根皮素-4,4'-聯吡啶共晶的制備表征與溶解性能測定*

張雷,張丹丹,尚會建,陳旭

(河北科技大學化學與制藥工程學院,石家莊 050000)

根皮素(phloretin,PHL)是一種二氫查爾酮類天然產物,廣泛存在于蘋果、梨和其他多汁水果的果皮和果樹根皮中[1-2]。根皮素具有抗氧化、抗自由基、抗炎、抗腫瘤等生物和藥理活性[3-4],應用于面膜、護膚膏霜、乳液和精華素等護膚品中[5-6]。由于水溶性差和生物利用度低,導致根皮素的應用受到諸多限制。臨床上,因根皮素在水中溶解度僅0.02 mg·mL-1,導致其治療效果難以發揮[7-8]。目前,為提高根皮素溶解度以適應臨床需求,需要研究新制劑來改良根皮素理化性質[9-12],其中共晶因具有不破壞藥物活性成分以及更加穩定的特性而受到關注[13]。

藥物共晶是指活性藥物成分(active pharmaceutical ingredient,API)和共晶形成物(cocrystal former,CCF)之間通過氫鍵、鹵鍵等非共價鍵相互作用而堆積形成的超分子化合物[14-15]。空間堆積方式的改變導致藥物活性分子在形成共晶后的物理性質發生部分變化,可改變藥物溶出[16]、溶解[17-19]、穩定性[20-21]、生物利用度[22]、可壓縮性等重要參數。

目前已有文獻報道了幾種以根皮素為API的共晶,如根皮素-煙酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ晶型[23],根皮素-異煙酰胺[24],根皮素-甜菜堿[25]等共晶。研究表明,根皮素的某些共晶可在一定程度上增加根皮素平衡溶解度,并具有較好的溶解性能。筆者在本實驗對合成根皮素新共晶進行研究,通過液體輔助研磨法、漿式結晶法及蒸發結晶法制備根皮素-4,4'-聯吡啶(4,4'-Bipyridine,BPY)共晶,以期增加根皮素溶解性能,提高根皮素生物利用度。

1 材料與方法

1.1儀器 粉末X-射線衍射儀(powder X-ray diffraction,PXRD):Rigaku D/max-2550,日本理學Rigaku公司。測試條件:電源設置40 kV、40 mA,Cu/Kα(λ=0.154 nm)射線源,掃描步長0.02 °,速度5 °·min-1,范圍5°～40°(2θ)[11]。熱重分析-差示掃描量熱儀(thermogravimetric analysis-differential scanning calorimetry,TG-DSC):STA 449 F5,德國NETZSCH公司。分析條件:氮氣流量50 mL·min-1,30～350 ℃下升溫10 ℃·min-1。傅里葉變換紅外光譜儀(Fourier transform infrared spectrometer,FT-IR):Spectrum 400,美國PerkinElmer公司。元素分析(elemental analysis,EA):Vario EL Cube CHNS,德國Elemenlar公司。高效液相色譜(HPLC)儀:Agilent 1200,美國Agilent公司。檢測條件:Kromasil 100-5-C18柱(250 mm×4.6 mm)。流動相:甲醇-0.4%磷酸鹽溶液(70：30)。溶出實驗儀:RC12AD配RZQ-12D取樣收集系統,天大天發有限公司。藥品穩定性實驗箱:DAA-1型,上海一恒科學儀器有限公司。

1.2試藥 根皮素(含量≥98.0%,批號:C14294776)、4,4'-聯吡啶(含量≥98.0%,批號:C13166696)由上海麥克林生化科技有限公司提供;丙酮(分析純,批號:20171125)由天津博迪化工股份有限公司提供;甲醇(色譜純,批號:20180808)、乙腈(色譜純,批號:20180208)、磷酸(分析純,批號:20170402)、無水乙醇(分析純,批號:20170918)由天津市大茂化學試劑廠提供;所有實驗用水均為超純水。

