香萱解郁方對(duì)血清剝奪誘導(dǎo)HT22細(xì)胞損傷模型的神經(jīng)保護(hù)作用*

高圓媛 沙中瑋 薛純純 徐建 李歐

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院,上海 200071)

海馬神經(jīng)元細(xì)胞在體外的存活取決于營(yíng)養(yǎng)因子的存在和條件血清提供的去極化條件。從培養(yǎng)基中去除血清(Serum deprivation,SD)會(huì)導(dǎo)致延遲性神經(jīng)元死亡,其特征是神經(jīng)元凋亡[1]。目前,HT22細(xì)胞被認(rèn)為是研究體外神經(jīng)細(xì)胞死亡的良好模型[2]。細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育離不開生長(zhǎng)因子等因素的影響,而血清剝奪是導(dǎo)致缺血缺氧的直接原因[3]。缺血缺氧所致腦組織及神經(jīng)元損傷的機(jī)制復(fù)雜,因此探尋治療腦缺血性疾病的有效療法至關(guān)重要。香萱解郁方為上海市中醫(yī)醫(yī)院神志病科學(xué)科帶頭人徐建教授的臨床經(jīng)驗(yàn)方,常用于治療神經(jīng)退行性疾病,前期研究[4-5]發(fā)現(xiàn)該方能夠提高大鼠外周血清中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)水平,改善海馬突觸結(jié)構(gòu)及形態(tài)。本研究探討香萱解郁方含藥血清對(duì)體外缺血缺氧HT22細(xì)胞損傷模型的神經(jīng)保護(hù)作用,以期為本方在臨床中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與HT22細(xì)胞系 選取SPF級(jí)雄性SD大鼠30只,體質(zhì)量190 g,購(gòu)自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(滬)2018-0004,合格證號(hào):20180004027603,飼養(yǎng)于上海市中醫(yī)醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,自由飲水?dāng)z食,溫度控制在24±2 ℃,相對(duì)濕度40%～50%。HT22細(xì)胞系為小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系,由上海圓創(chuàng)生物科技有限公司提供。該實(shí)驗(yàn)方案已通過上海市中醫(yī)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理倫理安全委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試驗(yàn)藥物 香萱解郁方飲片由上海市中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供(組成:香附200619、萱草花DB43/1452-2018、砂仁200611、梔子20041305、合歡皮20051807、遠(yuǎn)志2020071401、肉桂 200703、廣郁金 20071405、首烏藤 20200529-1、丹參 20061708、炙甘草 20200718-1)。將飲片共1310 g加入10倍的純水中浸泡30 min,大火煮沸后繼續(xù)文火煎煮40 min,過濾,倒出;藥渣再加5倍純水煮沸后文火煎煮30 min,后放入砂仁續(xù)煎10 min,過濾;將兩次藥液混勻,灌胃劑量按1 kg 大鼠灌胃10 mL 計(jì)算,中藥量13.65 g/kg·d,濃縮至生藥量濃度1.365 g/mL 的藥汁,灌裝滅菌,于4℃ 冰箱貯存?zhèn)溆?灌胃之前以溫水隔加熱。

1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(上海敦石實(shí)業(yè),3111);微型臺(tái)式真空泵(上海凡茂生物,BGZ-70);倒置熒光顯微鏡(上海金甚生物,DMI3000B);干式恒溫機(jī)(上海志行儀器,GL-150B);電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海升意實(shí)業(yè),GHP-9160);離心機(jī)(上海百翱杰生,L530R);臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(上海力申科學(xué)儀器有限公司,Neofuge 15R);酶標(biāo)儀(上海百翱杰生,Epoch 2);三恒多用電泳儀電源(上海凡茂生物,DYY-12);Mini ProGelTM蛋白制膠與電泳系統(tǒng)(Servicebio,BT-2);ChemiDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海伯樂,721BR07743);PCR儀(伯樂,CFX96)。

1.4 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基(凱基生物,KGM 12800-500);胎牛血清(Servicebio,G8001-100ML);胰酶溶液-EDTA(hanks液,含酚紅)(凱基生物,KGM25200);Penicillin-Streptomycin Solution,100X(生工,GA23FA0001);CCK8試劑盒(ZETA LIFE,K009-1000T);β-tubulin Ⅲ抗體(Abcam,ab18207);DAPI(博士德,AR1176);山羊抗兔IgG (Abcam,ab150077);BDNF抗體(Abcam,ab108319);抗兔IgG-HRP (CST,#7074),β-actin (CST,#4970)。引物合成(上海生工);RNA提取液 (Servicebio,G3013-100ML);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (YEASEN, 11141ES10);PCR試劑盒(YEASEN,11198ES03)。

