老鸛草及其不同溶劑萃取物的紅外光譜分析與鑒定

孫仁爽，趙敏婧，顧地周

老鸛草及其不同溶劑萃取物的紅外光譜分析與鑒定

孫仁爽1，趙敏婧2，顧地周1

1. 通化師范學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院 長白山天然藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 通化 134001 2. 梅河口市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，吉林 梅河口 135000

對(duì)老鸛草及70%丙酮提取不同溶劑萃取物的主體成分、特定成分進(jìn)行快速的分析與鑒定。采用紅外光譜、二階導(dǎo)數(shù)光譜結(jié)合二維相關(guān)紅外光譜對(duì)老鸛草及其70%丙酮提取不同溶劑萃取物進(jìn)行分析鑒定。紅外宏觀指紋分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)老鸛草原藥材含有1730、1618～1445、1337 cm?1等特征譜線，主要?dú)w屬于老鸛草素及其衍生物的鞣質(zhì)類化合物的特征吸收。通過分析不同極性萃取物，可以快速獲知老鸛草素及其衍生物的富集情況和發(fā)現(xiàn)亞硝酸鉀的前體硝酸鉀的存在和分布情況。光譜分析結(jié)果表明，醋酸乙酯層、正丁醇層萃取物與老鸛草素相關(guān)系數(shù)分別為0.944 3、0.930 2，驗(yàn)證大量老鸛草素及其衍生物的存在，及其主要集中在該兩層；在氯仿層、醋酸乙酯層和水層提取物中有硝酸鉀特征吸收峰，以水層最明顯。紅外光譜不僅可以對(duì)主要有機(jī)成分（鞣質(zhì)、黃酮和多糖類等）進(jìn)行檢測分析，同時(shí)可對(duì)硝酸鉀為代表的無機(jī)鹽進(jìn)行快速檢測，在中藥質(zhì)量與安全的分析評(píng)估中其有廣闊的應(yīng)用前景。

老鸛草；紅外光譜；二維相關(guān)紅外光譜；老鸛草素；硝酸鉀

老鸛草是牻牛兒苗科老鸛草屬植物老鸛草Maxim.的干燥地上部分，具有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)等作用[1]。老鸛草中主要化學(xué)成分為鞣質(zhì)類、黃酮類等[2-3]，其中鞣質(zhì)類成分主要為老鸛草素（geraniin）。目前，評(píng)價(jià)老鸛草質(zhì)量的方法主要有性狀鑒別、TLC和HPLC。性狀鑒別主觀性強(qiáng)，TLC快速但較為粗略[4]。HPLC法雖然可對(duì)老鸛草中鞣質(zhì)類成分如老鸛草素等進(jìn)行含量測定，但不能進(jìn)行宏觀整體的成分分析與鑒定，且預(yù)處理繁瑣、運(yùn)行成本高[5]，目前急需快速、廉價(jià)、無損和可靠的檢測方法。紅外光譜法是化合物結(jié)構(gòu)分析與鑒定的經(jīng)典方法之一，主要用來確定化合物分子所含的官能團(tuán)[6]。孫素琴等[7]利用紅外光譜法對(duì)以中藥為代表的混合物體系進(jìn)行了大量的研究，證明紅外光譜可以宏觀整體地對(duì)混合物體系進(jìn)行快速、有效、無損的定性鑒別，也可以分析多糖類、鞣質(zhì)類、黃酮類等藥物有效成分。本實(shí)驗(yàn)采用紅外光譜結(jié)合二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜[8-9]和二維相關(guān)紅外光譜分析方法，對(duì)老鸛草及其70%丙酮不同溶劑萃取物進(jìn)行了快速無損的分析與鑒定，為老鸛草研究提供了方法和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 儀器

Spectrum GX FTIR光譜儀（PerkinElmer，Inc.），DTGS檢測器，光譜分辨率4 cm?1，測量范圍4000～400 cm?1，掃描累加32次。二維相關(guān)光譜所用的變溫附件為Love Control公司的Portable Controller可編程控制單元（50-886型），控溫范圍50～120 ℃。

1.2 樣品

老鸛草樣品采自吉林通化，依照《中國藥典》2020年版由通化師范學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院張立秋副教授鑒定為野生的牻牛兒苗科老鸛草屬植物老鸛草Maxim.的干燥地上部分。

2 方法

2.1 樣品制備

將老鸛草干燥后粉碎，過篩。精密稱取2 g樣品，加70%丙酮24 mL，超聲提取30 min，濾過，減壓回收丙酮，水溶液依次用氯仿、醋酸乙酯、正丁醇萃取，分別得到氯仿層、醋酸乙酯層、正丁醇層、水層，減壓干燥得到各部分的粉末。

