基于活性成分篩選及近紅外快檢技術的車前草含量研究

劉曉鳳 楊放 梁洪 熊毅 梁晴 袁寧謠 葉萌

文章編號：1004－5422（2023）02－0113－06

DOI：10.3969/j.issn.1004-5422.2023.02.001

收稿日期：2022-03-08

基金項目：新藥中試四川省重點實驗室開放課題（XYZS2022-22）；四川省中醫藥文化傳承與研究中心2021年度科研項目（2021Y012）；德陽市科技局計劃資助2022年度科研項目（2022SZ068）；廣西壯瑤藥重點實驗室 2020 年開放課題（GXZYKF2020-04） ；四川省科技成果轉移轉化示范項目（2023ZHCG0071）

作者簡介：劉曉鳳（1987—），女，碩士，講師，從事中藥活性成分的提取研究.E-mail：11739589@qq.com

摘要：利用網絡藥理學篩選車前草的有效活性成分，采取高效液相色譜法建立指標性成分大車前苷含量測定的方法，將含量作為參比，借助偏最小二乘回歸算法建立車前草大車前苷的定量校正模型，并對未知樣品中大車前苷含量進行預測.結果顯示，網絡藥理學篩選出排名靠前的活性成分有木犀草素、黃芩素、大車前苷、羥基木犀草素和高車前素.近紅外檢測的大車前苷定標標準偏差、相對分析誤差、交叉檢驗標準誤差、校正模型的決定系數、交叉驗證相對分析誤差和相關系數分別為0.043、7.030、0.265、0.600、1.140和0.993.本研究建立的模型檢測速度快、效率高、結果可靠，可用于車前草大車前苷的質量控制.

關鍵詞：車前草；網絡藥理學；含量測定；近紅外快檢技術；定量模型

中圖分類號：R284.1

文獻標志碼：A0引言車前草為車前科植物車前（Plantago asiatica L.）或平車前（Plantago depressa Willd.）的干燥全草，具有利尿通淋、抗菌抗炎、涼血解毒及清熱明目的功效［1］ .《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版［2］規定車前草的指標性成分為大車前苷，但其是否是車前草的有效成分還需要進一步研究.

網絡藥理學是從系統生物學的角度闡述中藥成分與疾病靶點之間關系的學科，其可闡明中藥的有效活性成分及治療疾病的作用機制，廣泛用于多種疾病、藥理及毒理的機制研究，對臨床合理用藥、發展創新藥物及發現新的適應證等可提供數據支撐.中藥具有多成分、多靶標和多通路的特點，其并不是通過單一成分預防或治療疾病，而是通過多成分共同調節發揮作用［3-6］.故采用網絡藥理學對車前草進行有效活性成分篩選可進一步為研究車前草的有效活性成分、質量控制指標及藥理作用機制提供理論依據.車前草作為常用中藥［7-9］，其應用廣泛.市場上的清寧丸、止瀉靈片、復方枇杷葉膏和廣東神曲等中成藥處方中均含有車前草.由于市場需求較大，藥材流通市場上個別原料供應商常通過摻偽或以次充好，導致藥品質量參差不齊，故對車前草進行快速檢測具有重要意義.

近紅外光譜（NIR）法是光譜衡量技術法和化學計量學技術法有效結合的二級分析法，已廣泛應用于中草藥及其產品分析中［10-13］，相較傳統分析方法而言，其具有快速、高效和無污染等優點［10］ .相關研究人員利用NIR技術對川貝母及其摻偽品進行了快速鑒別及摻偽量快速檢測［14-15］，建立了三七的質量快速評價體系等［16］.本研究以網絡藥理學技術為手段，《中國藥典》2020 年版為基準，采用NIR法對車前草制定快速檢測的方法，高效完成車前草質量分級，增加栽培、采收、加工與銷售等各環節的質量把控，以期為車前草質量控制提供參考.

1材料

1.1儀器

NIR Magic 3500型近紅外光譜分析儀（北京偉創英圖科技有限公司），DHS16-A型快速水分測定儀（上海精科實業有限公司），PCDX-J-10型超純水儀（成都品成科技有限公司），ESJ182-4型電子分析天平（沈陽龍騰電子有限公司），PS-40型超聲波清洗器（深圳得康洗凈電器有限公司），LC-2010AAT型高效液相色譜儀（日本島津公司），FW-80型萬能粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）.

1.2材料

大車前苷對照品（批號，20190122），成都科隆化學品有限公司；51批車前草原藥材（批號，CQC20201201～CQC20201251），均采自四川省德陽市，經成都大學郭曉恒副教授鑒定為車前科植物車前（Plantago asiatica L.）的干燥全草；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純.

2方法與結果

2.1網絡藥理學法

2.1.1“成分—靶點—通路”網絡的構建

采用中藥系統藥理學網絡數據庫和分析軟件、中藥分子機制生物信息學分析工具，以及中國天然產物化學成分數據庫，檢索獲得車前草有效活性成分中“化合物—靶點—通路”相互作用PPI網絡，得到 47個節點（5 個化合物節點與42 個靶點節點）及274個基因對應通路.該網絡中，每個化合物平均與8.40個靶點相互作用，每個靶點平均與6.52個疾病通路有關.因此，車前草中存在單化合物與多靶點的作用，同時也存在多化合物作用于單靶點的現象.

