哈巴俄苷通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路減輕神經炎癥誘導的神經元損傷

郝任娟，胡穎超，于顧然，秦秀德，陸韻薇

哈巴俄苷通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路減輕神經炎癥誘導的神經元損傷

郝任娟1，胡穎超2，于顧然2，秦秀德3，陸韻薇3*

1. 廣東省中醫院，廣東 廣州 510030 2. 南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇 南京 210029 3. 深圳市中醫院，廣東 深圳 518000

研究哈巴俄苷對神經炎癥誘導神經元損傷的作用。采用MTT檢測血管緊張素II（angiotensin II，Ang II）和哈巴俄苷對小鼠小膠質BV2細胞活性的影響；觀察BV2細胞的形態變化；檢測細胞上清液中炎癥因子水平；采用免疫熒光檢測核因子-κB p65（nuclear factor-κB p65，NF-κB p65）核易位以及CD86、髓系細胞觸發受體2（triggering receptor expressed on myeloid cells 2，TREM2）的表達；采用Western blotting檢測Toll樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4）、髓樣分化因子88（molecule myeloid differentiation factor 88，MyD88）、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）蛋白表達。分別使用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和TLR4抑制劑（TAK-242）進一步驗證哈巴俄苷的作用機制。建立BV2-HT22細胞共培養模型，檢測線粒體膜電位、細胞凋亡情況以及凋亡相關蛋白表達，研究哈巴俄苷對神經炎癥引起的神經元損傷的影響。Ang II顯著上調BV2細胞TLR4、MyD88、IL-1β、TNF-α和iNOS蛋白表達（＜0.01、0.001），促進NF-κB p65入核（＜0.001），調節小膠質細胞表面炎癥標志物CD86和TREM2的表達（＜0.05）。哈巴俄苷和TAK-242可逆轉Ang II或LPS誘導的BV2細胞的作用（＜0.05、0.01、0.001）。此外，哈巴俄苷可顯著下調BV2-HT22共培養模型HT22細胞中凋亡相關蛋白的表達（＜0.01、0.001），抑制HT22細胞凋亡（＜0.05、0.001）。哈巴俄苷可能通過抑制Ang II誘導的BV2細胞TLR4/MyD88/ NF-κB通路的激活來減輕炎癥反應，進而緩解炎癥引起的神經元細胞的凋亡。

哈巴俄苷；血管緊張素II；神經炎癥；凋亡；共培養

高血壓為腦小血管病最常見的發病原因，研究表明血壓的過度波動會對大腦產生影響，與認知障礙、中風及癡呆的發生有關[1-2]。血管緊張素II（angiotensin II，Ang II）可引起高血壓的發生，可與體內的腎素血管緊張素（renin angiotensin system，RAS）效應系統結合并引起慢性激活，導致機體多個系統的血管和組織炎癥和穩態失衡[3-4]。Ang II可以誘導腦中小膠質細胞的激活，導致神經系統炎癥以及認知損傷[4]。完整的血腦屏障可阻止Ang II入腦，而持續的高血壓可以增加血腦屏障的通透性，引起Ang II持續入腦以及病理反應的發生[5]。

炎癥反應是一把“雙刃劍”，適量的炎癥因子可以通過清除有害物質發揮保護作用，而其過度釋放則會破壞細胞和組織的穩態。許多研究表明，小膠質細胞可維持神經系統穩態[6-8]，參與大腦中的炎癥反應[9]。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可激活小膠質細胞并促進腦中炎性因子等有害物質的產生，導致神經元損傷[10]。Toll樣受體（Toll like receptors，TLRs）作為模式識別受體可被小膠質細胞識別[11-12]，其主要在神經系統中的星形膠質細胞和小膠質細胞中表達，與炎癥反應調控有關[13-14]。TLR4在小膠質細胞中高表達，用于監測炎癥反應[11]。研究證明TLR4通路已成為Ang II誘導小膠質細胞活化及細胞炎癥因子產生的潛在作用機制[15]。核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）位于TLR4信號通路的下游，可介導多種炎癥過程[16]。TLR4可以招募下游信號分子髓樣分化因子88（molecule myeloid differentiation factor 88，MyD88），促進NF-κB入核，誘導白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、一氧化氮合酶等炎性介質的釋放[12,17-18]。

