基于PI3K/AKT 信號(hào)通路探討漢黃芩素對(duì)宮頸癌HeLa 細(xì)胞移植瘤抑制作用影響

錢云英，錢桂英，顧偉群，倪海燕，蔡奚梅

常熟市中醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇常熟 215500

宮頸癌是婦科常見(jiàn)的惡性腫瘤，隨著有效的宮頸防癌篩查和人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)疫苗逐漸推廣普及，目前宮頸癌總體發(fā)病率有所下降，但出現(xiàn)了發(fā)病年輕化的趨勢(shì)[1-2]。全球每年約有50 萬(wàn)人被診斷為宮頸癌，約有30 萬(wàn)人因此喪生[3]，急需尋求新型有效的抗宮頸癌藥物。

黃芩屬于唇形科植物，具有清熱、緩急止痛之功效，其主要藥理作用為抗菌、抗病毒、抗腫瘤等[4]。研究結(jié)果表明，黃芩的提取物漢黃芩素能通過(guò)特異性誘導(dǎo)子宮頸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[5]，但相關(guān)分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究，且缺少相關(guān)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。因此利用宮頸癌動(dòng)物模型，研究漢黃芩素對(duì)宮頸癌的作用具有重要意義。BALB/c 裸小鼠中T 淋巴細(xì)胞缺陷，因異體組織誘導(dǎo)的排斥反應(yīng)較少發(fā)生。此外，BALB/c 裸小鼠價(jià)格便宜，是建立宮頸癌模型理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[6]。常熟市中醫(yī)院于2018年1 月—2020年12 月選取50 只BALB/c 裸鼠作為研究對(duì)象，以建立人宮頸癌模型,探討漢黃芩素對(duì)裸鼠人宮頸癌模型腫瘤生長(zhǎng)的影響，并探討漢黃芩素對(duì)PI3K/AKT 信號(hào)通路的影響。希望隨著本研究的不斷深入，對(duì)黃芩在預(yù)防宮頸癌方面的作用機(jī)理進(jìn)行初步的探索，為進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

50 只4 周齡SPF 級(jí)(BALB/c)裸小鼠，體質(zhì)量150～158 g，雌雄不限，健康狀況良好，購(gòu)自南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：NO.201911910。裸鼠飼養(yǎng)于SPF 級(jí)飼養(yǎng)場(chǎng)所,飲用的滅菌蒸餾水、輻照飼料均購(gòu)自南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。人宮頸癌細(xì)胞株購(gòu)自北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞中心。環(huán)磷酰胺(濃度2.5 mg/mL)（國(guó)藥準(zhǔn)字H22026738）。游標(biāo)卡尺購(gòu)自上海精密儀器儀表有限公司，電子天平購(gòu)自賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 漢黃芩素溶液制備 漢黃芩素（含量HPLC＞98%）由江蘇省腫瘤發(fā)生與干預(yù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，用DMSO 配成0.125 mol/L，-20℃避光保存，用前調(diào)至所需濃度。

1.2.2 細(xì)胞凍存 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，精胰酶消化后加入適量含10% 血清的完全培養(yǎng)基和5%～10%DMSO 的凍存液，借助吸管制作細(xì)胞懸液并在凍存管中放入1 mL 細(xì)胞，置入液氮罐內(nèi)。

1.2.3 細(xì)胞復(fù)蘇 把液氮罐內(nèi)放置的凍存管取出，快速放置在溫度37℃的溫水中融化60 s，培養(yǎng)基稀釋，待體積增大原來(lái)的10 倍，多數(shù)細(xì)胞貼壁，把含凍存液的培養(yǎng)基進(jìn)行合理吸取并更換完全培養(yǎng)基。

1.2.4 裸鼠移植瘤模型建立與分組 將100 μL 的Hela 細(xì)胞懸液分別注射入每只裸鼠左側(cè)腋窩中部外側(cè)皮下，注射Hela 細(xì)胞懸液8 d 后裸鼠皮下均出現(xiàn)移植瘤，16 d 后瘤體直徑5～8 mm，表明宮頸癌小鼠造模成功。將造模成功的50 只裸鼠隨機(jī)平均分為5 組：①模型對(duì)照組，不做特殊處理；②陽(yáng)性對(duì)照組，腹腔注射25 mg/kg 環(huán)磷酰胺；③小劑量組，灌胃給予25 mg/kg 漢黃芩素；④中劑量組，灌胃給予50 mg/kg 漢黃芩素；⑤高劑量組，灌胃給予100 mg/kg 漢黃芩素。灌胃給藥1 次/d，連續(xù)2 周。

1.3 觀察指標(biāo)

