1株耐重金屬植物促生菌Y3的分離、生物學特性及全基因組測序分析

袁濤　劉向銅　賈美玉　陳井影　余小霞　盧斌宇　張艷梅　雷冰

摘要 從江西東鄉野生稻自然保護區野生稻（Oryza sativa L.）植株中分離獲得1株固氮菌株Y3，通過16S rRNA和基因組系統發育分析，鑒定為Kosakonia sacchari。生理生化和促生試驗表明，Y3對重金屬Cu²⁺、Ni²⁺、Co²⁺和Zn²⁺具有較好的耐受性，Cd²⁺的耐受濃度達到200 μg/mL，同時具有固氮和產鐵載體的功能。基因組注釋和比較基因組學分析顯示，Y3基因組大小為5.1 Mb，GC含量53.68％，具有5 140個編碼基因，其中包含74個tRNA基因、8個rRNA基因和4 985個功能蛋白基因；同源基因分析表明，6株Kosakonia sacchari菌株共有3 987個基因簇，其中Y3與其他5株菌株共享4 417個基因簇；比較基因組分析表明，Y3基因組中存在與植物促生作用有關的鐵載體合成酶和固氮酶相關基因，以及與Zn²⁺轉運和Cu²⁺抗性相關的基因。本試驗深入研究了Y3的促生和重金屬耐受性機制，為更有效地利用其在植物-微生物聯合修復重金屬污染土壤方面提供了理論依據。

關鍵詞 Kosakonia sacchari；重金屬耐受性；植物促生性；基因組注釋；比較基因組學分析

中圖分類號 S182? ?文獻標識碼 A

文章編號 1007-7731（2023）07-0026-08

Isolation， Biological Characteristics and Draft Genome Sequence Analysis of a Plant Growth-promoting Bacteria （PGPB） Y3， a Strain with Multiple Heavy Metal Resistant Property

YUAN Tao LIU Xiangtong JIA Meiyu ?CHEN Jingying YU Xiaoxia ?LU Binyu ?ZHANG Yanmei LEI Bing

（1Key Laboratory of Mine Environmental Monitoring and Improving around Poyang Lake of Ministry of Natural Resources， East China University of Technology， Nanchang Jiangxi 330013;

2College of Water Resources and Environmental Engineering， East China University of Technology， Nanchang Jiangxi 330013;

3School of Surveying and Geoinformation Engineering， East China University of Technology， Nanchang Jiangxi 330013）

Abstract A metal-tolerant strain Y3 was isolated from wild rice （Oryza sativa L.） plants in Dongxiang District of Jiangxi Province and identified as Kosakonia sacchari based on the 16S rRNA gene and genome sequence. Strain Y3 exhibited increased tolerance to heavy metals including Cu²⁺， Ni²⁺， Co²⁺ and Zn²⁺. The bacteria also showed high siderophore-producing and nitrogen-fixing capacity. Based on these important features， the whole genome was sequenced and annotated and a comparative genome analysis was conducted. The total size of the Y3 genome is 5.1 Mb， with a 53.68% GC content and 5 140 coding genes， which contained 4 985 predicted protein-coding genes， 74 tRNA， and 8 rRNA genes. In the Venn diagram， the six Kosakonia sacchari strains had 3 987 clusters and Y3 shared 4 417 clusters with the other five strains. Moreover， genome annotation using the PATRICK database identified several genes that encode nitrogenase and siderophore-producing enzymes involved in plant growth promotion， the presence of genes related to Zn²⁺transportation and Cu2⁺resistance may explain the heavy metals tolerance of strain Y3. The whole-genome analysis of this strain clarified the genetic basis underlying its phenotypic and biochemical characteristics， underpinning the beneficial interaction between Y3 and host plants， and providing a basis for more effective use of it in the phytoremediation of heavy metal-contaminated soil.

