matK序列在絞股藍及其混偽品中的應用

徐林　趙芳　楊貴清　尹鑫　徐其碧　趙月梅

摘要 用matK序列作為DNA條形碼來區分絞股藍及其混偽品雪膽、錐形果、棒槌瓜、烏蘞梅和崖爬藤。通過PCR擴增測序和在GenBank中下載的方式共獲得16條matK序列，經比對后，用MEGA 6.0計算種間的K2P距離并基于該距離建立了系統發育鄰接樹（NJ），并計算了“barcode gap”。結果顯示，絞股藍與其混偽品雪膽、錐形果、棒槌瓜、烏蘞梅、崖爬藤種內種間遺傳距離區分明顯，可形成一個“gap”，系統發育樹中6個物種中分成了兩大支，葫蘆科物種絞股藍、雪膽、錐形果和棒槌瓜聚成了一支，葡萄科物種烏蘞梅和崖爬藤聚成了另一支，絞股藍樣品聚為單系并能夠與其混淆品明顯區分開。表明matK序列可作為區分絞股藍和其常見混偽品的參考DNA條形碼。

關鍵詞 matK；絞股藍；偽品；DNA條形碼

中圖分類號 R282.5? ?文獻標識碼 A

文章編號 1007-7731（2023）07-0022-04

絞股藍，又名五葉參、七葉膽、公羅鍋底、遍地生根等，為葫蘆科絞股藍屬的多年生草質藤本植物[1]。全草入藥，具有補氣養陰、清肺化痰、養心安神之功效，又名“南方人參”。

絞股藍療效顯著，市場前景廣闊，引發了科研和開發熱潮[2]。由于多種植物在形態上與絞股藍極為相似，不容易分辨，導致絞股藍臨床藥材來源復雜，嚴重影響了臨床用藥的安全性和加工產品的質量。如同科植物雪膽，不僅與絞股藍形態相似，分布區域與生長環境也非常相近，野外采集時尤其在營養生長期，易將其與絞股藍混淆[3-4]；棒槌瓜、錐形果是絞股藍藥材在葫蘆科中常見的混淆品[5]；此外，葡萄科植物烏蘞莓、崖爬藤營養器官的形態也與絞股藍也極其相似，將烏蘞莓誤作絞股藍采集的現象時有發生[6]。

DNA條形碼技術由Hebert等[7]于2003年正式提出，是指利用一個或少數幾個標準的DNA片段快速、準確識別和鑒定植物物種的技術[8]。該技術以其通用性強，穩定性和重復性高，操作流程標準等特點而備受關注。matK序列是植物葉綠體trnK基因的內含子中的一個開放閱讀框，功能與RNA轉錄體中Ⅱ型內含子的剪切有關，進化速率較快，PCR擴增和測序的成功率均較高，在科、屬級水平能提供較多的進化和系統發育信息[9]。該序列被認為是植物DNA條形碼的有效候選片段之一，廣泛應用于中藥的真偽鑒別、系統發育的探討和親緣關系的研究[10-13]。

絞股藍與其混偽品的鑒定研究多見于植物原形態及其粉末鑒別等傳統中藥鑒定方法[14-19]，分子生物學水平上的鑒定研究較少[5]，而基于matK序列的研究尚未見報道。為此，本研究擬應用matK序列對絞股藍及其混淆品進行鑒定，為準確、簡便地鑒定絞股藍及其常見混淆品提供重要的分子依據。

1 材料與方法

1.1 材料來源

絞股藍原植物分別采自貴陽、廣西，其余部分植物的matK序列從GenBank下載。經比對剪切后共16條序列。具體信息見表1。

1.2 DNA提取、PCR擴增及序列測定

絞股藍葉片樣品采自貴州貴陽和廣西崇左，在野外采集后，將葉片放入變色硅膠中快速干燥。總DNA提取采用天根公司植物DNA提取試劑盒（Tiangen Biotech Co.，China）。PCR擴增引物參考[10]研究中引物序列信息。擴增反應采用25 μL的反應體系：包括15～40 ng的模板DNA，2.5 μL 10×buffer，0.5單位的Taq DNA聚合酶（5U·μL^-1），2 μL的MgCl₂（25 mol·L^-1），2 μL的dNTPs（10 mmol·L^-1），正反向引物各2.5 μL（5 μmol·L^-1），再添加蒸餾水至25 μL。PCR擴增程序為96 ℃預變性3 min，95 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，32個循環后，72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR擴增產物，以0.5×TBE為電泳緩沖液進行凝膠電泳檢測，檢測合格的PCR擴增產物經純化后，送至廣州華大生物科技有限公司進行測序。