①計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率。最后一次給藥24 h后，處死各組小鼠，取出皮下腫瘤組織，稱取瘤體質(zhì)量、體積，并計(jì)算腫瘤抑制率：腫瘤體積=（長(zhǎng)徑×短徑2）/2（mm3）；腫瘤抑制率=（模型對(duì)照組腫瘤質(zhì)量-處理組腫瘤質(zhì)量）/模型對(duì)照組腫瘤質(zhì)量×100%。

②計(jì)算臟體指數(shù)。處死小鼠后取出胸腺和脾臟，對(duì)腫瘤進(jìn)行稱重，合理計(jì)算小鼠臟體指數(shù)，以胸腺質(zhì)量、脾臟質(zhì)量與小鼠10 倍質(zhì)量的比值計(jì)算胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)即可。

③觀察小鼠腫瘤組織病理?yè)p傷。將腫瘤組織平均分為兩部分,保存于-80℃冰箱。取一份用10%甲醛溶液固定，使用石蠟包埋并進(jìn)行切片，利用蘇木精-伊紅(HE)染色后觀察組織學(xué)形態(tài)。

④免疫印跡法檢測(cè)PI3K、AKT 及p-AKT。采用勻漿法對(duì)瘤體組織蛋白進(jìn)行提取，采用二喹啉酸法檢測(cè)蛋白量。蛋白液體內(nèi)混入適量上樣緩沖液，置于100℃環(huán)境中進(jìn)行熱變，聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜處理，漂洗目的膜3 次，每次5 min，最后孵育目的一抗（GAPDH、PI3K、AKT、p-AKT）4℃搖床過(guò)夜，值得注意的是一抗稀釋比例控制在1：1000。第二天，孵育二抗1 h，稀釋液比例是1：5000，然后把顯影液適當(dāng)加入，采用Bio-Rad 成像系統(tǒng)實(shí)施成像處理，并基于Image J 軟件，分析蛋白灰度值，計(jì)算p-AKT 和AKT 相對(duì)蛋白表達(dá)量和p-AKT/AKT 比值。相關(guān)計(jì)算公式如下：p-AKT=p-AKT 蛋白灰 度值/GAPDH 蛋白灰度值；AKT=AKT 蛋白灰度值/GAPDH 蛋白灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，計(jì)數(shù)資料用[n（%）]表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 漢黃芩素對(duì)小鼠腫瘤一般情況影響

大劑量組、中劑量組與小劑量組小鼠的腫瘤質(zhì)量、腫瘤體積均顯著低于模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 漢黃芩素對(duì)小鼠腫瘤一般情況影響(±s)

表1 漢黃芩素對(duì)小鼠腫瘤一般情況影響(±s)

注：與模型對(duì)照組相比，*P＜0.05

組別模型對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組小劑量組中劑量組大劑量組腫瘤質(zhì)量（g）1.35±0.09（0.41±0.04）*（0.92±0.06）*（0.61±0.08）*（0.30±0.05）*腫瘤體積（mm3）2.59±0.12（1.23±0.13）*（1.92±0.08）*（1.53±0.09）*（1.15±0.12）*

2.2 漢黃芩素對(duì)小鼠腫瘤生長(zhǎng)抑制率影響

陽(yáng)性對(duì)照組、小劑量組、中劑量組、大劑量組的小鼠腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為69.63%、31.85%、54.81%及77.78%。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，大劑量組小鼠腫瘤生長(zhǎng)抑制率較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 漢黃芩素對(duì)小鼠腫瘤生長(zhǎng)抑制率影響（%）

2.3 漢黃芩素對(duì)小鼠胸腺及脾臟指數(shù)影響

與模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、小劑量組、中劑量和大劑量組小鼠胸腺、脾臟指數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，漢黃芩素大劑量組小鼠的胸腺及脾臟指數(shù)較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表3 漢黃芩素對(duì)宮頸癌荷瘤小鼠免疫器官指數(shù)影響[(±s)，mg/g]

表3 漢黃芩素對(duì)宮頸癌荷瘤小鼠免疫器官指數(shù)影響[(±s)，mg/g]

注：與模型對(duì)照組相比，*P＜0.05

組別模型對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組小劑量組中劑量組大劑量組胸腺2.94±0.12（9.63±0.12）*（4.25±0.09）*（7.21±0.11）*（11.21±0.13）*脾臟10.41±1.21（16.59±1.54）*（12.63±1.30）*（13.95±1.22）*（18.53±1.06）*

2.4 漢黃芩素對(duì)小鼠腫瘤組織病理學(xué)表現(xiàn)影響

模型對(duì)照組的腫瘤組織中癌細(xì)胞染色正常、結(jié)構(gòu)較完整。陽(yáng)性對(duì)照組、小劑量組、中劑量、大劑量組出現(xiàn)明顯的癌細(xì)胞壞死，陽(yáng)性對(duì)照組與漢黃芩素大劑量組的癌細(xì)胞壞死程度相近，見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠腫瘤組織病理學(xué)表現(xiàn)（HE 染色，200×）