2.2 測定方法

用KBr壓片法制樣，獲得原藥材在室溫下的紅外光譜圖[10]。用PerkinElmer公司的Spectrum v6.02軟件進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)圖譜解析，平滑點(diǎn)數(shù)為13。另將所壓樣品裝入變溫附件，溫度程控50～120 ℃，溫度從50 ℃逐步升高，每升溫10 ℃采集1次紅外光譜。

2.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)清華大學(xué)分析中心紅外光譜組設(shè)計(jì)的二維相關(guān)分析軟件處理采集的系列光譜—變溫動(dòng)態(tài)譜，即獲得二維紅外相關(guān)光譜。

3 結(jié)果與分析

3.1 原藥材主體成分分析

如圖1-a中老鸛草素紅外光譜圖所示，3379 cm?1處的吸收峰為苯環(huán)O-H的伸縮振動(dòng)，1728 cm?1處的吸收峰為C＝O的伸縮振動(dòng)，1618、1509、1446 cm?1處的吸收峰可能為苯環(huán)C＝C伸縮振動(dòng)，1339 cm?1處的吸收峰可能為O-H彎曲振動(dòng)，1204 cm?1處的吸收峰為C-O伸縮振動(dòng)吸收。如圖1-a中老鸛草紅外光譜圖所示，老鸛草中主體成分含有鞣質(zhì)類、黃酮類成分以及糖類成分。1730、1618～1445 cm?1主要?dú)w屬于老鸛草素及其衍生物的鞣質(zhì)類物質(zhì)的吸收峰。在1337 cm?1處的吸收峰為酚類分子的O-H彎曲振動(dòng)，1232 cm?1為糖類分子C-O伸縮振動(dòng)吸收，在1048 cm?1處的C-O強(qiáng)吸收峰則來自于糖苷類成分；圖1-b老鸛草二階導(dǎo)數(shù)譜提高了圖譜表觀分辨率，原一維圖譜中吸收峰被分解成多個(gè)峰，1746 cm?1處出現(xiàn)酯類分子C=O伸縮振動(dòng)，說明原藥材中也有少量酯類成分。1618～1445 cm?1苯環(huán)骨架振動(dòng)吸收峰被突顯出來，證實(shí)鞣質(zhì)類以及少量黃酮類成分（另有1659 cm?1）的存在。老鸛草紅外譜圖主要吸收峰的指認(rèn)見表1。

3.2 老鸛草丙酮提取物紅外光譜分析

老鸛草中含有以老鸛草素為代表的鞣質(zhì)類成分，主要有O-H、C＝O、苯環(huán)等特征官能團(tuán)，通過丙酮超聲提取可以將老鸛草中鞣質(zhì)類成分有效地提取出來。

如圖2所示，老鸛草丙酮提取物氯仿層、醋酸乙酯層、正丁醇層均有明顯的鞣質(zhì)類成分的特征吸收峰，3600～2500 cm?1的O-H伸縮振動(dòng)吸收區(qū)域有寬而強(qiáng)的吸收峰，1728～1714 cm?1酯類和酸類分子的C＝O伸縮振動(dòng)，和1600～1450 cm?1有明顯的苯環(huán)骨架伸縮振動(dòng)峰，通過相似度比較可以看出，醋酸乙酯層、氯仿層、正丁醇層、水層與老鸛草素對(duì)照品的相似系數(shù)分別為0.944 3、0.930 2、0.809 7、0.497 0，說明醋酸乙酯層中多酚類成分含有較多的老鸛草素，其次為正丁醇層、氯仿層。二階導(dǎo)數(shù)譜更可清晰表明在氯仿層中有酯羰基吸收峰（1746 cm?1），723 cm?1處吸收峰證明在氯仿層中有油脂類成分，在醋酸乙酯與正丁醇層中出現(xiàn)更多特征峰與老鸛草素相對(duì)應(yīng)的鞣質(zhì)類特征吸收峰；水層中很強(qiáng)吸收峰出現(xiàn)在1384、825 cm?1的，檢索表明其為硝酸鉀特征吸收峰[11]。但是在原藥材中未發(fā)現(xiàn)硝酸鉀的吸收峰，可能是因?yàn)樵谔崛∵^程中對(duì)硝酸鹽進(jìn)行了富集，在氯仿層、醋酸乙酯層也相應(yīng)地發(fā)現(xiàn)了硝酸鉀吸收峰。硝酸鹽為非人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)，在人體內(nèi)會(huì)轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，過多會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生危害。因此，中藥中硝酸鹽的檢測很有意義，目前尚未見紅外光譜法檢測中藥硝酸鹽的文獻(xiàn)報(bào)道。

