H3型組胺受體在結直腸癌中作用研究

邊振遠, 王鑫宇, 張 成

北部戰區總醫院 普通外科,遼寧 沈陽 110016

結直腸癌是一種高度惡性腫瘤,其發病率和病死率分別排在腫瘤的第3位和第4位[1-2]。目前,針對結直腸癌的藥物治療手段比較缺乏,有待進一步開發。有研究報道,組胺作為一種內源性胺類物質,結合相應的組胺受體可以作用于腫瘤細胞的增殖,目前,已經發現的組胺受體包括H1、H2、H3、H4型組胺受體4種,組胺通過與這些不同的受體結合會發揮不同的作用[3]。人HRH3基因定位于第20號染色體,編碼的蛋白由446個氨基酸組成[4]。有學者發現,H3型組胺受體(H3 histamine receptor,H3HR)具有調控腫瘤細胞增殖和遷移的作用[5]。有研究證實,肝細胞肝癌、膽管細胞癌、黑色素瘤、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤組織中的H3HR表達水平顯著增高[6-11]。本研究旨在探討H3HR在結直腸癌中的作用?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人結直腸癌組織和癌旁組織樣本來自于北部戰區總醫院普通外科。胎牛血清購自Gibco公司;RPMI1640培養基及0.25%胰酶由課題組專業技術人員配置;二甲基亞礬購自SIGMA公司;酒精(無水乙醇、75%乙醇)購自天津市富宇精細化工有限公司;光學顯微鏡購自OLYMPUS,全自動酶標儀(BIO-RAD550)購自美國bio-rad公司,離心機購自Thermo;EDU試劑購自廣州銳博生物科技有限公司;H3HR干涉片段由吉瑪基因公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組及干涉片段轉染 (1)組織樣本按照結直腸癌和癌旁組織分為10對。(2)將傳代好的人結腸癌細胞HCT-116細胞分入siCtrl組和siH3HR組。siH3HR組接種細胞于6孔板中。用無血清培養基配制lip2000混合液,室溫靜置5 min;再用無血清培養基配制干涉片段混合液。將兩種混合液混勻后靜置25 min,分別加入到相應的6孔板中,正常條件下培養(37℃,5%CO2),再進行干涉片段的轉染。

1.2.2 EDU實驗 (1)接種細胞：將常規處理過的siCtrl組、siH3HR組細胞消化離心后以適宜密度種于24孔板中,于37℃、5%CO2培養24 h。(2)EDU標記細胞：制備50 μm EDU培養基并加入24孔板中,孵育2 h后用PBS清洗。(3)細胞固定化：加入含4%多聚甲醛的PBS,室溫脫色搖床孵育30 min,然后用2 mg/ml甘氨酸溶液中和,繼續加入PBS清洗,清洗結束后加入含0.5%TritonX-100的PBS,室溫脫色搖床孵育10 min,最后用PBS清洗。(4)EDU反應：于24孔板中加入1×Apollo?反應液孵育30 min,然后加入含0.1%TritonX-100的PBS,重復2次,每次10 min。(5)DNA染色：配制適量1×Hoechst33342反應液并加入24孔板中,避光孵育30 min,再用PBS清洗,重復2次,每次10 min。(6)熒光顯微鏡獲取圖像進行分析。

1.2.3 細胞劃痕實驗 (1)接種細胞：將常規處理過的siCtrl組、siH3HR組細胞消化離心后種于6孔板中(密度為500個細胞),37℃、5%CO2培養24 h。接種細胞前用marker筆在6孔板背面畫線標記。(2)細胞劃痕：用20 μl中槍頭垂直于孔板制造劃痕,再用無血清培養基清洗劃痕產生的細胞碎片。(3)觀察拍照：加入無血清培養基,顯微鏡下觀察并拍照,記錄0、24、48 h的作用效果圖。

2 結果

2.1 結直腸癌和癌旁組織H3HR表達水平比較 在10對結直腸癌和癌旁組織中,結直腸癌組織中H3HR表達水平高于癌旁組織。見圖1。

2.2 H3HR干涉對siH3HR組、siCtrl組細胞增殖能力影響比較 H3HR干涉后,siH3HR組細胞增殖能力低于siCtrl組(P<0.05)。見圖2。

2.3 H3HR干涉對HCT-116細胞遷移能力影響 干涉降低H3HR表達后,HCT-116細胞遷移能力下降(P<0.05)。見圖3。

圖1 結直腸癌和癌旁組織H3HR表達水平比較(T表示腫瘤,N表示癌旁)

3 討論

HRH3可在惡性腫瘤的發生和發展過程中發揮調控作用[4,12]。Szabo等[12]發現,腎上腺皮質瘤中HRH3呈顯著高表達。Cricco等[13]報道,組胺可通過結合H3和H4型組胺受體對胰腺癌細胞的生長發揮調控作用。朱劍軍等[14]研究表明,H3HR通過調控偽足形成在結直腸癌中參與腫瘤遷移。惡性腫瘤細胞系和腫瘤組織中均存在著高內源性組胺,其可通過旁分泌或自分泌的方式釋放到細胞間隙中,從而作用于腫瘤發生和發展的各個階段。本研究中,Western Blot檢測結果顯示,結直腸癌組織中H3HR表達水平高于癌旁組織。這提示,組胺可能通過作用于H3HR調控結直腸癌的發生和發展。在后續實驗中,通過構建H3HR表達干涉載體降低H3HR在結直腸癌細胞系中的表達后發現,H3HR表達降低后,HCT-116細胞遷移能力下降(P<0.05)。這提示,在結直腸癌中,組胺通過H3HR促進結直腸癌細胞的增殖和轉移。

圖3 H3HR干涉對HCT-116細胞遷移能力影響

本研究存在一定的不足：僅在細胞系中進行了干涉實驗,降低H3HR表達后,HCT-116細胞的增殖和遷移能力出現顯著下降,但對組胺通過H3HR產生促腫瘤增殖、遷移效應的具體機制并未進行深入研究。

綜上所述,H3HR與結直腸癌細胞的增殖和遷移相關,這為以H3HR為靶點的結直腸癌藥物開發提供了理論基礎。