1.5 方法

1.5.1 含藥血清制備 將SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、中藥組各15只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,開始灌胃,對(duì)照組予以0.9%生理鹽水,中藥組予以香萱解郁方,兩組均受到相同的灌胃刺激,而后提取生理鹽水血清和中藥血清對(duì)HT22細(xì)胞進(jìn)行分組干預(yù)。灌胃前藥液需水浴加熱,避免刺激。灌胃前稱重,按1 mL/100 g大鼠體質(zhì)量灌胃,持續(xù)8 d,1次/日。灌胃結(jié)束后,禁食12 h,以減少胃內(nèi)容物。第2 d腹腔注射舒泰50麻醉大鼠后腹主動(dòng)脈取血后處死,冰上靜置4 h,于4 ℃低溫離心機(jī)3000 rpm離心15 min,將各組含藥血清裝于15 mL滅菌離心管,于56 ℃水浴鍋中水浴30 min,0.22 μm微孔濾膜過濾除菌,分裝于1.5 mL EP管,-80 ℃保存。

1.5.2 血清剝奪模型建立及分組 HT22細(xì)胞系培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、80 U/mL青霉素、0.08 mg/mL鏈霉素的DMEM高糖完全培養(yǎng)基中,鏡下細(xì)胞呈片狀生長(zhǎng)。首先,制備含藥血清培養(yǎng)基,把含有10%胎牛血清完全培養(yǎng)基中的10%胎牛血清更換為上述制備的0.9%生理鹽水血清和15%、20%濃度中藥血清。其次,將體外培養(yǎng)的HT22細(xì)胞系隨機(jī)分為:對(duì)照組、模型組和中藥組,中藥組又分為中藥組A(含藥血清15%濃度)與中藥組B(含藥血清20%濃度)。血清剝奪處理方法:首先,用含有10% 胎牛血清完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h,待細(xì)胞貼壁后,先用PBS溶液清洗2次,每次1～2 min, 充分去除血清影響,再用不含血清的DMEM高糖培養(yǎng)基剝奪12 h,建立血清剝奪模型。各組均血清剝奪12 h后,對(duì)照組用含0.9%生理鹽水血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),模型組繼續(xù)用不含血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),中藥組A、中藥組B分別使用含15%、20%濃度中藥血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),以上4組分別培養(yǎng)12、24、36 h后進(jìn)行對(duì)照比較,通過細(xì)胞活性檢測(cè),確定后續(xù)試驗(yàn)中藥組含藥血清的最佳濃度。

1.5.3 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活性 HT22小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞以5×104/mL接種于96孔板,配置100 μL細(xì)胞懸液,在培養(yǎng)箱中(37 ℃,5%CO2條件下)培養(yǎng)24 h,剝奪處理12 h后,除模型組持續(xù)血清剝奪,對(duì)照組和中藥組分別加入0.9%生理鹽水血清、15%和20%中藥含藥血清后分別培養(yǎng)12、24、36 h,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔,于相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)每孔中加入10 μL CCK溶液,于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h,用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度(optical density,OD),并記錄結(jié)果。細(xì)胞活力%=[(OD加藥組)-(OD空白對(duì)照組)]/[(OD0加藥物)-(OD空白對(duì)照組)]×100%。

1.5.4 免疫熒光染色法定位及鑒定 HT22小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞以每孔1.5×105/mL鋪于24孔板中,每孔接種200 μL,10%胎牛血清完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,24 h后各組改用無血清培養(yǎng)基饑餓12 h,除模型組,對(duì)照組、中藥組每孔分別加入含生理鹽水血清、15%中藥含藥血清200 μL,培養(yǎng)36 h。PBS沖洗,用4%多聚甲醛室溫固定15 min后PBS沖洗5 min×2次。每孔加入500 ul 的0.5%TritonX-100 通透被膜,室溫孵育10 min,PBS洗滌5 min×2次。用PBST(1% BSA、22.52 mg/mL甘氨酸)室溫下封閉孵育30 min。室溫下,用一抗Anti-β Ⅲ Tubulin抗體(1∶1000)4 ℃孵育過夜。PBS沖洗5 min×3次。滴加二抗(1∶1000)避光室溫孵育1 h。PBS沖洗5 min×3次。DAPI(避光)孵育10 min,PBS沖洗。在熒光顯微鏡下觀察HT22細(xì)胞核形態(tài)及β- 微管蛋白Ⅲ型定位表達(dá),并拍照。