圖1 老鸛草與老鸛草素的紅外光譜(a) 及二階導(dǎo)數(shù)譜(b)

表1 老鸛草紅外譜圖主要吸收峰的指認(rèn)

3.3 丙酮提取物的二維相關(guān)紅外光譜

如圖3與表2所示，老鸛草提取物氯仿層、醋酸乙酯層、正丁醇層與水層1800～1000 cm?1二維相關(guān)紅外光譜有數(shù)量不等的明顯自動(dòng)峰。在醋酸乙酯層自動(dòng)峰最多為10個(gè)，而水層中只出現(xiàn)2個(gè)，因此可以很直觀地區(qū)分四者。氯仿層1701 cm?1處酯類羰基的吸收峰隨溫度升高峰強(qiáng)度逐漸降低；醋酸乙酯層與正丁醇層中在1629和1619 cm?1附近是鞣質(zhì)類成分相關(guān)的吸收峰隨著溫度升高強(qiáng)度也逐漸減弱。1779和1690 cm?1處自動(dòng)峰屬于羰基伸縮振動(dòng)，此處出現(xiàn)的自動(dòng)峰是因?yàn)轺焚|(zhì)類成分由于溫度升高而變化過快引起的。氯仿層、醋酸乙酯層、正丁醇層、水層提取物的二維相關(guān)譜中均有NO3?（1383 cm?1）的一個(gè)強(qiáng)且尖的自動(dòng)峰，且與其他自動(dòng)峰的交叉峰均為負(fù)，說明此處在溫度微擾下總體變化趨勢與其他自動(dòng)峰變化趨勢相反。另外結(jié)果表明，正丁醇層中也含有少量的硝酸鉀，雖然在其一維圖譜和二階導(dǎo)數(shù)圖譜并沒有與硝酸鉀有關(guān)的吸收峰出現(xiàn)，驗(yàn)證了二維相關(guān)光譜確實(shí)可以提高紅外光譜的檢測限和譜圖分辨率。通過1383 cm?1自動(dòng)峰強(qiáng)度及其與其他峰的關(guān)系可快速判斷硝酸鉀的存在和相對(duì)含量。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用分辨率逐級(jí)提高的紅外光譜、二階導(dǎo)數(shù)譜及二維相關(guān)光譜技術(shù)[12]對(duì)老鸛草中活性成分的提取分離過程進(jìn)行了分析。通過以紅外光譜法為指導(dǎo)，建立了邊分離邊分析方法。使用群峰比對(duì)和光譜相關(guān)系數(shù)對(duì)老鸛草素和硝酸鉀的走向和含量分布進(jìn)行快速分析和預(yù)測，獲得了老鸛草藥材萃取分離過程中不同水平下（從整體到部分）的整體化學(xué)指紋信息和物質(zhì)組成的變化規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)老鸛草及其衍生物等活性成分主要集中在醋酸乙酯層和正丁醇層；硝酸鉀主要集中于水層，其他層也有少量分布。老鸛草中檢測到的硝酸鉀有可能是土壤中的硝酸鉀復(fù)合肥被老鸛草吸收導(dǎo)致。

a-氯仿萃取層 b-醋酸乙酯萃取層 c-正丁醇萃取層 d-水層 e-老鸛草素 f-硝酸鉀

圖3 老鸛草丙酮提取物的4個(gè)提取層與硝酸鉀的二維同步相關(guān)紅外光譜(1800～1000 cm?1)

表2 老鸛草丙酮提取物的4個(gè)萃取層與硝酸鉀的二維相關(guān)紅外光譜(1800～1000 cm?1) 自動(dòng)峰

粗體為最強(qiáng)自動(dòng)峰；下劃線的自動(dòng)峰表示該類峰與無下劃線的自動(dòng)峰負(fù)相關(guān)

Figures in bold denote the maximum autopeaks; Figures with underline denote the corresponding peaks negatively related with other autopeaks without underline

多酚類化合物具有多個(gè)酚羥基和游離羥基，極性較強(qiáng)。以水和乙醇為提取溶劑，提取效率低，溶劑用量大，一些極性較小的成分難于被提取完全。由于鞣質(zhì)遇酸、堿，及在高溫條件下不穩(wěn)定，超聲技術(shù)可具有穿透力強(qiáng)、選擇性高等特點(diǎn)。可加快反應(yīng)速度，縮短反應(yīng)時(shí)間，超聲技術(shù)應(yīng)用于植物細(xì)胞破壁，有效地提高了收率。丙酮-水對(duì)鞣質(zhì)的提取率高，且減壓蒸發(fā)很容易將丙酮從提取液中去掉，剩下鞣質(zhì)的水溶液，因此，本實(shí)驗(yàn)采用70%丙酮進(jìn)行超聲提取。

紅外光譜[12]不僅可以對(duì)主要有機(jī)成分（鞣質(zhì)、黃酮和多糖類等）進(jìn)行檢測分析，同時(shí)可對(duì)硝酸鉀為代表的無機(jī)鹽進(jìn)行快速檢測，在中藥質(zhì)量與安全的分析評(píng)估將有廣闊的應(yīng)用前景。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國藥典 [S]. 一部. 2020: 126.