哈巴俄苷為環烯醚萜類化合物，是玄參Hemsl.的主要活性成分，可用于治療類風濕關節炎、骨質疏松、糖尿病、神經退行性疾病等多種疾病[19-20]。課題組前期已證明哈巴俄苷可通過抑制氧化損傷，上調bEnd.3細胞連接蛋白以減輕Ang II誘導的血腦屏障損傷[21]，尚未發現哈巴俄苷對Ang II誘導的小膠質細胞活化及神經元損傷的研究。本研究以Ang II處理小鼠小膠質BV2細胞并構建BV2-小鼠海馬神經元HT22細胞共培養細胞模型，探討哈巴俄苷的抗炎作用及神經保護作用，并進一步研究其相關機制。

1 材料

1.1 細胞

BV2細胞購自CoBioer Biosciences生物；HT22細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥品與試劑

哈巴俄苷（批號MUST-19082120，質量分數≥98%）購自成都曼斯特生物有限公司，溶于PBS配制濃度8 mmol/L于?80 ℃保存；Ang II（質量分數≥93%，批號HY-13948）、LPS（批號HY-D1056）、TLR4抑制劑TAK-242（批號HY-11109）購自MCE公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號67-68-5）、MTT（批號298-93-1）購自美國Sigma公司；IL-1β ELISA試劑盒（批號88-7013）、TNF-α ELISA試劑盒（批號88-7324）、FITC-CD86單克隆抗體（批號11-0862-82）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；NO試劑盒（批號S0021S）、JC-1熒光探針（批號C2003S）購自上海碧云天生物；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒（批號A211-01/02）、TUNEL染色（批號A113-01/02/03）購自南京諾唯贊生物公司；鬼筆環肽（批號CA1610）購自北京索萊寶生物公司；DMEM-F12培養基（批號31331093）、DMEM培養基（批號11965092）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，批號10091）購自美國Gibco公司；TLR4抗體（批號66350-1-Ig）、MyD88抗體（批號66660-1-Ig）、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）抗體（批號18985-1-AP）、TNF-α抗體（批號17590-1-AP）、Caspase-3抗體（批號19677-1-AP）、B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（批號12789-1-AP）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體（批號50599-2-Ig）、NF-κB p65抗體（批號10745-1-AP）、髓樣細胞觸發受體2（triggering receptor expressed on myeloid cell 2，TREM2）抗體（批號13483-1-AP）、離子鈣結合適配器分子-1（ionized calcium binding adapter molecule-1，Iba-1）抗體（批號10904-1-ap）、β-actin抗體（批號66009-1-Ig）、CoraLite488-conjugated羊抗兔/鼠IgG抗體（批號SA00013-2）購自Proteintech公司；IL-1β抗體（批號31202S）、Caspase-8抗體（批號4790）、Caspase-9抗體（批號9508）、細胞色素C（cytochrome C，Cyt C）抗體（批號11940）購自美國CST公司；HRP標記的山羊抗兔IgG抗體（批號ZB-2301）、HRP標記的山羊抗小鼠IgG抗體（批號ZB-2305）購自北京中杉金橋生物。

1.3 儀器

1300A2型生物安全柜、HERA cell 1501型CO2細胞培養箱、Heraeus Fresco21離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）；CKX41型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；ELX800型酶標儀（美國Bio-Tek公司）；電泳儀及轉膜儀（北京六一儀器廠）；CHEMIDOC XRS+凝膠系統成像儀（美國Bio-Rad公司）；FACSCelesta型分析型流式細胞儀（美國BD公司）；DS-Qi2型正置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）。

2 方法

2.1 細胞培養

BV2細胞用含10% FBS的DMEM-F12培養基，HT22細胞用含10% FBS的DMEM培養基，于37 ℃的培養箱中培養，每1～2天換液，當細胞生長至80%密度時，用于后續實驗。