1.3實驗方法 準確稱取根皮素549 mg和4,4'-聯吡啶312 mg(物質的量之比為1：1),置研缽中,緩慢加入無水乙醇0.25 mL,室溫(25 ℃)研磨30 min;或準確稱取根皮素549 mg和4,4'-聯吡啶312 mg(物質的量之比為1：1),置潔凈錐形瓶,加適量無水乙醇于室溫(25 ℃)磁力攪拌12 h。過濾取濾餅,50 ℃條件下真空干燥24 h得白色粉末即為BPY共晶;或準確稱取根皮素549 mg和4,4'-聯吡啶312 mg(物質的量之比為1：1),置干凈西林瓶,加無水乙醇4 mL和丙酮1 mL至溶質全部溶解,封口膜封口,針扎3～5個小孔,置25 ℃潔凈環境中緩慢揮發,48 h后長出針狀白色晶體,即為BPY共晶。

1.4分析方法 溶出性能評價:取PHL-BPY共晶、物理混合物和根皮素適量,經孔徑150 μm(100目)藥篩篩分,取根皮素30 mg當量3種物質,分別加入溶出介質(水、pH值1.2鹽酸和pH值6.8磷酸鹽緩沖液)450 mL并置溶出實驗儀,設置溫度37 ℃,攪拌轉速100 r·min-1,300 min內間隔取樣用HPLC分析。以3000 min(50 h)的平衡濃度作為實驗的平衡溶解度。實驗結束后取各自殘留固體經過濾、干燥并測定PXRD。

穩定性評價方法:于培養皿中放置BPY共晶產物樣品100 mg,置(50±1) ℃下分別在0,10,30,60 d后取樣;高濕穩定性實驗測試條件:置25 ℃下相對濕度(75±5)%恒濕密閉容器,分別在0,10,30,60 d后取樣。PXRD分析樣品穩定性。

2 結果

2.1PXRD分析結果 在PXRD譜圖中,新晶相形成會改變衍射峰形狀、強度及位置,因此可用于判斷共晶是否形成[26-27]。使用Origin軟件分析衍射圖,結果見圖1。

a:根皮素;b:4,4'-聯吡啶;c:液體輔助研磨結晶;d:漿式結晶;e:蒸發結晶。

圖1為制備的共晶產物與原料的PXRD譜圖對比。由圖1可知,研磨結晶、漿式結晶和蒸發結晶3種制備方法得到共晶產物的PXRD圖基本一致,可以認為得到的為一種共晶,下文將3種制備方法得到的共晶統稱為共晶產物。共晶產物PXRD譜圖與根皮素、4,4'-聯吡啶的PXRD譜圖不同,原本歸屬于根皮素的6.93°,9.51°,16.52°,27.12°等位置特征峰,以及歸屬于4,4'-聯吡啶的10.16°,12.59°,17.80°,25.90°,27.98°等位置特征峰消失,而共晶產物在6.59°,11.82°,14.01°,19.26°,20.06°,23.90°等位置出現了不同于根皮素和4,4'-聯吡啶的新衍射峰。共晶產物PXRD譜圖中有新衍射峰出現,證明有新晶相生成。且共晶產物中根皮素、4,4'-聯吡啶原料藥部分特征峰完全消失,說明共晶產物純度較高。

2.2TG-DSC分析結果 通過TG-DSC分析物質熔點及熱失重過程。從DSC曲線可知原料藥及產物熔點變化[28-29],從TG曲線中可以看出原料藥及產物的熱分解過程[30],若有新的熔點出現以及不同的熱分解過程則可進一步判斷是否形成共晶[31-32]。對DSC、TG數據結果分別分析。

本實驗所制備的共晶產物與原料的DSC譜圖見圖2,可知,根皮素在266.83 ℃處出現一個吸熱峰,與其熔點(267 ℃)一致。4,4'-聯吡啶在112.84 ℃處出現一個吸熱峰(195.30 ℃為4,4'-聯吡啶分解溫度),與其熔點(112.15 ℃)一致。共晶產物在222.36 ℃有一個吸熱峰,推測為其熔點。其中共晶產物的熔點與根皮素和4,4'-聯吡啶熔點均不相同。通常,共晶熔點介于API與CCF之間,產物符合這一特點,可作為判定新物相屬于共晶的一個佐證。