2.1.2GO功能富集分析

通過網絡數據庫進行GO功能富集分析研究，共得到60個GO條目（P＜0.05），分別對應生物過程（BP）、細胞組成（CC）和分子功能（MF）各20個條目，如圖1所示.2.1.3KEGG通路富集分析

同時利用網絡數據庫進行KEGG通路富集分析，共獲得前列腺癌、小細胞肺癌、膀胱癌與非小細胞肺癌等274條信號通路（P＜0.05）.其中，前列腺癌通路涉及RB1、HSP90AA1、CDKN1B、EGFR、PIK3CG、RELA、IGF1R、CASP9、NFKBIA、AR和TP53等基因；膀胱癌通路涉及CCND1、MMP1、CDK4、MMP2、ERBB2、MDM2、MAPK1、TP53、MMP9和EGFR等基因；小細胞肺癌通路涉及NFKBIA、CASP9、CDKN1B、CDK4、AKT1、PTGS2、TP53、RELA、PIK3CG和BCL2L1等基因；非小細胞肺癌涉及RB1、CASP9、CCND1、CDK4、ERBB2、MAPK1和EGFR等基因.選P值較小的前20個通路進行可視化，結果如圖2所示.

2.1.4有效成分篩選通過分析“化合物—靶點”的中心度值、親中心度值及等級值等，篩選出排名前5位的化合物依次為木犀草素、黃芩素、大車前苷、羥基木犀草素和高車前素，分別能與42、9、3、3和2個靶點蛋白發生作用.從靶點的角度分析，排名前5的靶點為AHT1、MAPK1、PIK3CG、TP53和CCND1，分別能與19、17、16、15和15個疾病通路作用［5］.上述網絡藥理學篩選結果表明，中藥是多成分與多靶點共同發揮作用的，而有效成分的含量直接影響中藥的質量.通過網絡藥理學研究可以從整體上對車前草成分進行理論篩選，為后續含量研究提供參考.網絡藥理學研究結果驗證了《中國藥典》2020年版規定車前草的指標性成分為大車前苷具有合理性，可通過對車前草中大車前苷的含量對其質量進行控制.

2.2NIR法

采用高效液相色譜（HPLC）法建立車前草中的指標性成分大車前苷含量測定的方法，將含量作為參比，借助偏最小二乘回歸算法建立車前草中大車前苷的定量校正模型，并對未知樣品中大車前苷含量進行預測.

2.2.1HPLC色譜條件

色譜柱為Supersil ODS2 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-0.1%甲酸溶液（17∶83）為流動相；檢測波長為330 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為25 ℃；進樣量為10 μL.理論板數按大車前苷峰計算應不低于3 000.

2.2.2對照品溶液制備

取大車前苷對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加60%甲醇制成每1 mL含0.1 mg的對照品溶液，備用.

2.2.3供試品溶液制備

將車前草樣品干燥后，粉碎過2號篩，取樣品粉末約0.5 g，精密稱定， 置于50 mL錐形瓶中，加入 60%甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理（溫度30 ℃，頻率300 W，功率50 kHZ） 40 min，放冷，再次稱定質量，用 60%甲醇補足減失的質量，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，取續濾液作為供試品溶液.

2.2.4方法學考察

1）系統適用性試驗.精密吸取“2.2.2”項下對照品溶液與“2.2.3”項下供試品溶液各10 μL，按照“2.2.1”項下色譜條件進行測定.結果表明，供試品溶液與對照品溶液的保留時間一致，分離度均大于1.5.

2）本研究已經進行線性、儀器精密度、穩定性、重復性和加樣回收試驗，結果均符合相關要求.

2.2.5樣品測定

按照“2.2.3”項下制備51批車前草供試品溶液，精密吸取10 μL，按照“2.2.1”項下色譜條件進行測定，HPLC圖譜如圖3和圖4所示，結果見表1.圖譜將采用HPLC法測得的含量作為參比，借助偏最小二乘回歸算法建立車前草中大車前苷的定量校正模型，并對未知樣品中大車前苷含量進行預測.

2.2.6車前草NIR模型的建立

從51批車前草樣品中隨機選取CQC20201201、CQC20201205、CQC20201209、CQC20201215、CQC20-?201221、CQC20201225、CQC20201230、CQC202012-?35、CQC20201241和CQC20201248共10批車前草樣品作為驗證集樣.余下41批次車前草作為校正集樣.