2.2 MTT法檢測細胞活性

BV2細胞以5×103/孔接種于96孔板中，培養24 h，之后加入不同濃度的Ang II（0、0.001、0.01、0.1、1 μmol/L）或哈巴俄苷（0、0.1、1、10、50、75、100、150、200、300 μmol/L），以加入DMSO作為空白，繼續培養24 h。加入10 μL MTT溶液，于37 ℃的細胞培養箱中培養4 h，加入DMSO充分震蕩10 min，采用酶標儀測定490 nm處的吸光度（）值，計算細胞存活率。

細胞存活率＝(實驗－調零)/(空白－調零)

2.3 Ang II誘導BV2細胞炎癥反應的劑量篩選

BV2細胞以5×105/孔接種于6孔板中，培養24 h后，加入不同濃度（0、0.001、0.01、0.1、1 μmol/L）的Ang II處理24 h。收集細胞，用預冷的PBS洗滌細胞3次，加入裂解液，冰上裂解細胞20～30 min，收集細胞液，超聲3次，每次15 s，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清液為細胞總蛋白。用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，加入上樣緩沖液，100 ℃加熱10 min使蛋白變性。蛋白樣品經10%～12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉60 min，分別加入TLR4、MyD88、iNOS、TNF-α、IL-1β和β-actin抗體，4 ℃孵育過夜；TBST洗滌3次，加入二抗，室溫孵育60 min；TBST洗滌3次，加入ECL化學發光試劑顯影，采用Image Lab軟件分析條帶灰度。

2.4 鬼筆環肽染色檢測哈巴俄苷對Ang II誘導的BV2細胞形態變化的影響

羅丹明標記的鬼筆環肽可以特異地與真核細胞中的肌動蛋白結合，從而表示細胞骨架分布。BV2細胞接種于含細胞爬片的12孔板中，培養24 h后加入0、50、75、100 μmol/L的哈巴俄苷預保護處理，2 h后加入0.1 μmol/LAng II處理24 h。棄去培養基，PBS洗滌細胞2次，4%多聚甲醛室溫固定20 min，0.5% Triton X-100室溫通透20 min，鬼筆環肽避光孵育30 min，DAPI染色3 min，細胞封片后，正置熒光顯微鏡下觀察。

2.5 ELISA和Griess法檢測哈巴俄苷對Ang II誘導的BV2細胞上清液中炎癥因子水平的影響

BV2細胞以5×105/孔接種于6孔板中，培養24 h，加入0、50、75、100 μmol/L的哈巴俄苷或TAK-242（1 μmol/L）預保護處理2 h，之后加入0.1 μmol/LAng II處理24 h。離心收集上清，按照ELISA試劑盒說明書測定細胞上清液中IL-1β和TNF-α水平，通過Griess法檢測上清液中NO含量。

2.6 Western blotting檢測哈巴俄苷對BV2細胞TLR4/MyD88通路蛋白表達的影響

BV2細胞以5×105/孔接種于6孔板中，培養24 h后，加入0、50、75、100 μmol/L的哈巴俄苷或TAK-242（1 μmol/L）預保護處理2 h，之后加入0.1 μmol/LAng II或1 mg/mL LPS處理24 h。收集細胞，按“2.3”項下方法檢測TLR4、MyD88、iNOS、TNF-α、IL-1β蛋白表達。

2.7 免疫熒光染色檢測哈巴俄苷對BV2細胞NF-κB p65、TREM2和Iba-1蛋白表達的影響

BV2細胞以1×104/孔接種于12孔板中，培養24 h，加入0、100 μmol/L的哈巴俄苷或TAK-242（1 μmol/L）預保護處理2 h，之后加入0.1 μmol/LAng II或1 mg/mL LPS處理24 h。PBS洗滌后，4%多聚甲醛室溫固定20 min，0.3% Triton X-100室溫通透20 min，加入免疫熒光染色封閉液，于搖床上室溫封閉60 min；滴加NF-κB p65（1∶500）、TREM2（1∶500）、Iba-1（1∶500）抗體，4 ℃孵育過夜；PBST洗滌3次，滴加熒光二抗，室溫避光孵育60 min，PBST洗滌3次，DAPI染色10 min，PBST洗滌3次，每次10 min，扣片并用指甲油封片，于正置熒光顯微鏡下拍照。