1.5.5 Western blot法檢測(cè)BDNF蛋白表達(dá) 收集經(jīng)各組細(xì)胞,加入 100 μL 含 0.01 mol /L PMSF 的 RIPA 裂解液,裂解細(xì)胞30 min,在冰上裂解,利用細(xì)胞刮收集細(xì)胞,轉(zhuǎn)移至 1.5 mL EP 管中,在冰上操作,4 ℃ 條 件 12000 r/min 離心 30 min,收集上清,使用 BCA 蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。每組取 20 μg上樣,進(jìn)行蛋白電泳,利用濕轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜,用快速封閉液室溫封閉1 h,加入Anti-BDNF antibody (1∶1000),在4 ℃冰箱孵育過夜, PBST洗滌雜交膜3次,每次8 min、8 min、8 min,加入 HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG 二抗(1∶8000) ,HRP 標(biāo)記的山羊抗兔 IgG(1:2000),室溫孵育1 h, PBST 洗滌雜交膜3次,每次8 min,使用 ECL 試劑盒進(jìn)行發(fā)光反應(yīng),Image J進(jìn)行灰度分析,獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.6 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)BDNF mRNA的表達(dá)水平 使用RNA試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA,測(cè)定RNA濃度,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,反轉(zhuǎn)錄1 μg,體系20 μL,條件為25 ℃ 5分鐘,55 ℃ 15 min,85 ℃ 5 min。結(jié)束后,取出離心管,先將各引物按照說明書上的要求,使用DEPC水稀釋至10 μM的濃度,配制反應(yīng)體系。后進(jìn)行RT-qPCR,體系20 μL,程序設(shè)置:預(yù)變性95 ℃、2 min、一個(gè)循環(huán),變性95 ℃、10 s,退火60 ℃、30 s共40個(gè)循環(huán)。程序結(jié)束后進(jìn)行數(shù)值的計(jì)算與分析。數(shù)據(jù)用2-△△CT方法進(jìn)行分析[6]。引物序列,見表1。

表1 各轉(zhuǎn)錄因子引物序列Table 1 Primer sequences of qPCR

2 結(jié)果

2.1 不同濃度香萱解郁方含藥血清對(duì)HT22細(xì)胞活性的影響 經(jīng)重復(fù)測(cè)量方差分析不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞活力比較結(jié)果顯示,在加藥后12 h,對(duì)照組與模型組的細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),中藥組A、B的細(xì)胞活力明顯高于對(duì)照組與模型組(P<0.001)。培養(yǎng)24 h,與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞活力明顯下降(P<0.001),中藥組A、B比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);中藥組A、B均較模型組明顯提高(P<0.001)。培養(yǎng)36 h,與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞活力組顯著下降(P<0.001),中藥組A細(xì)胞活力明顯升高(P<0.05),中藥組B差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);中藥組A、B較模型組均明顯提高(P<0.001)。當(dāng)含藥血清藥物濃度達(dá)15%時(shí),明顯提高血清剝奪后細(xì)胞的存活率,故將該濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中藥組的藥物濃度,見表2、圖1。

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)不同濃度含藥血清對(duì)血清剝奪HT22細(xì)胞活力的影響Figure 1 Effects of cell viability of serum deprivation HT22 cells by serum containing different concentration of drugs at different times

表2 不同濃度含藥血清對(duì)血清剝奪HT22細(xì)胞活力的影響Table 2 Effects of cell viability of serum deprivation HT22 cells by serum containing different concentration of drugs

2.2 免疫熒光染色法檢測(cè)15%濃度中藥含藥血清作用后HT22細(xì)胞分化情況 通過DAPI和β-微管蛋白Ⅲ型的免疫染色倒置熒光顯微鏡下觀察并定位細(xì)胞核及神經(jīng)元形態(tài)。結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組少數(shù)神經(jīng)元長(zhǎng)出突起;與模型組比較,中藥組HT22神經(jīng)元軸突突起長(zhǎng)度和分支增加,神經(jīng)元特異性微管蛋白陽性表達(dá)明顯增多。見圖2。

