodeoyl sulfate,SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳。濃縮膠電壓60 V,分離膠電壓80 V。濕轉蛋白至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜。TBST配制8%脫脂牛奶,膜封閉1 h,換用一抗,將膜置4 ℃冰箱搖床孵育過夜(不超過16 h)。第2天常溫下用TBST洗滌膜3次,每次10 min。二抗室溫搖床孵育1 h,再次洗膜3次,每次10 min。ECL化學發光顯色,X膠片曝光、顯影、定影,以β-Actin為內參。Image J圖像分析軟件分析目的蛋白和內參蛋白條帶灰度值,行統計學分析對比。

2 結果

2.1TCS與順鉑對HeLa細胞增殖的抑制效果 實驗結果顯示,不同濃度TCS、順鉑,以及兩藥聯合對HeLa細胞增殖均有抑制作用,且具有濃度依賴性。與同濃度順鉑組比較,TCS+順鉑組HeLa細胞抑制率顯著更高(P<0.05),見表1。提示TCS對順鉑有很好化療增敏作用。

2.2CI曲線 根據CCK-8實驗計算TCS組、順鉑組及TCS+順鉑組細胞增殖抑制率,利用CompuSyn軟件計算CI值,繪制CI值曲線(圖1)。根據藥物聯用選擇原則(CI>1拮抗,CI=1疊加,0.6

2.3劃痕實驗與Transwell實驗結果

2.3.1劃痕實驗結果 見圖2。對照組細胞劃痕48 h后基本愈合;與對照組比較,TCS組、順鉑組與TCS+順鉑組愈合速度減慢;與順鉑組比較,TCS+順鉑組遷移能力明顯停滯,幾乎無遷移能力。

2.3.2Transwell實驗結果 結果見圖3。光學顯微鏡下可見,穿過Transwell小室的HeLa細胞數,對照組>順鉑組>TCS組>TCS+順鉑組,提示TCS+順鉑組對HeLa細胞遷移的抑制能力較其他3組強。

2.4HeLa細胞凋亡情況 見圖4。與TCS組及順鉑組比較,TCS+順鉑組HeLa細胞凋亡比例明顯更高。

2.5Western blotting結果 結果見圖5。與對照組比較,其他3組凋亡底物蛋白PARP被降解產物c-PARP水平明顯上調,促凋亡蛋白Bax表達水平升高,抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達水平下降。可見,TCS+順鉑較順鉑促HeLa細胞凋亡作用更強。

表1 4組HeLa細胞生長抑制率測定結果

圖1 劑量效應曲線(A)與CI曲線圖(B)

3 討論

筆者在本實驗觀察TCS聯合順鉑抑制宮頸癌HeLa細胞增殖、遷移及誘導凋亡等的協同作用,結果顯示,TCS與順鉑均對宮頸癌HeLa細胞增殖具有抑制作用,兩藥聯合對HeLa細胞抑制作用更明顯,且具有劑量依賴性。順鉑對HeLa細胞IC50為(3.90±0.82)μg·mL-1,與TCS聯合用藥后,IC50降至(1.28±0.36)μg·mL-1,提示TCS聯合順鉑抗癌有協同效應,可降低順鉑劑量,減少不良反應,這對于臨床用藥有指導意義。腫瘤遷移是影響患者預后的重要因素,本研究中,筆者通過光學顯微鏡觀察發現,順鉑抵抗腫瘤細胞作用較弱,但與TCS聯用后能顯著降低HeLa細胞遷移能力。這可能是TCS蛋白對宮頸癌HeLa細胞順鉑化療增敏的關鍵機制之一[12-15]。

①與對照組比較,t=-1 004.47～-345.01,P<0.01;②與TCS+順鉑組比較,t=-85.82～-5.43,P<0.05。

①與對照組比較,t=-18.61,P<0.01;②與TCS+順鉑組比較,t=-6.56,P<0.05;③與對照組比較,t=-4.77,P<0.05;④與TCS+順鉑組比較,t=-31.08,P<0.01。

①與TCS+順鉑組比較,t=-2.12,P<0.05;②與TCS+順鉑組比較,t=-12.77,P<0.01。

順鉑是宮頸癌一線化療藥物,誘導細胞凋亡是其抗腫瘤重要機制之一[16-17]。本研究從細胞凋亡角度探討TCS化療增敏作用的可能機制,發現TCS與順鉑聯用可增加HeLa細胞凋亡比例。Bcl-2蛋白家族是內源性凋亡途徑關鍵蛋白,對于線粒體中細胞色素C的釋放,并激活下游Caspase蛋白凋亡級聯反應至關重要[18]。Bcl-2家族包含3個功能和結構不同的亞家族:抗凋亡蛋白,包括Bcl-2,Bcl-xL,Mcl-1,Bcl-w,Bag-1和A1;促凋亡效應蛋白Bax和Bak;促凋亡蛋白BH3[19]。筆者在本實驗發現,TCS對順鉑化療增敏的作用機制與增加凋亡底物蛋白PARP的切割活化、升高促凋亡蛋白Bax表達、降低凋亡抑制蛋白Bcl-2表達有關。筆者后續還將從細胞遷移信號通路及動物實驗等角度進一步探索TCS對順鉑化療增敏的作用機制,以期為臨床提高宮頸癌治療效果提供實驗依據。

①與對照組比較,t=-21.72～44.24,P<0.05;②與對照組比較,t=-1 559.8～-4.68,P<0.01;③與順鉑組比較,t=-801.6,P<0.05;④與順鉑組比較,t=-53.34,P<0.01。