2.5 各組小鼠腫瘤組織中PI3K、AKT 及p-AKT分布

與模型對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組、小劑量組、中劑量組、大劑量組癌組織中PI3K、AKT 、p-AKT 表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。大劑量組中PI3K、AKT 和p-AKT 表達(dá)量與陽(yáng)性對(duì)照組接近，見(jiàn)圖2。

圖2 各組PI3K、AKT 及p-AKT 蛋白表達(dá)水平

3 討論

宮頸癌是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，近年來(lái)，其發(fā)病率呈年輕化趨勢(shì)，目前對(duì)于宮頸癌的診斷和篩查并不困難，但缺乏有效的中西醫(yī)干預(yù)治療措施[7-8]。在中醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，宮頸癌歸入“崩漏”“瘕聚”等范疇，女性臟腑氣血調(diào)節(jié)差，濕毒堆積，損傷沖任二脈，最終誘發(fā)崩漏，所以中醫(yī)醫(yī)師建議扶正祛邪為治療原則，扶正是改善患者免疫狀態(tài)，祛邪是指抑制腫瘤生長(zhǎng),兩者有效結(jié)合達(dá)到抗癌效果[9]。本研究證實(shí)漢黃芩素在一定程度上抑制機(jī)體宮頸癌Hela 細(xì)胞移植瘤的惡性生長(zhǎng)，促使瘤體快速凋亡，延長(zhǎng)病人生存時(shí)間，在宮頸癌治療中的優(yōu)勢(shì)突出。

植物藥對(duì)機(jī)體的不良反應(yīng)少，抗藥性小，是抗腫瘤藥物的優(yōu)選。漢黃芩素是黃芩的有效成分之一，可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的敏感性；漢黃芩素是從黃芩中提取的一種黃體酮類化合物，其臨床應(yīng)用廣泛,效果顯著，能起到顯著的抗腫瘤作用[10]。有關(guān)研究表明，漢黃芩素以劑量依賴方式抑制Hela 細(xì)胞，其作用效果明顯。漢黃芩素能夠特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)其對(duì)藥物的敏感性。漢黃芩素可通過(guò)抑制E6、E7 蛋白的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)HPV(+)人宮頸癌細(xì)胞的凋亡;還可以通過(guò)調(diào)控RET，PRET、GDNFRa1、CX3CR1 等蛋白的表達(dá)抑制人宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)[11-12]。本研究從PI3K/AKT 信號(hào)通路的角度來(lái)探討漢黃芩素對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞移植瘤抑制作用的影響，結(jié)果顯示：漢黃芩素可顯著抑制宮頸癌Hela細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)，其作用機(jī)制可能與漢黃芩素抑制PI3K/AKT 信號(hào)通路有關(guān)。

PI3K 屬于二聚體物質(zhì)，主要構(gòu)成是調(diào)節(jié)亞基P85、催化亞基p110，結(jié)合人體生長(zhǎng)因子受體后，會(huì)導(dǎo)致AKt 蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化，快速活化AKt 蛋白，因自身磷酸化作用可以對(duì)人體下游底物產(chǎn)生激活或者抑制作用，比如凋亡相關(guān)蛋白Bad、Caspase9 活性，增值、分化、凋亡乃至遷移人體調(diào)節(jié)細(xì)胞表型[13-15]。PI3K/ AKT 是細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中一條重要的信號(hào)通路,在細(xì)胞內(nèi)參與增殖、凋亡,糖代謝及炎癥 反應(yīng)等。一些細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子激活PI3K后活化Akt 參與一系列的生物調(diào)控。有研究表明，PI3K/AKT 通路異常激活與宮頸癌發(fā)生、增殖、侵襲、遷移密切相關(guān)[16-18]。因此，能有效抑制PI3K/AKT 通路是治療宮頸癌的重要途徑。本研究采用建立BALB/c 宮頸癌小鼠模型,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：漢黃芩素小劑量組、中劑量組及大劑量組均可以明顯降低小鼠腫瘤質(zhì)量及腫瘤體積，并且在小鼠腫瘤組織病理學(xué)切片HE 染色中可以明顯觀察到小鼠腫瘤組織中有不同程度的腫瘤細(xì)胞壞死。與模型對(duì)照組相比，漢黃芩素小劑量組、中劑量組和大劑量組的腫瘤組織中PI3K、AKT、p-AKT 表達(dá)量顯著減少，提示漢黃芩素可通過(guò)抑制PI3K/AKT 信號(hào)通路來(lái)調(diào)控宮頸癌Hela 細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，此作用可能與漢黃芩素具有抗腫瘤作用的機(jī)制有關(guān)。

綜上所述，漢黃芩素對(duì)抑制裸鼠宮頸癌Hela細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)，促進(jìn)瘤體組織細(xì)胞的凋亡有明顯效果，其機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT 通路活化有關(guān)。