2.2.7車前草NIR圖譜采集

將 NIR分析儀開機預熱30 min，將41批車前草粉末樣品（過2號篩）放入樣品袋中，壓實樣品直至不松動，再把樣品袋對準垂直的儀器進行測定.儀器基線噪聲值 0.000 01，光源能量值 35 927，基線重復性值 0.000 1，波長準確性值 0.402，波長重復性值 0.002，吸光度重復值 0.000 1，測量模式均為正常［12］.光譜掃描時，參比為儀器內置背景，掃描次數 32 次，分辨率值為 8 cm-1，掃描范圍為 900～1 800 cm-1［13］. 41批車前草樣品NIR原始疊加圖譜如圖5所示.圖541批車前草樣品NIR原始疊加圖譜2.2.8光譜預處理

光譜預處理應選擇最適合的方法，這樣不僅能除去噪聲的干擾，還能減少雜光、散光及樣品物理狀態等因素對模型準確性的影響.本研究所用的化學計量學分析軟件V2.6.1.0具有多種光譜預處理的方法，例如，消除常數偏移量、矢量歸一化和一階導數等［14］.本研究對疊加光譜圖進行了前處理和波段選擇，消除了噪聲比較大的波段，結果如圖6所示.圖641批車前草樣品NIR精簡圖譜2.2.9校正模型的建立

利用化學計量學分析軟件V2.6.1.0的優化功能完成模型的構造，做完內部交叉檢驗，從而確定一定參數作為指標性參考，包括系數、內部交叉驗證均方差和相對分析誤差等，獲得車前草中大車前苷最優的校正模型.本研究把41份校正集車前草樣品的NIR圖譜和HPLC法測定值運用偏最小二乘回歸算法擬合，使用留一法進行內部交互驗證，從而達到模型驗證，得到模型的主因子數，確定車前草中大車前苷含量的定量模型，將含量預測值與真實值進行比較.結果如圖7所示.圖7車前草中大車前苷定量模型校正曲線初步建立的車前草中大車前苷定量校正模型方程式為Y=0.99X+0.01，R2=0.993，表明模型準確性高.采用交叉驗證標準誤差和相關系數等相關數據對模型的優缺點進行客觀評價.其中，定標標準偏差、相對分析誤差、交叉檢驗標準誤差、校正模型的決定系數、交叉驗證相對分析誤差和相關系數分別為0.043、7.030、0.265、0.600、1.140和0.993.

2.2.10模型驗證

取驗證集樣品10批，利用已建立的定量模型進行外部交叉驗證，如圖8所示.圖8車前草大車前苷定量模型外部驗證結果獲得預測的結果方程式為Y=0.992 05X+1.134 57，R2=0.998 4，結果證明預測值與參考值相關性接近，所建定量模型穩定可靠，可用于車前草樣品中大車前苷含量的快速檢測，具體結果見表2.

目前，多數中藥有效成分不明，作用機制不清，其現行質量標準中測定的成分不能確定是指標性成分還是有效成分，這為中藥質量控制帶來了一定的難度.現代研究指出，中藥及其復方制劑具有多成分、多靶點與多通路的特點，多個成分共同協調發揮藥效作用［17-18］.本研究通過網絡藥理學對車前草的成分和相關通路進行分析，篩選出排名靠前的5種成分中包括《中國藥典》2020年版中規定車前草的指標性成分大車前苷，從而驗證了該指標測定的必要性與重要性.

本研究建立的NIR快檢技術，能夠快速、準確地進行現場質量評價，樣品處理操作簡單，在不耗損樣品的情況下可對車前草中大車前苷進行高效率、精準和穩定地測定.在車前草成熟期采收及銷售現場即可滿足產品等級的劃分，可以減少質量把關不足的缺點，同時減少檢測時間，提高工作效率.

本研究建立了車前草中大車前苷快速檢測模型，用已建立的定量模型進行外部交叉驗證，預測的結果與《中國藥典》2020年版中的方法測定值較為接近.NIR快速測定為間接分析法，其準確性與大量有代表性的樣品的數量密切相關，因此為了確保測定的準確性及穩定性，應該要提高各地區的樣本數量，對不同產地與不同階段的車前草應重新建立對應的模型.

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Study on Plantaginis Herba Content Based on Active Ingredient Screening and Near-Infrared Rapid Detection Technology

LIU Xiaofeng1，YANG Fang2，LIANG Hong1，XIONG Yi1，LIANG Qing1，YUAN Ningyao1，YE Meng3

（1.Private Sichuan Tianyi College，Deyang 618213，China;2.Chengdu Tianhe Traditional Chinese and Western Medicine Science and Technology Conservation Co.，Ltd.，Chengdu 510000，China;3.School of Pharmacy，Chengdu University，Chengdu 610106，China）

Abstract：

The active ingredients in Plantaginis herba were studied by using cyber pharmacology.The HPLC method was used to establish the method to determine the content of the index component psyllium.The content was used as a reference to establish a quantitative correction model of Plantaginis herba with the help of a partial least squares regression algorithm，and to predict the content of Plantaginis herba in unknown samples.The results of network pharmacology screened out the top active ingredients luteolin，skullcap，planin，hydroxylubelin and hispidulin.Standard deviation of psyllium epigride calibration，relative analysis error，standard error of cross-examination，coefficient of decision of the corrected model，cross-validation relative analysis error and correlation coefficient were 0.043，7.030，0.265，0.600，1.140 and 0.993.It could be concluded that the qualitative model established in this study was fast，efficient and reliable，and could be used for the quality control of Plantaginis herba psyllodyl.

Key words：

Plantaginis herba;cyber pharmacology;content determination;near-infrared rapid detection technology;quantitative models