Keywords Kosakonia sacchari; heavy metal tolerance; plant growth promotion; genome annotation; comparative genome analysis

Kosakonia屬是2013年從腸桿菌屬（Enterobacter）中重新定義劃分出來的新屬[1]，目前包括9個種。大多數Kosakonia屬菌株能夠定殖在植物體內，是與植物相互關系較為緊密的內生菌，目前從甘蔗、水稻、紅薯、巴拉圭茶、玉米等作物中分離到Kosakonia radicincitans、Kosakonia sacchari、Kosakonia radicincitans等細菌[2-5]。一些Kosakonia屬菌株具有固氮、溶磷、產生植物激素和鐵載體、分泌ACC脫氨酶等功能，能夠促進植物生長和增強植物抗逆性。已有報道，Kosakonia radicincitans能夠增加水稻、玉米、番茄等作物產量和土壤肥力，在德國作為一種微生物菌劑被廣泛應用于農業生產[6]。除在農業生產中的應用，Kosakonia屬的一些菌株在污染環境修復中也起到重要作用。Ilias等[7]從制革廢水中分離出的Kosakonia cowanii MKPF2表現出對多種重金屬的抗性（Ni²⁺，Zn²⁺，Cu²⁺，Pb²⁺，Cd²⁺，Hg²⁺）和Cr（VI）的還原能力，減輕了重金屬Cr對環境的生物毒性。

由于工業生產和礦山開采活動，大量重金屬進入周邊環境中，造成了流域環境污染，一些重金屬甚至通過作物吸收進入食物鏈，危害人體健康。目前，隨著微生物修復技術的應用，植物促生菌在環境治理中受到重視。采用耐重金屬促生菌與超富集植物聯合修復重金屬污染土壤，可以促進植物生長并減輕植物脅迫，加快植物對重金屬的吸收轉移速率，具有較好的生態修復應用前景。研究報道，從蘇丹草（Sorghum sudanense）中分離到1株Cu耐受性細菌Enterobacter sp. K3-2，具有產生ACC脫氨酶、鐵載體合成酶和IAA的作用，接種到蘇丹草中能夠顯著提高蘇丹草對銅離子的吸收積累效率[8]。趙會會[9]從植物根際土壤中分離得到的耐鎘植物促生菌Enterobacter sp. Oj06和Enterobacter sp. Ps08，能增加土壤中鎘的有效態，并促進黑麥草對鎘的吸收與積累。

本研究從江西東鄉野生稻保護區的野生稻植株中分離到1株植物促生菌Y3，經鑒定為蔗糖小迫氏菌（Kosakonia sacchari），對多種重金屬具有較好的耐受性。基于這些重要特征，本研究對Y3進行了基因組測序和比較基因組學分析，從生物化學和分子水平上解析促生和重金屬耐性機制，挖掘其在修復重金屬污染土壤上的潛力。

1 材料和方法

1.1 菌株的分離與鑒定

Y3是從江西東鄉野生稻植株中分離得到的1株植物促生固氮菌。分離方法如下：采集保護區野生稻植株及其根際土壤裝于塑料盆內，立即帶回實驗室；野生稻植株用自來水洗凈后，將莖、葉剪成長3 cm，寬1 cm放入滅菌的培養皿中；70%乙醇消毒5 min，2% NaClO消毒5 min，無菌水洗5次后，將表皮剝離取其中間的部分，然后用研缽磨碎（內放石英砂和生理鹽水），取0.1 mL研磨液涂布于PCA固體培養基中；同時，最后一次洗滌的無菌水涂布于PCA平板以檢查植株是否消毒徹底；在30 ℃下培養3 d，待培養基中長出細菌后，用接種環挑取單菌落，四分劃線法進行分離純化，即得到Y3菌株；將分離純化的菌株用15%甘油保存于-20 ℃備用。

采用平板劃線法將Y3接種于PCA培養基（胰蛋白胨5.0 g/L，酵母提取粉2.5 g/L，葡萄糖1.0 g/L，pH 7.0，瓊脂20.0 g/L）上，30 ℃培養24 h，觀察菌株的菌落形態。菌株鑒定方法參考《常見細菌系統鑒定手冊》[10]和《伯杰細菌鑒定手冊》[11]。

1.2 DNA提取與16S rRNA基因擴增

挑取-20 °C保存的甘油菌液，在PCA培養基上四分法劃線，30 °C靜置培養24 h。挑取單菌落轉接于液體培養基中，30 ℃振蕩培養24 h后收集菌體，用于提取細菌DNA。使用細菌基因組提取試劑盒（天根，北京）提取Y3基因組DNA，采用通用引物27F/1492R擴增16S rDNA序列，擴增產物交由生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結果使用SeqMan軟件校正后上傳至NCBI數據庫。

1.3 二代測序、序列組裝與注釋

將Y3基因組DNA交由上海派森諾生物科技股份有限公司（Shanghai Personal Biotechnology Co.， Ltd），利用Illumina Hiseq 2500平臺進行全基因組測序。采用A5-MiSeq v20150522軟件[12]對去除接頭的有效測序數據（reads）進行從頭拼裝，構建contigs，進一步對contigs進行局部組裝和優化，獲得基因組骨架（scaffolds）。