圖2 共晶產物與原料DSC譜圖

共晶產物與原料的TG譜圖見圖3。共晶產物的分解失重溫度(175 ℃)低于根皮素的分解失重溫度(257 ℃),高于4,4'-聯吡啶分解失重溫度(111 ℃)。并且在分解失重之前未見明顯失重,證明無結晶水或結晶溶劑存在。失重溫度不同說明共晶產物與原料熱穩定性不同,這與DSC分析結果一致。

2.3FT-IR結果 通過FT-IR可以判斷API與CCF之間是否形成新的非共價鍵[33-34]。對根皮素、4,4'-聯吡啶以及共晶產物進行FT-IR分析,以檢測根皮素與4,4'-聯吡啶之間的相互作用以及晶體結構的更多細節。

圖3 共晶產物與原料TG譜圖

結果見圖4,BPY共晶在3030,1620,1596,1534,802,730 cm-1產生紅外吸收峰,其中3030 cm-1為不飽和碳的νC-H吸收峰,1620 cm-1為根皮素中νC=O吸收峰,1596和1534 cm-1為νC=C和νC=N吸收峰,802和730 cm-1為芳香環吸收峰。由圖4可知,根皮素與4,4'-聯吡啶共同組成共晶。比較BPY共晶與根皮素、4,4'-聯吡啶FT-IR圖譜,在νO-H(2800～3600 cm-1)官能團特征區處,共晶的FT-IR圖譜發生了變化,在形成共晶時不飽和碳的νC-H與根皮素中νO-H=3275 cm-1形成吸收峰共同紅移至3030 cm-1,推測為4,4'-聯吡啶中兩端的N原子與根皮素中的O-H形成的氫鍵,因此可以推斷根皮素與4,4'-聯吡啶形成共晶的方式為C=N…H-O的相互作用。這進一步驗證了根皮素、4,4'-聯吡啶形成了BPY共晶。

圖4 共晶產物與原料FT-IR譜圖

2.4EA結果 通過EA可以測定產物中元素的質量分數,從而確定共晶的化學計量比。通過使用元素分析儀將實驗樣品氧化燃燒,測定產生的3種氧化燃燒生成產物二氧化碳(CO2)、水(H2O)和氮氣(N2)的質量,來確定碳(C)、氫(H)、氮(N)3種元素的含量,通過扣除確定的N、C、H元素可得O元素含量[35]。

結果見表1,BPY中各元素含量符合化學計量比根皮素：4,4'-聯吡啶為1：1的元素含量,所以BPY中根皮素與4,4'-聯吡啶化學計量比為1：1,即1 mol根皮素可與1 mol 4,4'-聯吡啶形成共晶。

表1 BPY共晶各元素含量

2.5HPLC分析 HPLC圖見圖5。根皮素保留時間為4.01 min,其雜峰對根皮素測定無干擾。

圖5 根皮素HPLC譜圖

2.6粉末溶出曲線與平衡溶解度 藥物在水性介質中的溶解速度很大程度上決定了藥物生物利用度和功效。2020年版《中華人民共和國藥典》四部通則中0931溶出度與釋放度測定法,實驗采用其中攪拌槳法進行測定。

藥物的粉末溶出速率和平衡溶解度是影響其生物制藥性能的關鍵參數。對根皮素、物理混合物以及共晶產物在水、pH值1.2鹽酸、pH值6.8磷酸鹽緩沖溶液3種溶出介質中的粉末溶出度和平衡溶解度進行研究。根皮素、物理混合物以及共晶產物的粉末溶解曲線和平衡溶解度值分別見圖6-8。其中圖6為根皮素、物理混合物和共晶產物在水、pH值1.2和pH值6.8溶液中0～300 min內溶出度曲線。共晶產物、物理混合物和根皮素在3種溶液中均可快速溶解。在pH值1.2和pH值6.8溶液中,共晶產物在初始快速釋放后可以保持穩定。而在水中共晶產物在初期快速釋放后可以觀察到濃度快速上升和下降(“彈簧”效應),可以歸因于相應的根皮素形成了低溶性固體。

