不同營養類型培養基番茄內生細菌群落結構研究

張澤宇　肖揚　詹亞斌　魏雨泉　徐道清　李季

摘要：通過采用Biolog EcoPlate 培養、16S r RNA基因高通量測序技術等方法研究不同培養基上植物內生細菌群落結構的組成差異，探究不同培養基等營養條件對番茄內生細菌群落結構的影響。結果表明：（1）4種培養基上生長的內生菌群在Biolog EcoPlate 微平板培養96 h 后，菌群生長達到穩定期，且在牛肉膏蛋白胨（NA）培養基下菌群代謝活性較高。R2A培養基下菌群代謝活性較低。（2） 番茄內生微生物組包括檸檬酸桿菌屬（Citroebacteria）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、鞘脂單胞菌（Sphingbacterium）、布克氏菌屬（Burkholderia）。（3）LB、TSA培養基分離到的內生菌多為芽孢桿菌屬；在NA、R2A培養基中番茄內生菌組成多為檸檬酸桿菌、芽孢桿菌、鞘脂單胞菌、布克氏菌，為優勢菌種。（4）NA培養基中番茄內生微生物組香農指數高于其他處理（P<0.05）差異；PCoA分析顯示4種培養基中番茄內生細菌群落結構具有差異（P<0.05）。（5）網絡分析發現NA、R2A培養基中番茄內生細菌微生物組模塊化水平更高，而且網絡拓撲性更高。（6）LEfSe分析發現，LB富集的物種為芽孢桿菌，NA培養基富集物種多為假單胞菌（Pseudomonas），R2A培養基富集物種多鞘脂單胞菌，TSA培養基富集物種多布克氏菌屬。 本研究通過高通量測序分析不同營養類型培養基對番茄內生微生物組群落結構的影響，對于生產中通過利用營養條件調控植物內生菌群群落結構組成及靶向篩選有益微生物具有重要的指導意義。

關鍵詞：培養基；營養條件；Biolog EcoPlate微平板；16S rRNA基因高通量測序；內生菌群

中圖分類號：S182文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2023）11-0128-05

植物內生菌是指真菌和細菌在某個生活階段能夠進入活體植物組織內，并且在植物組織內不引起顯著變化的一類微生物［1］。植物內生菌主要來源于土壤微生物，或者大氣中的微生物通過植物氣孔、自然傷口進入植物組織內。內生細菌作為一類特殊的微生物，與植物宿主一同演化共生，但不引起宿主的明顯癥狀，所處環境穩定，營養來源豐富、可靠［2］。研究表明，植物內生菌產生的次生代謝產物，如各類型保護酶、生長素等物質，可以調節植物代謝，幫助植物抵御逆境脅迫，促進植物生長，具有良好的生態功能［3］。

植物內生菌是一類多樣性十分豐富的微生物類群，與宿主存在協同進化關系［4］，隨著研究領域的不斷擴寬和研究方法的改進，探尋植物內生菌的最適營養條件成為當下植物與微生物互作研究的熱點領域之一［5］。自然生長環境下有很多因素均可以影響植物內生菌的組成結構，如碳源、氮源、根系分泌物等關鍵營養因子［6-7］。內生菌群與植物之間的相互作用對植物的各項生命活動具有重要影響，如促進植物生長、防止病原微生物的侵害［8-10］等。

隨著高通量測序技術的發展和微生物組研究的深入，越來越多的模式植株如擬南芥、水稻、小麥、番茄、甜菜等多種植物根系微生物組的結構得到了解析。研究表明，無論是單子葉植物還是雙子葉植物，根系微生物組多集中于變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門［4］。由植物自身代謝引起的營養調節作用對植物內生細菌的組成有很大影響［4］，因此從營養成分差異角度揭示營養成分對番茄內生細菌群落結構組成的影響對于有益內生菌的定向篩選及有益生物學功能的發揮具有重要意義。

本研究通過將番茄根部組織研磨液涂布在LB、TSA、NA、R2A這4種培養基上，通過制備不同營養條件下的番茄內生微生物組，通過Biolog Ecoplate測定和16S r RNA gene高通量測序技術分析番茄根部內生細菌群落結構多樣性，研究不同營養類型培養基對內生細菌群落結構的影響，以期能夠利用營養條件定向調控內生菌群落結構組成，以期為靶向篩選目標內生菌提供理論依據。