1.4 基因組注釋和比較基因組分析

使用NCBI原核基因組注釋管道（PGAAP）和PATRIC數據庫（https：//www.patricbrc.org/）對Y3基因組進行注釋和比較基因組分析，通過OrthoVenn2數據庫（https：//orthovenn2.bioinfotoolkits.net/home）對Kosakonia sacchari的6株代表菌株進行核心基因簇（core gene clusters）注釋和聚類分析。

1.5 基因組遺傳進化分析

為明確Y3與Kosakonia屬菌株的遺傳進化關系，使用TYGS（the Type （Strain） Genome Server）軟件對Y3進行基于基因組系統發育分析[13]；并利用OthoroANI軟件計算Y3與GenBank中其他Kosakonia屬菌株之間的ANI值[14]。

1.6 抗生素抗性、重金屬耐受性和鐵載體測定

1.6.1 抗生素抗性。使用含有10 μg/mL青霉素，30 μg/mL卡那霉素，30 μg/mL四環素，30 μg/mL綠霉素，15 μg/mL紅霉素，10 μg/mL鏈霉素和10 μg/mL氨芐青霉素的藥敏圓片（杭州微生物試劑有限公司），通過圓盤擴散法測試菌株Y3的抗生素敏感性。具體步驟為：用無菌涂布棒均勻涂抹菌液（OD600=1.0）至整個Luria-Bertani（LB）瓊脂平板，滅菌鑷子夾取各藥敏紙片于平板中央。將測試菌株Y3置于30 ℃培養箱中培養，3 d后記錄菌株周圍的透明圈直徑，判斷菌株抗生素敏感性。

1.6.2 重金屬耐受性。添加5.0 g/L CdCl₂·H₂O的儲備溶液于LB固體培養基中，使培養基中CdCl₂·H₂O的濃度分別為100、150、200、250、300、350、400、450、450 mg/L Cd²⁺，點接種菌懸液（OD₆₀₀=1.0）于培養皿中央，30 ℃下培養3 d，觀察細菌的生長情況。允許細菌可見生長的最高Cd²⁺濃度被認為是重金屬最低抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）。同時測試Y3對其他重金屬離子的耐受能力，即Cu²⁺（CuSO₄·5H₂O），Ni²⁺（NiCl₂·6H₂O），Co²⁺（CoCl₂·6H₂O）和Zn²⁺（ZnSO₄·7H₂O）重金屬，方法同上。

1.6.3 鐵載體測定。采用CAS檢測法測定Y3產鐵載體的能力[15]，具體方法如下：將MKB液體培養基（酪蛋白5.0 g，甘油15 mL，K₂HPO₄2.5 g，MgSO₄·7H₂O 2.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH=7.2）按50 mL/瓶分裝于150 mL三角瓶中，115 ℃滅菌20 min備用；用接種環取一環新鮮菌苔于上述培養基內，30 ℃搖床（120 r/min）培養48 h。于20 mL試管中加入3mL CAS檢測液。將上述搖床培養物離心15 min（5 000 r/min），取上清液3 mL加入CAS檢測液中，充分混勻。1 h后觀察顏色變化，設置空白培養液作對照。

1.7 菌株Y3的促生和重金屬耐性相關基因分析

通過直系同源蛋白簇（Clusters of Orthologous Groups of proteins，COG）功能分類、PATRIC數據庫注釋和KEGG代謝通路分析，獲得Y3基因組中與植物促生和重金屬抗性相關的基因，并分析相關代謝通路。

2 結果與分析

2.1 基因組組裝與基因預測

革蘭氏染色表明，Y3是革蘭氏陰性細菌，細胞形狀呈桿狀（圖1）。組裝后的高質量基因組包含34個序列框架（scaffolds），大小為5.1 Mb，共包含5 140個編碼序列，GC含量為53.68％。基因組中包含74個tRNA基因、8個rRNA基因以及4 985個功能蛋白和1 100個假設蛋白基因（表1）。Y3基因組序列已經提交至GenBank數據庫，序列登錄號為JABTEE000000000。

COG功能分類顯示，Y3基因組中包含大量的與能量產生與轉化，氨基酸運輸和代謝，碳水化合物轉移、代謝和轉錄，細胞壁/膜/被膜生源起源和無機離子運輸與代謝相關的基因（圖2），這些基因是細胞自身代謝和功能發揮的分子基礎。