圖2 各組HT22細(xì)胞血清剝奪后培養(yǎng)24 h后海馬神經(jīng)元的形態(tài)(200×)Figure 2 Cellular morphology of HT22 cells cultured in serum-containing medium for another 24 h after serum deprivation注:藍(lán)色:DAPI染色標(biāo)記細(xì)胞核;綠色:β-微管蛋白Ⅲ型標(biāo)記的HT22細(xì)胞分化神經(jīng)元細(xì)胞(比例尺=75 μm,見圖右下角)。

2.3 15%濃度中藥含藥血清對(duì)HT22細(xì)胞BDNF蛋白及其mRNA表達(dá)的影響 Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組BDNF表達(dá)下降(P<0.05);與模型組比較,中藥組BDNF表達(dá)上升(P<0.05)。qPCR法檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組BDNF mRNA水平顯著下調(diào)(P<0.001);與模型組比較,中藥組BDNF mRNA水平顯著上調(diào)(P<0.05)。見圖3、表3。

圖3 各組HT22細(xì)胞中BDNF蛋白表達(dá)比較Figure 3 Comparison of BDNF protein expression in HT22 cells of each group

表3 各組HT22細(xì)胞中BDNF蛋白表達(dá)水平Table 3 Expression levels of BDNF in HT22 cells of each group

3 討論

缺血缺氧誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞損傷,甚至壞死凋亡[8-9],是許多腦血管及神經(jīng)退行性疾病的病理機(jī)制。神經(jīng)元細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)重要的組成部分,是高度極化的細(xì)胞,由胞體和突起組成,大腦功能依賴于大量神經(jīng)元之間的相互作用[10]。神經(jīng)突的丟失是神經(jīng)元損傷的常見原因,是神經(jīng)元疾病治療的靶點(diǎn)[11]。盡量減少腦缺血后神經(jīng)元樹突棘和突觸可塑性的損傷對(duì)維持神經(jīng)元功能至關(guān)重要[12]。HT22細(xì)胞是由HT-4細(xì)胞系克隆而來的永生化小鼠海馬細(xì)胞系,具有海馬神經(jīng)元的某些特性和易于培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn),目前廣泛應(yīng)用于神經(jīng)退行性疾病的研究[13-15],在包括缺血缺氧環(huán)境下造成的神經(jīng)退行性疾病或神經(jīng)損傷模型中,海馬神經(jīng)元細(xì)胞被認(rèn)為是增強(qiáng)神經(jīng)保護(hù)、刺激神經(jīng)可塑性、修復(fù)神經(jīng)元丟失的關(guān)鍵細(xì)胞。有研究[16]表明,血清剝奪能夠誘導(dǎo)海馬HT22細(xì)胞呈凋亡和自噬特征的死亡。目前研究[17]表明中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)損傷大多是不可逆轉(zhuǎn)的,修復(fù)神經(jīng)元細(xì)胞損傷非常困難,有效的治療藥物很少,中醫(yī)藥一直致力于對(duì)神經(jīng)修復(fù)及保護(hù)作用的藥物研究與開發(fā)。

“香萱解郁方”是上海市中醫(yī)醫(yī)院中醫(yī)神志病學(xué)科帶頭人徐建教授臨床治療經(jīng)驗(yàn)方,該方組成包括香附、萱草花、砂仁、梔子、合歡皮、遠(yuǎn)志、肉桂、廣郁金、首烏藤、丹參、炙甘草。方中君藥香附、萱草花、砂仁,香附主入肝經(jīng),辛香行氣,善疏肝郁之結(jié),味苦疏泄,平肝之橫逆,故可以開胸中之郁結(jié),理不順之氣,氣行則郁消。明·李時(shí)珍《本草綱目》記載香附可“利三焦,解六郁;乃氣病之總司,女科之主帥也”。萱草花,又名“忘憂草”,《本草綱目》云其可“寬胸膈 ,安五臟 ,安寐解郁 ,清熱養(yǎng)心”,與香附共奏疏肝解郁之功。砂仁,氣味芬芳,辛散溫通,是調(diào)胃醒脾的要藥。《本草綱目》中記載砂仁:“補(bǔ)肺醒脾,養(yǎng)胃益腎,理元?dú)?通滯氣,散寒飲脹痞,噎膈嘔吐”。砂仁可溫脾理氣化濕,改善脾胃功能,調(diào)節(jié)氣機(jī)升降,從而調(diào)理肝氣,調(diào)節(jié)情緒。君藥以花(萱草花)、果(砂仁)、根(香附)同用,合用安五臟,解諸郁,共奏疏肝醒脾,解表宣郁,疏利三焦之功。梔子、廣郁金、丹參清熱除煩,行氣解郁,活血去瘀;遠(yuǎn)志、肉桂交通心腎,引火歸元,共為臣藥。佐以合歡皮、首烏藤養(yǎng)心安神,活血通絡(luò);炙甘草為使藥,調(diào)和諸藥。臨床中該方加載治療應(yīng)用于睡眠障礙、血管性認(rèn)知功能障礙及情緒障礙等疾病,具有一定的臨床療效。