2.8 BV2-HT22共培養模型構建

先單獨培養BV2細胞，用不同濃度的哈巴俄苷處理BV2細胞2 h，之后加入Ang II進一步刺激。同時單獨培養HT22細胞于Transwell小室下層，Ang II刺激BV2細胞24 h后收集BV2細胞置于Transwell小室上層，與HT22細胞共培養24 h，之后用于后續實驗。

2.9 MTT法檢測哈巴俄苷對共培養模型HT22細胞活性的影響

BV2-HT22細胞共培養體系加入50、75、100 μmol/L哈巴俄苷或TAK-242（1 μmol/L），加入10 μL MTT溶液，按“2.2”項下方法測定細胞活性。

2.10 JC-1染色檢測BV2-HT22共培養模型線粒體膜電位變化

JC-1探針用于檢測細胞線粒體膜電位的變化。JC-1聚集在正常細胞的線粒體中，激發出紅色熒光，而當線粒體膜電位去極化時，JC-1以綠色單體的形式存在。一般情況下，綠色熒光的增加和紅色熒光的減少表明細胞凋亡[22-23]。BV2-HT22細胞共培養體系加入50、75、100 μmol/L哈巴俄苷或TAK-242（1 μmol/L），加入JC-1工作液，于細胞培養箱中避光孵育30 min。PBS洗滌3次后，于正置熒光顯微鏡下觀察JC-1單體及聚集物的相對變化。采用Image J軟件進行分析。

2.11 TUNEL染色檢測共培養模型細胞凋亡情況

BV2-HT22細胞共培養體系加入100 μmol/L哈巴俄苷或TAK-242（1 μmol/L），用4%多聚甲醛室溫固定細胞，3% TritonX-100室溫通透細胞，37 ℃與TUNEL染色液反應60 min，然后室溫下與DAPI染色10 min，PBS洗滌3次后，于正置熒光顯微鏡下觀察。細胞核中紅色熒光的增加表明細胞凋亡。

2.12 Annexin V-FITC/PI染色檢測共培養模型細胞凋亡情況

BV2-HT22細胞共培養體系加入100 μmol/L哈巴俄苷或TAK-242（1 μmol/L），用不含EDTA的胰酶消化并收集細胞，預冷的PBS洗細胞3次，然后用Binding buffer對細胞進行重懸，分別用Annexin V-FITC和PI染色液對細胞進行染色，室溫避光孵育10 min，加入400 μL Binding buffer。用BD流式細胞分選儀進行檢測，采用FlowJo軟件分析數據。

2.13 Western blotting檢測共培養模型細胞凋亡相關蛋白表達

BV2-HT22細胞共培養體系加入100 μmol/L哈巴俄苷或TAK-242（1 μmol/L），收集細胞，按“2.3”項下方法提取蛋白，并檢測Caspase-3、Bax、Bcl-2、Caspase-8、Caspase-9、Cyt C蛋白表達。

2.14 統計學分析

3 結果

3.1 Ang II和哈巴俄苷對BV2細胞活性的影響

如圖1所示，不同濃度（0.001、0.01、0.1、1 μmol/L）的Ang II對BV2細胞活性無顯著影響。如圖2所示，0～300 μmol/L的哈巴俄苷對BV2細胞活性也無顯著影響，因此選擇50、75、100 μmol/L的哈巴俄苷進行后續實驗。

3.2 Ang II對BV2細胞TLR4/MyD88通路蛋白表達的影響

為了確定Ang II誘導炎癥反應的最佳濃度，采用Western blotting檢測不同濃度的Ang II對BV2細胞TLR4/MyD88通路蛋白表達的影響，如圖3所示，Ang II能夠劑量相關性地誘導BV2細胞產生炎癥反應，隨著濃度增加，TLR4、MyD88及炎癥相關蛋白IL-1β、TNF-α、iNOS的表達逐漸升高，以0.1 μmol/L Ang II組的表達量最高（＜0.05、0.01、0.001）。由于0.1 μmol/L Ang II對BV2細胞活力無損傷，且具有最明顯的促炎作用，因此選擇0.1 μmol/L Ang II作為后續模型誘導濃度。