a:水;b:鹽酸溶液(pH值=1.2);c:磷酸鹽緩沖溶液(pH值=6.8)。

a:水;b:鹽酸溶液(pH值=1.2);c:磷酸鹽緩沖溶液(pH值=6.8)。

圖8 根皮素、物理混合物和共晶產物在水、鹽酸溶液(pH值=1.2)、磷酸鹽緩沖溶液(pH值=6.8)中的平衡溶解度

圖7為根皮素、物理混合物和共晶產物在水、pH值1.2和pH值6.8溶液中300～3000 min內溶出度曲線。由圖可知,無論是根皮素、物理混合物還是共晶產物,其過飽和度即使在3000 min后仍能保持不變,這種過飽和根皮素的“懸停”現象可能與根皮素與4,4'-聯吡啶絡合有關。

由圖8可知,共晶體在水、pH值1.2和pH值6.8的3種溶液平衡溶解度分別為根皮素原料藥的1.20,1.60和1.12倍,分別為物理混合物的1.11,1.43和1.08倍,共晶產物平衡溶解度較根皮素原料藥、物理混合物均有相應提高。

BPY共晶在不同溶劑中的溶出機制,可以通過溶出曲線及溶解后剩余固體PXRD圖譜(圖9)觀察。共晶產物在水溶液中的溶解原理,可以解釋為共晶在溶解過程中氫鍵會瞬間打開,導致共晶配體4,4'-聯吡啶溶解于水,這時難溶的根皮素會因為共晶結構的突然坍塌而形成無定型態,使根皮素溶解度產生一個峰值,即為“彈跳”現象,隨后根皮素又轉變為穩定的低溶解性晶體,所以會導致根皮素的濃度下降,即“傘降”現象,因此BPY共晶在水溶液中的溶解機制與“彈跳-傘降”模型吻合。對于BPY共晶在pH值1.2的鹽酸溶液和pH值6.8的磷酸鹽緩沖溶液這兩種溶出介質中,通過共晶溶解后殘留固體的PXRD圖譜以及溶出曲線可以猜想出共晶產物在整個溶解過程中一直以共晶形式存在,共晶中的氫鍵并沒有被打開,這與共晶產物在這兩種溶液中的溶出曲線并未出現“彈跳-傘降”現象一致。

a:根皮素;b:4,4'-聯吡啶;c:共晶產物;d:水溶解后;e:pH值1.2鹽酸溶解后;f:pH值6.8磷酸鹽緩沖溶液溶解后。

2.7穩定性實驗結果 穩定性研究表明,實驗得到的BPY共晶樣品不易降解,見圖10—11,BPY共晶在高溫[(60±1) ℃]和高濕[溫度25℃,相對濕度(75±5)%]條件下的PXRD圖譜均無顯著變化,表明上述樣品在高溫、高濕條件下均保持穩定。產品適合工業化應用、長期儲存及制備成口服固體制劑。

圖10 BPY共晶在高溫[(50±1)℃]條件下不同時間的PXRD圖譜

圖11 BPY共晶在高濕[溫度25 ℃、相對濕度(75±5)%]條件下不同時間的PXRD圖譜

3 討論

筆者在本實驗采用液體輔助研磨法、漿式結晶法以及蒸發結晶法制備新的BPY共晶,并采用PXRD、TG-DSC聯用、FT-IR、EA等方法進行了晶體結構表征,確定了該產物為共晶產物。同時對共晶產物進行了溶出速率、平衡溶解度以及穩定性考察,實驗結果表明,與物理混合物和單獨根皮素原料相比,共晶可以提高根皮素的溶解性能,并且具有較好的溶解性能。穩定性實驗表明,BPY共晶在高溫[(50±1) ℃]和高濕(溫度25 ℃,相對濕度75%)條件下分別具有良好的化學穩定性。本研究為提高難溶性藥物溶出速率及溶解性提供了理論及技術支持,具有較好的應用前景。