[2] 楊祎辰, 王二歡, 常暉, 等. 老鸛草的本草考證 [J]. 中國現(xiàn)代中藥, 2021, 23(5): 882-889.

[3] 李宇, 劉海華, 劉翠君, 等. 老鸛草乙醇提取物中黃酮類化合物和揮發(fā)性組分及其抗菌活性 [J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2020, 35(12): 1397-1404.

[4] Kahr?man N, Tosun G, Gen? H S,. Comparative essential oil analysis ofextracted by hydrodistillation and microwave distillation [J]., 2010,34(6): 969-976.

[5] 黨艷妮, 楊祎辰, 單娜, 等. 基于HPLC指紋圖譜的老鸛草藥材市場流通品的質(zhì)量評(píng)價(jià) [J]. 中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2022, 28(12): 36-42.

[6] 李彥希, 李曉朋, 顧健, 等. 紅外光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)鑒別美洲大蠊及其他蟲類藥材研究 [J]. 中草藥, 2020, 51(11): 3045-3050.

[7] 孫素琴, 周群, 陶家洵. 紅外光譜宏觀指紋鑒定法與中藥的質(zhì)量控制 [J]. 現(xiàn)代儀器, 2009, 15(5): 10-15.

[8] Xu X L, Zheng Y Z, Chen X C,. Identification of cattail pollen, pine pollen and bee pollen by Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation infrared spectroscopy [J]., 2018, 1167: 78-81.

[9] 孫仁爽, 金哲雄, 張哲鵬, 等. 牻牛兒苗科11種中藥材紅外光譜鑒定及聚類分析 [J]. 光譜學(xué)與光譜分析, 2013, 33(2): 371-375.

[10] 黃云先, 趙健勝, 曹云蕓. 滇老鸛草藥材鑒別方法改進(jìn) [J]. 中國民族民間醫(yī)藥, 2021, 30(9): 44-47.

[11] Sun S Q, Zhou Q , Chen J B.[M]. Bei Jing: Chemical Industry Press, 2011: 235.

[12] 謝夢迪, 田亮玉, 桂新景, 等. 近紅外光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)應(yīng)用于川貝母真?zhèn)闻c規(guī)格的快速辨識(shí)研究[J]. 中草藥, 2022, 53(8): 2490-2498.

Analysis and identification ofits extacts with different solvents by infrared spectroscopy

SUN Ren-Shuang1, ZHAO Min-jing2, GU Di-Zhou1

1. Medical College, Tonghua Normal Univetsity, Changbai Mountain Key Laboratory for natural medicine, Tonghua Normal University, Tonghua 134001, China 2. Mei he kou Food and Drug Control, Meihekou 135000, China

transform infrared spectroscopy (FT-IR) combined with second derivative spectroscopy and two-dimensional correlation infrared spectroscopy (2D-COS) were employed to identify and analyze the main components ofand its multi-level extacts. The emergence of characteristic absorption peaks (1 730, 1 618～1 445 and 1337 cm?1) of geraniin suggested thatcontained geraniin and its derivatives. By stepwisely analyzing multi-level extracts, the enrichment flow of Geraniin and its derivatives were fast acqiured. The presence and distribution profile of potassium nitrite, a precursor of potassium nitrite, were obtained as well. The correlation coefficients with geraniin of ethyl acetate portion and n-butanol portion were 0.9443 and 0.9302, The infrared spectra of the four layers ofacetone extract showed that geraniin and its derivatives were mainly concentrated in ethyl acetate portion and n-butanol portion. The characteristic absorption peaks of potassium nitrate were found in chloroform, ethyl acetate and aqueous portions. The characteristic absorption peaks of potassium nitrate were the most obvious in aqueous portion.

Maxim.; infrared spectroscopy; two-dimensional infrared spectroscopy; geraniin and its derivatives; potassium nitrate

R286.2

A

0253 - 2670(2023)13 - 4329 - 05

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.13.026

2023-02-06

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81973431）

孫仁爽，男，碩士生導(dǎo)師，博士，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制與評(píng)價(jià)。E-mail: 804590217@qq.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]