圖1 Ang II對BV2細胞活性的影響(, n = 3)

圖2 哈巴俄苷對BV2細胞活性的影響(, n = 3)

3.3 哈巴俄苷對Ang II誘導的BV2細胞形態變化的影響

如圖4所示，Ang II可以誘導BV2細胞形態改變，表現為阿米巴樣形態；而哈巴俄苷可以抑制BV2細胞形態的變化，表明其可以抑制細胞的活化，并呈劑量相關性。

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，下圖同

圖4 哈巴俄苷對Ang II誘導的BV2細胞形態變化的影響 (×200)

3.4 哈巴俄苷對Ang II誘導的BV2細胞上清液中炎癥因子水平的影響

如圖5所示，與對照組比較，Ang II顯著誘導細胞上清液中TNF-α、IL-1β的分泌（＜0.01），促進NO的生成（＜0.01），而哈巴俄苷的干預可以減少上述炎癥相關產物的合成（＜0.01），TLR4通路抑制劑TAK-242也表現出與哈巴俄苷相似的保護作用。

3.5 哈巴俄苷對BV2細胞TLR4/MyD88通路蛋白表達的影響

如圖6所示，75、100 μmol/L的哈巴俄苷顯著抑制Ang II誘導的BV2細胞中TLR4、MyD88、iNOS、TNF-α和IL-1β表達（＜0.05、0.01、0.001）。

為了進一步驗證哈巴俄苷對TLR4/MyD88通路的作用，以小膠質細胞中TLR4激動劑LPS（1 mg/mL）[18]以及TLR4通路抑制劑TAK-242（1 μmol/L）[24]處理細胞，如圖7、8所示，結果顯示100 μmol/L的哈巴俄苷可以顯著抑制LPS誘導的TLR4/MyD88通路的激活及炎癥產物的釋放（＜0.05、0.01、0.001），與TAK-242表現出相似的作用。此外，對于Ang II誘導的BV2細胞，哈巴俄苷和TAK-242均表現出相似的保護作用。

與模型組（Ang II或LPS）比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001，下圖同

圖6 哈巴俄苷對Ang II誘導的BV2細胞TLR4/MyD88通路蛋白表達的影響(, n = 3)

圖7 哈巴俄苷對LPS誘導的BV2細胞TLR4/MyD88通路蛋白表達的影響(, n = 3)

圖8 哈巴俄苷和TAK-242對Ang II誘導的BV2細胞TLR4/MyD88通路蛋白表達的影響(, n = 3)

3.6 哈巴俄苷對NF-κB入核的影響

NF-κB是一種可被MyD88激活的核轉錄因子，其核異位的增加與炎癥反應相關。通過NF-κB p65免疫熒光染色觀察其核異位情況，進一步研究哈巴俄苷與NF-κB的關系。如圖9所示，Ang II和LPS均可誘導NF-κB p65的入核（＜0.01、0.001），而哈巴俄苷的干預可以減少NF-κB p65核異位（＜0.05、0.01），發揮抗炎作用。表明哈巴俄苷可以通過減少NF-κB p65的入核進而抑制后續的炎癥級聯反應。因此，在Ang II誘導的BV2細胞中，哈巴俄苷可以通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路發揮抗炎作用。

圖9 哈巴俄苷對NF-κB p65入核的影響 (×400; , n = 3)

3.7 哈巴俄苷對BV2細胞CD86和TREM2表達的影響

通過免疫熒光染色進一步觀察了哈巴俄苷對小膠質細胞炎癥標志物CD86和TREM2表達的影響。如圖10、11所示，Ang II可以誘導CD86的上調以及TREM2的下調（＜0.05），而哈巴俄苷的作用相反，可以抑制CD86的表達并增加TREM2的表達（＜0.01），表現出保護作用。此外，LPS處理細胞可導致CD86的高表達以及TREM2的低表達（＜0.001），哈巴俄苷同樣表現出保護作用，抑制劑TAK-242也具有相似的保護作用。