本研究通過血清剝奪建立HT22細(xì)胞的缺血缺氧環(huán)境,應(yīng)用CCK8檢測(cè)血清剝奪后HT22細(xì)胞活力以及比較中藥含藥血清對(duì)其不同時(shí)間點(diǎn)的影響。結(jié)果表明,隨著剝奪時(shí)間的延長(zhǎng),中藥組和模型組細(xì)胞活力逐漸下降,剝奪24、36 h模型組細(xì)胞活力下降50%以下。不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞活力比較結(jié)果顯示,在加藥后12 h,對(duì)照組與模型組的細(xì)胞活力無差異,中藥組A、B的細(xì)胞活力明顯高于對(duì)照組與模型組。培養(yǎng)24 h,與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞活力明顯下降,中藥組A、B無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;中藥組A、B較模型組明顯提高。培養(yǎng)36 h,與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞活力組顯著下降,中藥組A細(xì)胞活力明顯升高,中藥組B差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;中藥組A、B較模型組明顯提高。提示15%香萱解郁方含藥血清能夠明顯提高血清剝奪后的細(xì)胞活力。

βⅢ-Tubulin蛋白是微管細(xì)胞骨架的一種重要蛋白,廣泛應(yīng)用于成熟神經(jīng)元骨架細(xì)胞的標(biāo)記,主要表達(dá)在神經(jīng)元中,能夠使神經(jīng)元軸突形態(tài)可視化[13,18]。本研究通過免疫熒光染色法觀察香萱解郁方對(duì)血清剝奪HT22細(xì)胞軸突及分化的影響,我們發(fā)現(xiàn)模型組少數(shù)神經(jīng)元長(zhǎng)出突起,中藥組HT22神經(jīng)元軸突突起長(zhǎng)度和分支增加,中藥含藥血清對(duì)神經(jīng)元突觸可塑性的變化有待進(jìn)一步的探究。以往研究[19-20]表明,BDNF在突觸傳遞和神經(jīng)元可塑性中起著多種作用。BDNF是一種調(diào)節(jié)突觸連接、突觸結(jié)構(gòu)、神經(jīng)遞質(zhì)釋放和突觸可塑性的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素[21-22],具有神經(jīng)保護(hù)作用,對(duì)于維持神經(jīng)元存活和神經(jīng)元結(jié)構(gòu)至關(guān)重要,在促進(jìn)神經(jīng)突觸生長(zhǎng)和修飾細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮作用[23-24]。我們繼續(xù)觀察BDNF蛋白在HT22細(xì)胞缺血缺氧損傷中的表達(dá)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,模型組BDNF蛋白及其mRNA表達(dá)明顯下降,中藥組能夠提高BDNF蛋白及其mRNA表達(dá),提示香萱解郁方含藥血清可能通過增加內(nèi)源性BDNF含量調(diào)節(jié)神經(jīng)元形態(tài)及軸突生長(zhǎng)。

4 結(jié)論

血清剝奪能夠誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷,初步驗(yàn)證香萱解郁方含藥血清可能通過調(diào)節(jié)BDNF水平促進(jìn)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng),增強(qiáng)神經(jīng)元細(xì)胞活力,以達(dá)到對(duì)神經(jīng)元損傷的保護(hù)及調(diào)節(jié)可塑性的作用,但該方的作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。