利用OrthoVenn2軟件對6株Kosakonia sacchari菌株的氨基酸序列進行比對和同源聚類分析，發現6株菌共有3 987個同源基因簇（核心基因組），占總基因簇數目（4 768）的83.6%。其中，Y3菌株基因組中存在4 417個基因簇，特有基因簇為5個（圖3）。同源分析表明Y3與其他5株菌株具有較高的同源性，同時在進化上也存在一定差異。

2.2 菌株Y3的生理生化與分子鑒定

Y3的生理生化檢測結果表明，蔗糖利用、甲基紅實驗、接觸酶實驗、脲酶實驗、檸檬酸鹽利用、乙酰甲基甲醇實驗結果為陽性；淀粉水解、硝酸鹽還原、明膠液化、酪素水解、酯酶實驗結果為陰性（表2）。

16S rRNA基因序列分析表明，Y3與Kosakonia sacchari SP1菌株的16S rRNA基因序列（登錄號：MW332261）相似性為99.8％。基于基因組的進化樹表明，Y3與Kosakonia sacchari SP1和Kosakonia sacchari CGMCC 1.12102聚為同一簇（圖4），表明其與二者的親緣關系較近。Y3與GenBank數據庫中的5株Kosakonia sacchari菌株（圖4）計算得出的平均核苷酸同一性（average nucleotide identity，ANI）值在94.5％～98.8％。基于2個菌株的基因組ANI值>94％，則被認定在進化上屬相同種，因此，可鑒定菌株Y3為Kosakonia sacchari。

抗生素測試結果表明，Y3對10 U青霉素，15 μg/mL紅霉素具有抗藥性，但對10 μg/mL鏈霉素，10 μg/mL氨芐青霉素，30 μg/mL卡那霉素，30 μg/ mL四環素和30 μg/mL氯霉素敏感（表3）。

2.3 菌株Y3的重金屬抗性及促生特性

重金屬抗性結果表明，Y3可以在最高濃度為200 μg/mL CdCl₂·H₂O，250 μg/mL CuSO₄·5H₂O，500 μg/mL ZnSO₄·7H₂O和300 μg/mL CoCl₂·6H₂O的LB（Luria-Bertani）培養基上生長，對Cd²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺和Co²⁺離子均具有較好的耐受性。

鐵載體檢測結果顯示，接種菌株Y3的液體培養基顏色由藍色變為紅色，表明菌株能夠產生大量的鐵載體（圖5）。基因組注釋顯示Y3基因組中存在與Zn²⁺轉運相關的基因ZunA、ZunB、ZntB、ZitB、ZupT和與Cu²⁺抗性相關的基因CopC、CopD，表明Y3能夠積極主動轉運細胞內外Zn²⁺，并對Cu²⁺具有一定的抗性。比較基因組分析發現Y3基因組中還存在與植物促生作用相關的鐵載體合成酶基因（entB、entE、entA）和固氮酶基因（nifA、nifB、nifH、nifQ、nifX、nifN、nifT、nifZ、nifE）（圖6）。利用CARD數據庫的比對結果顯示，Y3基因組中還包含多重抗生素抗性基因marA、marB和marR。

3 討論與結論

近年來，土壤重金屬污染問題逐漸凸顯，對重金屬污染土壤的治理和修復是當前十分迫切的任務。植物修復是重金屬污染土壤的一種環保型治理技術，在土壤生態修復領域被越來越廣泛地應用與研究[16]。然而，重金屬對植物生長的脅迫和植物吸收重金屬效率低是導致植物修復效果差的主要原因。Glick等[17]提出，污染環境中微生物在促進植物健康和生長方面發揮著重要作用，能夠顯著提高植物吸收重金屬的效率。植物促生菌與植物聯合修復重金屬污染土壤，是提高修復效率的有效方法之一。植物促生菌通過提高植物適應性（減輕有毒有害物質脅迫）和供給養分物質，促進植物生長和植物根系從土壤中吸收重金屬，從而加速提取土壤中重金屬，提高修復效率[18]。植物-微生物聯合修復技術具有修復費用小、改善修復區土壤生態功能和大面積可持續治理的特點，適用于農田、復墾礦區等環境重金屬污染土壤的修復[19-21]。因此，耐重金屬促生菌在植物修復重金屬污染土壤技術中具有良好的應用前景。