3.8 哈巴俄苷對BV2-HT22共培養模型中HT22活性的影響

前述實驗證明哈巴俄苷可以抑制Ang II誘導的細胞炎癥反應，接下來構建BV2-HT22共培養細胞模型觀察BV2的活化對細胞的損傷作用以及哈巴俄苷的藥理作用。通過MTT法檢測共培養模型中HT22細胞的活性。如圖12所示，Ang II顯著抑制共培養模型中HT22細胞的活性（＜0.001），誘導細胞損傷；100 μmol/L哈巴俄苷可以顯著升高細胞活力（＜0.05），減輕HT22細胞的損傷。

圖10 哈巴俄苷對CD86表達的影響(×400; , n = 3)

圖11 哈巴俄苷對TREM2表達的影響(×400; , n = 3)

圖12 哈巴俄苷對共培養模型中HT22細胞活性的影響(, n = 3)

3.9 哈巴俄苷對共培養模型中HT22細胞凋亡的影響

使用JC-1探針檢測線粒體膜電位的變化，如圖13所示，Ang II可以增加綠色熒光及紅色熒光的比值（＜0.001），而哈巴俄苷可以降低綠色熒光及紅色熒光的比值（＜0.001），增加線粒體膜電位，減少細胞凋亡。TUNEL染色結果（圖14）顯示哈巴俄苷可以減輕Ang II誘導的細胞凋亡。細胞流式結果（圖15）也表明Ang II可明顯增加凋亡細胞的數量（＜0.01），而哈巴俄苷可以減少Ang II誘導的細胞凋亡（＜0.05）。

3.10 哈巴俄苷對共培養模型中HT22凋亡相關蛋白表達的影響

Caspases家族可以調節細胞死亡。進一步分析共培養模型中HT22細胞凋亡相關蛋白的表達情況。如圖16所示，Ang II可明顯增加cleaved Caspase-3/ Caspase-3、cleaved Caspase-8/Caspase-8、cleaved Caspase-9/Caspase-9、Bax/Bcl-2及Cyt C表達（＜0.01、0.001）；而用哈巴俄苷處理后，上述凋亡相關蛋白表達均顯著降低（＜0.01、0.001），表明哈巴俄苷可在體外減少炎癥引起的神經元損傷。

圖13 JC-1探針檢測線粒體膜電位變化(×400; , n = 3)

圖14 TUNEL染色檢測細胞凋亡 (×200)

4 討論

小膠質細胞是中樞神經系統的先天免疫細胞，在許多神經退行性疾病中，其慢性激活可產生大量的炎癥介質以及有害物質，導致神經元的死亡[11]。Ang II是高血壓的主要發病因素，其在體內積累可導致血管和組織炎癥，與小膠質細胞的激活有關，可促進多種神經系統疾病的進展[4,25]。因此，抑制小膠質細胞的炎性激活可能為高血壓腦小血管疾病的潛在治療靶點。本研究證明了哈巴俄苷可抑制BV2小膠質細胞的激活，保護神經元細胞免受炎癥損傷，而這可能是通過調控TLR4/MyD88/NF-κB通路來實現的。

圖15 流式細胞術檢測細胞凋亡(, n = 3)

小膠質細胞在維持神經系統穩態方面發揮著重要作用。小膠質細胞的持續激活可在體內產生高水平的有害介質，包括TNF-α、IL-1β和iNOS，具有神經毒性作用[11,26]。TLR4在小膠質細胞中高表達，參與了多種神經退行性疾病的小膠質細胞激活[11]。激活的TLR4可募集下游的MyD88靶向NF-κB信號級聯[27]。Ang II可介導炎癥反應，此外還可以激活小膠質細胞中TLR4介導的信號通路[28-29]。Ang II可誘導TLR4、MyD88、iNOS、TNF-α和IL-1β蛋白表達量增加，促進BV2上清中TNF-α、IL-1β和NO的分泌，誘導NF-κB p65向細胞核內異位。因此，推測Ang II通過TLR4/MyD88/NF-κB通路激活小膠質細胞，使用TLR4抑制劑TAK-242進行驗證，發現TAK-242可產生細胞保護作用。