1材料與方法

番茄植株來自于中國農業大學科學園溫室，栽培管理措施均按日常管理措施進行。

1.1供試分離培養基

R2A培養基：稱取R2A瓊脂培養基41 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

LB培養基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，瓊脂20 g，pH值7.4，121 ℃高壓蒸汽滅菌 20 min。

TSA培養基：稱取TSA瓊脂培養基40 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌 20 min。

NA培養基：稱取蛋白胨 10 g，牛肉粉3 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，瓊脂15 g，121 ℃高壓蒸汽滅菌 20 min。

PBS緩沖液：8 g NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na₂HPO₄，pH值7.4，去離子水定容至1 L，121 ℃高壓蒸汽滅菌 20 min。

1.2番茄根部內生微生物組的制備

番茄植株于2021年8月采集自中國農業大學科學園溫室，栽培管理措施均按照日常管理措施進行。采集4葉期番茄苗，稱取番茄根1 g，在PBS緩沖液中將其研磨后將研磨液用無菌水按照倍比稀釋法，取100 μL稀釋液分別涂布于TSA、LB、NA、R2A培養基中，25 ℃培養箱中培養7 d，各培養基平板上生長的菌落即為番茄根部內生微生物組。

1.3Biolog EcoPlate測定

植物研磨液在各類型培養基培養7 d后，用無菌水沖洗各個培養基平板，并用涂布棒將培養基平板上的菌在無菌水中涂抹均勻，最后用移液器吸取各培養基平板上的菌懸液1 mL到裝有10 mL PBS緩沖溶液的50 mL離心管中，振蕩2 min 后，5 000 g 離心5 min，取1 mL上清液加入到裝有20 mL PBS緩沖液的離心管中，混合均勻后加入到Biolog EcoPlate 平板中，每孔加入100 mL懸浮液。將接種后的微平板置于25 ℃ 培養箱中培養，每隔 24 h用細菌讀數儀讀取微平板吸光度，連續測定5 d。

1.416S rRNA基因高通量測序分析內生細菌群落結構多樣性

培養7 d后，用無菌水沖洗各培養基平板，并用涂布棒涂抹，用移液槍吸取各平板上的菌懸液1 mL提取菌懸液DNA，采用特異性引物799F（5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′） 和1193R （5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′），以菌懸液DNA為模板，擴增16S rRNA基因V7～V9區，擴增片段大小約為394 bp。反應體系25 μL：TaKaRa Mix 12.5 μL，779F 1 μL，1392R 1 μL，DNA 1 μL，ddH₂O 9.5 μL，PCR 擴增程序如下：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min共25個循環，最后72 ℃延伸 5 min。產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。用PCR純化試劑盒（Cycle-Pure Kit，OMEGA，美國）將PCR產物純化，按照說明書的操作步驟進行，然后將純化后的產物按照測序要求建立測序文庫，送交廣州美格生物科技有限公司進行高通量測序，并分析結果。

1.5數據分析

采用IBM SPSS Statistics 20.0軟件對數據進行單因素方差分析，并采用Duncan's新復極差法進行差異顯著性分析，獨立樣本t檢驗，用Origin軟件畫圖。

2結果與分析

2.1番茄內生菌菌群的AWCD值隨培養時間的變化

平均顏色變化率（AWCD）是反映微生物代謝活性（即微生物利用碳源的能力）的指標（圖1），隨著培養時間的延長，微生物利用碳源數量整體逐漸增加。在24～96 h內，番茄內生菌群處于對數生長期，菌群代謝活性逐漸升高；在培養96 h后，番茄菌群的生長達到穩定期，NA培養基下菌群代謝活性較高。R₂A培養基下菌群代謝活性較低。

2.2不同類型培養基番茄內生細菌種屬分布

各個類型培養基分離出的內生菌大部分屬于檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、鞘脂單胞菌（Sphinogbacterium）、布克氏菌屬（Burkholderia）。R₂A培養基作為一種廣譜的營養來源，內生細菌組成種類較多，各類型內生菌分布較為均勻；NA培養基中內生菌分布情況與R₂A類似：芽孢桿菌、布克氏菌屬、鞘脂單胞菌、檸檬酸桿菌均為優勢物種；但是在TSA和LB培養基中，內生菌群中芽孢桿菌屬豐度較高，所占比例均在80%左右，成為該培養基中的優勢物種（圖2）。