Y3為從野生稻中分離得到的一株植物內生細菌，具有固氮、產鐵載體等植物促生長特性和耐多種重金屬的能力，在植物-微生物聯合修復重金屬污染土壤上具有潛在的應用價值。系統發育分析表明，Y3為Kosakonia屬中的蔗糖小迫氏菌（Kosakonia sacchari）。目前，已有5株Kosakonia sacchari菌株的基因組提交至NCBI數據庫中，通過基因組注釋和比較，發現Y3的基因組大小（5.13 M）和G+C含量（53.7%）與已提交的5株Kosakonia sacchari菌株較為接近（4.81～5.13M，53.7%～54.0%）。

Kosakonia sacchari是一類植物促生菌，可以提高土壤酶活性，促進植物生長，在玉米和甘蔗種植中作為微生物菌劑被廣泛使用[22]。試驗結果表明，Y3對Cd²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺和Co²⁺離子均具有較好的耐受性，對毒性較大的Cd²⁺的最大生長濃度達到了200 mg/L，在重金屬污染土壤中能夠競爭性生存于植物根際，并寄生于一些禾本科植物體內。Y3能夠分泌大量的鐵載體，對部分金屬離子具有很強的絡合作用[23]；同時鐵載體還能夠活化土壤中的重金屬，增加植物根部有效態重金屬離子含量，進而提高重金屬的生物有效性[24]。

植物細胞中Cd²⁺等重金屬的積累往往導致細胞氧化應激反應，抑制植物的生長和代謝活性。比較基因組分析發現Y3基因組中存在與鐵載體合成相關的基因，胞內生成鐵載體對重金屬的螯合作用可能對增加細胞重金屬耐受性起到一定作用。同時Y3基因組中還存在固氮酶合成基因，固氮酶能夠固定空氣中的氮氣為植物可利用的氨，減少植物在氮素缺乏環境中的養分脅迫影響，增加植物生長量，提高植物從土壤中提取重金屬的效率[25]。Y3基因組中一些涉及重金屬抗性或轉移的基因（ZunA、ZunB、ZntB、ZitB、ZupT和CopC、CopD）可能參與到細胞內Cd²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Co²⁺等離子的主動外排和解毒，并且它們對維持細胞內其他必需金屬元素（Mg²⁺、Mo²⁺、Mn²⁺）的平衡也起到重要作用。

植物促生菌具有改善植物生長發育狀況和緩解植物環境脅迫的作用，內生菌定殖于植株體內，與宿主植物聯系更加緊密，減少了重金屬對其自身代謝的干擾，在生物修復中具有更大的應用價值。本研究對植物內生菌Y3的基因組測序和比較基因組分析，為開展Y3與其宿主植物聯合修復重金屬污染土壤提供了材料和依據。

4 參考文獻

[1] BRADY C，CLEENWERCK I，VENTER S，et al. Taxonomic evaluation of the genus Enterobacter based on multilocus sequence analysis （MLSA）：Proposal to reclassify E. nimipressuralis and E. amnigenus into Lelliottia gen. nov. as Lelliottia nimipressuralis comb. nov. and Lelliottia amnigena comb. nov.，respectively，E. gergoviae and E. pyrinus into Pluralibacter gen. nov. as Pluralibacter gergoviae comb. nov. and Pluralibacter pyrinus comb. nov.，respectively，E. cowanii，E. radicincitans，E. oryzae and E. arachidis into Kosakonia gen. nov. as Kosakonia cowanii comb. nov.，Kosakonia radicincitans comb. nov.，Kosakonia oryzae comb. nov. and Kosakonia arachidis comb. nov.，respectively，and E. turicensis，E. helveticus and E. pulveris into Cronobacter as Cronobacter zurichensis nom. nov.，Cronobacter helveticus comb. nov. and Cronobacter pulveris comb. nov.，respectively，and emended description of the genera Enterobacter and Cronobacter[J]. Systematic and Applied Microbiology，2013，36（5）：309-319.

[2] 李瓊潔，程杰杰，孫帥欣，等.玉米聯合固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A的分離鑒定與固氮特性研究[J]. 微生物學通報，2016，43（11）：2456-2463.

[3] MENG X F，BERTANIA I，ABBRUSCATO P，et al. Draft genome sequence of rice endophyte-associated isolate Kosakonia oryzae KO348[J]. Genome Announcements，2015，3（3）：515-594.

[4] SHINJO R，UESAKA K，IHARA K，et al. Complete genome sequence of Kosakonia sacchari strain bo-1，an endophytic diazotroph isolated from a sweet potato[J]. Genome Announcements，2016，4（5）：816-868.