哈巴俄苷可調節體外3T3-L1脂肪細胞[30]、骨關節炎軟骨細胞[31]和BEAS-2B細胞[32]的炎癥反應。本研究已證明Ang II可通過TLR4/MyD88/NF-κB通路激活BV2細胞的炎癥反應。為了探索哈巴俄苷對小膠質細胞的藥理作用，用哈巴俄苷預處理Ang II誘導的BV2細胞。結果表明，哈巴俄苷可降低細胞中TLR4、MyD88、iNOS、TNF-α和IL-1β蛋白表達，減少BV2上清中TNF-α、IL-1β和NO的分泌，抑制NF-κB p65向細胞核的轉運，表現出與TAK-242相似的藥理作用。總之，哈巴俄苷可通過下調Ang II誘導的BV2小膠質細胞TLR4/MyD88/ NF-κB通路激活發揮抗炎作用。TLR4可以識別多種病原體相關分子模式，LPS作為TLR4主要配體之一，與中樞神經系統中的其他細胞相比，主要作用于小膠質細胞[11]。通常LPS與CD14蛋白結合并轉移到TLR4/MD-2復合物，靶向MyD88依賴的炎癥反應[33]。因此，采用LPS進一步研究哈巴俄苷對上述通路的作用。結果表明，100 μmol/L哈巴俄苷可抑制LPS誘導的BV2細胞TLR4、MyD88、iNOS、TNF-α和IL-1β蛋白表達及NF-κB p65向細胞核內的轉運，與TAK-242的作用相同。即哈巴俄苷確實參與TLR4/MyD88/NF-κB通路。綜上，哈巴俄苷可抑制Ang II處理的BV2細胞TLR4/MyD88/NF-κB通路發揮抗炎作用。

圖16 共培養模型中HT22細胞凋亡相關蛋白的表達(, n = 3)

研究發現，小膠質細胞可極化為促炎M1型和抗炎M2型[11]。M1表型的小膠質細胞與iNOS、TNF-α、IL-1β、CD86、主要組織相容性復合物II（major compatibility complex II，MHC-II）、IL-6等的上調有關，M2表型小膠質細胞具有高水平的CD206、TREM2等[11,34]。TREM2主要在小膠質細胞上表達，可減輕大腦炎癥[35]。通過觀察CD86和TREM2的表達分析小膠質細胞的狀態，CD86的上調表示其促炎活性增加，而TREM2的表達在一定程度上起到了保護作用。結果顯示，在Ang II/LPS處理的小膠質細胞中，CD86表達上調，TREM2表達下調。而哈巴俄苷和TAK-242預處理均可以抑制CD86的表達，增加TREM2的表達。因此，哈巴俄苷可能通過調節小膠質細胞CD86和TREM2的表達來抵抗Ang II或LPS誘導的細胞凋亡。

BV2細胞產生的炎癥分子可導致周圍神經元細胞損傷[11]。為了進一步驗證哈巴俄苷是否具有神經保護作用，構建了體外BV2-HT22細胞共培養模型。結果表明，哈巴俄苷可減輕共培養體系中HT22細胞的損傷，100 μmol/L哈巴俄苷、TAK-242與模型組比較均有統計學意義。用100 μmol/L哈巴俄苷預處理共培養模型，分析由BV2細胞炎癥導致的HT22細胞凋亡。凋亡是一種細胞程序性死亡，主要由Caspases的激活引起。細胞凋亡途徑包括線粒體途徑和死亡受體途徑。死亡受體與其配體結合，激活并水解Caspase-8，進一步激活下游的Caspase-3（死亡受體通路）。炎癥因子可改變線粒體膜通透性，影響促凋亡Bax家族和抗凋亡Bcl-2家族的表達，調節細胞色素C的釋放，進而激活Caspase-9（線粒體依賴途徑）。Caspase-8和Caspase-9均可激活Caspase-3，誘導細胞凋亡[36-38]。哈巴俄苷可降低Ang II誘導的共培養模型中HT22細胞凋亡相關蛋白cleaved Caspase-3/Caspase-3、cleaved Caspase-8/ Caspase-8、cleaved Caspase-9/Caspase-9、Bax/Bcl-2和Cyt C的表達。JC-1染色、TUNEL染色和流式細胞術也證實了哈巴俄苷可減少HT22細胞的凋亡。表明哈巴俄苷可能通過抑制線粒體通路和死亡受體通路，減輕Ang II介導的共培養模型中HT22細胞的凋亡（圖17）。