1.3 數據分析

將所有DNA序列（實驗所得+下載）用BioEdit[20]軟件進行序列查看并對比，比對后刪除前后兩端多余的序列。用MEGA 6.0[21]計算種間和種內的遺傳距離，并基于KIMURA 2-PARAMETER雙參數模型用鄰接法（neighbor-joining method，NJ）構建系統發育樹以便直觀鑒定各物種，同時以KIMURA 2-PARAMETER模型做1 000次可信度分析。合格的DNA條形碼還有一個衡量標準是“barcode gap”，即序列的種間變異要足夠大，而種內變異要足夠小，從而在中間形成一個明顯的間隔區。

2 結果與分析

2.1 種間序列比對分析

將16條絞股藍及其偽品的matK序列經過比對后總長度為735 bp。堿基T、C、A、G的平均含量分別為37.80%、16.60%、28.80%、16.90%。絞股藍與其他偽品之間的變異較大，存在變異位點有173個，占總位點的23.5%。而絞股藍和其他偽品的種內變異較少：絞股藍的3條序列中分別在147、153、242、313、461、664、675和678 bp位置存在8個位點的變異；烏蘞梅的2條序列中在402、520、596和663 bp共4個位點存在變異，其余序列均無種內變異存在。

2.2 絞股藍及其偽品的K2P遺傳距離分析

matK序列在絞股藍及其偽品中的遺傳距離分布見表2，其中括號內表示的是種內距離。種內距離中：錐形果、棒槌瓜和崖爬藤只有1條序列，無法計算種內距離；雪膽的8條序列中相似度高，種內距離為0；烏蘞梅的種內距離為0.005；絞股藍為0.009。種間距離最大的是錐形果和烏蘞梅之間，為0.250；最小的是棒槌瓜和絞股藍之間，為0.037。

由種內種間分布的距離柱形圖（圖1）可以看出：二者在分布頻率上無重疊，種內距離集中在1%以內，種間距離多集中在3%之后，表明matK序列在這幾個物種中的距離分布合適，種內距離和種間距離區分明顯。

2.3 聚類分析

以鄰接法構建的絞股藍及其偽品的共16條matK序列的系統發育樹表明（圖2）：這16個樣品分為2大支，其中來自葡萄科的烏蘞梅和崖爬藤聚成了一支，來自葫蘆科的絞股藍、錐形果、棒槌瓜、雪膽4個樣品聚成了一支，其中后3個物種（錐形果、棒槌瓜和雪膽）親緣關系較近，聚在了一起后又與絞股藍的3個樣品形成一個分支。每個物種均能鑒定到種且支持率較高，能直觀地反映出絞股藍與偽品的matK基因序列差異。表明matK基因能有效地將絞股藍及其常見偽品鑒別開來。

3 討論

本文分析了絞股藍及其常見偽品錐形果、棒槌瓜、烏蘞梅、崖爬藤、雪膽共6種植物的matK序列，包括序列特征、K2P距離及系統進化樹。結果表明，就試驗方法而言，該序列在絞股藍中的PCR擴增表現良好，反應條件的篩選及通用引物的使用均很順利，擴增效率和測序效率均很高。其余樣品的matK序列為下載數據，在此不做評價。就變異位點而言，筆者在735 bp序列中共發現173個差異位點，變異位點較多，這主要是由以下2個部分造成的，一是由于matK序列本身進化較快，能夠提供豐富的變異信息；二是由于絞股藍的偽品烏蘞梅、崖爬藤在親緣關系上與絞股藍的距離較遠，絞股藍分類上屬于葫蘆科，而烏蘞梅和崖爬藤屬于葡萄科。這些遺傳差異在種間距離和系統進化樹方面表現均很明顯，同為葡萄科的烏蘞梅和崖爬藤之間的遺傳距離最小，親緣關系最近，同理，絞股藍、錐形果、雪膽和棒槌瓜之間的遺傳距離親緣關系也較近。綜上所述，matK序列可以有效地鑒別絞股藍及其偽品錐形果、棒槌瓜、烏蘞梅、崖爬藤和雪膽，具有一定的應用價值。

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（責編：張宏民）