[5] BERGOTTINI V M，FILIPPIDOU S，JUNIER T，et al. Genome sequence of Kosakonia radicincitans Strain YD4，a Plant Growth-Promoting Rhizobacterium isolated from Yerba Mate （Ilex paraguariensis St. Hill.）[J]. Genome Announcements，2015，3（2）：215-239.

[6] BEATRICE B，SASCHA P，SILKE R，et al. Successful formulation and application of plant growth-promoting Kosakonia radicincitans in Maize Cultivation[J]. BioMed Research International，2018：1-8.

[7] ILIAS M，RAFIQULLAH I M，DEBNATH B C，et al. Isolation and characterization of Chromium（VI）-reducing bacteria from tannery effluents[J]. Indian Journal of Microbiology，2011，51（1）：76-81.

[8] LI Y，WANG Q，WANG L，et al. Increased growth and root Cu accumulation of Sorghum sudanense by endophytic Enterobacter sp. K3-2：Implications for Sorghum sudanense biomass production and phytostabilization[J]. Ecotoxicology & Environmental Safety，2016，124：163-168.

[9] 趙會會.耐鎘根際促生菌的篩選及其對一年生黑麥草鎘吸收積累的影響[D]. 南京：南京農業大學，2016.

[10] 東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊[M].北京：科學出版社，2001.

[11] R.E.布坎南，N.E.吉本斯，中國科學院微生物研究所.伯杰細菌鑒定手冊（第八版）[M].北京：科學出版社，1984.

[12] COIL D，JOSPIN G，DARLING A E. A5-miseq：an updated pipeline to assemble microbial genomes from Illumina MiSeq data[J]. Bioinformatics，2014，31（4）：587-589.

[13] MEIER-KOLTHOFF J P，GKER M. TYGS is an automated high-throughput platform for state-of-the-art genome-based taxonomy[J]. Nature Communications，2019，10（1）：1-10.

[14] CHUN J，LEE I，KIM Y O，et al. OrthoANI：An improved algorithm and software for calculating average nucleotide identity[J]. International Journal of Systematic & Evolutionary Microbiology，2015，66（2）：1100.

[15] 王平，董飚，李阜棣，等.小麥根圈細菌鐵載體的檢測[J].微生物學通報，1994，21（6）：4.

[16] 沈葆菊，黃婧，李昊.基于CiteSpace的國外植物修復技術研究進展[J].中國城市林業，2021，3：101-106.

[17] GLICK B R. Using soil bacteria to facilitate phytoremediation[J].Biotechnology Advances，2010，28（3）：367-374.

[18] 龐杰，劉月敏，黃永春，等. 1株草螺屬植物內生菌R-13的分離鑒定及對龍葵吸收土壤鎘的影響[J]. 環境科學，2021，42（9）：4471-4480.

[19] CHEN X，LIU X Y，ZHANG X Y，et al. Phytoremediation effect of Scirpus triqueter inoculated plant-growth-promoting bacteria （PGPB） on different fractions of pyrene and Ni in co-contaminated soils[J]. Journal of Hazardous Materials，2017，325（5）：319-326.

[20] CHEN L，LUO S L，XIAO X，et al. Application of plant growth-promoting endophytes （PGPE） isolated from Solanum nigrum L. for phytoextraction of Cd-polluted soil[J]. Applied Soil Ecology，2010，46（3）：383-389.

[21] 王麗艷，黃小春，王小東，等.植物微生物聯合修復技術對煤礦廢棄地土壤環境的影響[J].南方林業科學，2015，43（4），32-37.

[22] LI L，LI Z Y，HU C J，et al. Plant Growth-Promoting nitrogen-fixing Enterobacteria are in association with sugarcane plants growing in Guangxi，China[J]. Microbes and Environments，2012，27（4）：391-398.

[23] JR C. Siderophores，the iron nutrition of plants，and nitrate reductase[J]. Federation of European Biochemical Societies Letters，1986，209（2）：147-151.

[24] 王東升，王立立，李取生，等.產鐵載體菌對龍葵修復土壤Cd污染的促進效應[J].環境工程學報，2018，12（8）：177-185.

[25] 聶湘平，藍崇鈺，束文圣，等.鋅對大葉相思-根瘤菌共生固氮體系影響研究[J].植物生態學報，2002，26（3）：264-268.

（責編：何 艷）