圖17 哈巴俄苷通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路減輕神經炎癥誘導的神經元損傷

綜上，哈巴俄苷可能通過抑制TLR4/MyD88/ NF-κB通路對Ang II誘導的小膠質細胞發揮抗炎作用，進而減輕神經炎癥引起的神經元損傷，表明哈巴俄苷在預防或治療高血壓腦小血管疾病及其他中樞神經系統炎癥疾病方面具有潛在的藥用價值。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Harpagoside alleviates neuronal damage caused by neuroinflammation via suppressing TLR4/MyD88/NF-κB pathway

HAO Ren-juan1, HU Ying-chao2, YU Gu-ran2, QIN Xiu-de3, LU Yun-wei3

1. Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine, Guangzhou 510030, China 2. Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210029, China 3. Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital, Shenzhen 518000, China

To study the effect of harpagoside on neuron injury induced by neuroinflammation.The effects of angiotensin II (Ang II) and harpagoside on viability of mouse microglia BV2 cells were detected by MTT assay; The morphological changes of BV2 cells was observed; The levels of inflammatory factors in cell supernatant were detected; The nuclear translocation of nuclear factor-κB p65 (NF-κB p65) and expressions of CD86 and triggering receptor expressed on myeloid cells 2 (TREM2) in myeloid cells were detected by immunofluorescence; Toll like receptor 4 (TLR4) and myeloid differentiation factor 88 (MyD88), inducible nitric oxide synthase (iNOS), tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-1β (IL-1β) protein expressions were detected by Western blotting. Lipopolysaccharide (LPS) and TLR4 inhibitor (TAK-242) were used to further verify the mechanism of harpagoside. The co-culture model of BV2-HT22 cells was established, mitochondrial membrane potential, apoptosis and expressions of apoptosis-related proteins were detected to study the effect of harpagoside on neuronal damage caused by neuroinflammation.Ang II significantly increased the protein expressions of TLR4, MyD88, IL-1β, TNF-α and iNOS in BV2 cells (< 0.01, 0.001), promoted the nucleation of NF-κB p65 (< 0.001), and regulated the expressions of inflammatory markers CD86 and TREM2 on the surface of microglia (< 0.05). Harpagoside and TAK-242 could reverse the effects of Ang II or LPS on BV2 cells (< 0.05, 0.01, 0.001). In addition, harpagoside could significantly down-regulate the expressions of apoptosis-related proteins in HT22 cells of BV2-HT22 co-culture model (< 0.01, 0.001), and inhibit the apoptosis of HT22 cells (< 0.05, 0.001).Harpagoside may alleviate the inflammatory response by inhibiting the activation of TLR4/MyD88/ NF-κB pathway in BV2 cells induced by Ang II, thus alleviating the apoptosis of neurons caused by inflammation.

harpagoside; angiotensin II; neuroinflammation; apoptosis; co-culture

R285.5

A

0253 - 2670(2023)13 - 4202 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.13.013

2023-01-03

國家重點研發計劃項目（2022YFC3501403）；江蘇省自然科學基金資助項目（BK20191506）；深圳市“醫療衛生三名工程”項目（SZZYSM202111011）

郝任娟（1996—），碩士研究生，主要從事神經系統疾病的中醫藥研究。E-mail: 1320597106@qq.com

通信作者：陸韻薇（1990—），主治醫師，博士，主要從事神經系統疾病的中醫藥研究。E-mail: 417213243@qq.com

[責任編輯 李亞楠]