2.3不同類型培養基番茄內生菌群多樣性分析

TSA、LB、NA、R2A 4種類型的培養基上內生菌群結構具有顯著差異（P<0.05），不同營養類型的培養基成分對植物內生菌群結構具有顯著影響。α多樣性分析中，辛普森指數（Simpson）之間沒有顯著差異，但從香農指數（Shannon）來看，牛肉膏蛋白胨（NA）培養基中的番茄內生微生物組高于其他處理（P<0.05）（圖3）。

主成分分析可以將不同樣本的多元變量變換為互不相關的主元變量（PC1和PC2），在降維后主元向量空間中可以利用點的位置直觀反映出不同培養基微生物群落代謝特征。發現4種培養基培養條件下番茄內生細菌群落結構具有顯著差異（P<0.05）（圖4）。

2.4不同類型培養基番茄內生菌群網絡共線性分析及物種差異分析

網絡共線性分析發現，NA、R2A培養基中番茄

內生細菌微生物組模塊化水平更高，而且網絡拓撲性更高，LB、TSA培養基中番茄內生細菌微生物組模塊化水平較低（圖5）。LEfSe分析發現LB培養基富集的物種為芽孢桿菌，NA培養基富集物種多為假單胞菌（Pseudomonas），R₂A培養基富集物種多為鞘脂單胞菌，TSA培養基富集物種多為布克氏菌屬（圖6）。

3討論

本研究通過高通量測序技術對各類型培養基上得到的番茄內生微生物組組成進行分析發現，LB、TSA培養基中芽孢桿菌屬是優勢物種，但是在R₂A、NA培養基中，內生菌群組成較為均勻，不存在絕對的優勢物種。

微平板培養96 h后，菌群生長達到穩定期，NA培養基下菌群代謝活性較高。R₂A培養基下菌群代謝活性較低，可能是NA培養基中氨基酸含量較高引起［11］。可見氮源對于增強微生物代謝活性具有重要意義。4種培養基分離到的內生菌多為檸檬酸桿菌屬、芽孢桿菌屬、鞘脂單胞菌、布克氏菌屬，且不同營養類型的培養基下內生菌群中優勢物種有所差異：LB、TSA培養基分離到的內生菌多為芽孢桿菌，為優勢物種；NA、R₂A培養基分離到的內生菌中檸檬酸桿菌、芽孢桿菌、鞘脂單胞菌、布克氏菌為優勢菌屬。何紅通過高通量測序發現番茄內生菌中放線菌、假單胞菌含量較高［12］，與本研究結果有所差異。可見通過培養組學獲得的物種信息與生物信息學分析相比，還存在一定差距，今后還需要改善營養條件以期獲得更為全面的物種分類信息。PCoA分析顯示β多樣性有顯著差異（P<0.05），即在不同營養水平下番茄內生菌群落結構不同，文才藝等也發現了類似的結果［13］：不同生境下的番茄微生物組不同，可能是由于理化環境中營養條件的異質性引起的。

本研究中培養基內的營養條件與自然環境植物相比，成分有所不同［14］，番茄根系分泌物中多含有醛類、酸類等物質，根系分泌物等復雜化學物質對番茄內生菌群結構的影響有待于進一步研究。

不同種類微生物所需要的營養條件不同，根據試驗目的可通過調控營養水平達到靶向分離內生細菌的方法。本研究分析了外源營養物質對于番茄內生菌群的影響，進一步探求內生菌群中的重要成員結構變化，分析各類型營養條件下優勢菌群特征，為更好地研究內生菌與植物互作奠定基礎，同時為改善植物生長環境達到服務于農業生產的目的創造理論基礎。

4結論

（1）4種培養基上生長的內生菌群在Biolog 微平板培養96 h 后，菌群生長達到穩定期，NA培養基

下菌群代謝活性較高，R₂A培養基下菌群代謝活性較低。（2）4種培養基下番茄微生物組成分多為檸檬酸桿菌屬、芽孢桿菌屬、鞘脂單胞菌、布克氏菌屬，且群落結構具有顯著差異。（3）LB、TSA培養基分離到的內生菌多為芽孢桿菌屬，為優勢物種；NA、R₂A培養基分離到的內生菌中檸檬酸桿菌、芽孢桿菌、鞘脂單胞菌、布克氏菌為優勢菌種。（4）網絡共線性分析發現，R₂A、NA培養基中的網絡模塊化程度更高，具有更強的網絡拓撲性。

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