探究不同劑量硫辛酸注射液熱原反應的影響

曾令偉，劉昱廷，趙亞繪

中南大學湘雅醫院藥學部，湖南長沙 410008

硫辛酸注射液是內分泌科常用藥，其對蛋白質的糖基化抑制作用可有效降低葡萄糖轉化率，同時體外實驗中對神經組織脂質氧化的抑制作用突出，因此被廣泛應用于糖尿病周圍神經病變引起的感覺異常，在控制血糖和并發癥方面具有突出效果[1-2]。硫辛酸的強效抗氧化作用不受基質性質影響，可在脂溶性和水溶性介質中發揮同樣作用，且硫辛酸還原劑和其本身的抗氧化效果相近，還能促進維生素族再生，提升細胞谷胱甘肽水平，對機體代謝產生積極影響，因此也被應用于護膚美容行業和腫瘤治療[3-5]。臨床研究和動物試驗均證實了硫辛酸的解毒作用，可用于減輕金屬中毒對肝腎的毒性作用，有效保護機體重要臟器[6]。目前對于硫辛酸的研究越來越多，雖然硫辛酸注射液在臨床應用劑量范圍內處于用藥安全水平，但其亦可引起諸多不良反應，比如過敏性紫癜、皮疹、靜脈炎、頭痛、抽搐、復視等[7-8]。近年來的研究發現，硫辛酸所致熱原反應現象頻出，相比于其他注射劑藥品，硫辛酸注射液熱原反應尤為嚴重，甚至危及生命[9]?；谏鲜鲇^點，本研究于2022年3—6 月在中南大學醫院藥學研究所選取新西蘭兔11 只作為藥物實驗動物進行觀察，對硫辛酸熱原反應的原因加以分析，為藥物生產和臨床用藥安全提供參考。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

①儀器：體溫測量設備為上海黃海藥檢儀器生產的熱原測溫儀，型號WRY-C，硫辛酸注射液加熱設備為上海博迅生產的現代電熱恒溫水浴鍋，型號SSW-600-2S，內毒素試驗檢查設備為湛江安度斯生物生產的恒溫儀，試管型號選用TAL-40D 型，離心設備為安徽中科中佳生產的低速離心機，型號SC-3012，溶血試驗所使用的吸光度計算設備為梅特勒-托利多國際生產的UV7 紫外可見分光光度計，以及由上海精科分析儀器公司生產的紫外分光光度計，型號754N。

②藥品與試劑：熱原反應試驗藥品分兩種，即硫辛酸注射液實驗樣品和對照樣品，均產自山西亞寶藥業，前者給藥劑量30 mg/kg，后者10 mg/kg。內毒素標本樣品出自中國食品藥品檢定研究院，生產批號為150601-201783，內毒素試驗中鱟試劑產自湛江博康生物，生產批號為1708230，溶血試驗中血漿游離血紅蛋白（hemoglobin, Hb）測定使用產自北京百奧萊博科技的游離Hb 檢測試劑盒，生產批號為171205。所有藥品和試劑均符合實驗室標準。

③實驗動物及環境：實驗動物選擇由濟南西嶺角養殖繁育中心供給的11 只新西蘭兔，生產許可證為SCXK（魯20150001），雌雄兔子比例為6∶5，實驗兔子體質量2.3～2.6 kg，平均（2.47±1.05）kg，屬普通級。于中南大學醫院藥學研究所開展研究，實驗環境中白天和晚上交替時間12 h/12 h，動物飼養溫度控制在22～26℃，最高溫與最低溫差值不超過5℃，空氣濕度保持在50%～70%。研究已獲本院動物倫理委員會批準。

1.2 方法

①熱原試驗：熱原試驗原理依據熱原檢查法，參考《中國藥典》2020年版[9]。隨機選出實驗動物中的6 只新西蘭兔進行觀察，設計硫辛酸藥物毒理試驗，同時將實驗動物分為兩組，即硫辛酸注射液實驗樣品（觀察組3 只）和硫辛酸注射液對照樣品（對照組3 只）[10]，觀察組體質量（2.57±0.11）kg，雌兔2 只，雄兔1 只，對照組體質量（2.42±0.09）kg，雌兔2只，雄兔1 只，兩組指標比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。具體試驗操作為先使用測溫儀測量并記錄兔子正常體溫，于10 min 后使用注射器抽取加熱到37.5℃左右的硫辛酸藥物，隨即由耳靜脈緩慢注射入兔子體內，劑量控制在30 mg/kg（對照組為10 mg/kg）、1 mL/kg；緊接著是測溫環節，測溫間隔時間為0.5 h，3 h 內共測量6 次，對比于正常體溫值，計算升高溫度，用℃表示，計算方法為用最高一次的體溫值減去正常值；熱原反應陽性判斷依據為，初檢的3 只新西蘭兔子體溫升高溫度總計≥1.3℃，或任意1 只兔子體溫升高溫度≥0.6℃，可判斷初檢陽性，隨之進入復檢環節，另外取5 只兔子進行復檢，操作與初檢方法一致。

②內毒素檢查：內毒素檢查方法依據《中國藥典》2015年版進行。內毒素實驗要求標準[9]：對照組標本樣品為≤0.4 EU/mg，觀察組標本樣品為≤0.25 EU/mg（即內毒素限值）。具體操作如下，先以最大稀釋倍數（CL/λ）將供試品稀釋得到2 支供試品管和2 支陽性對照（將內毒素標準品使用該濃度的供試品稀釋液制成2λ 濃度），內毒素陰性對照管和陽性對照管的制備需另外各取2 支，前者加入細菌內毒素檢查用水，后者加入2λ 內毒素標準液，將制備完成的試管放入提前設定好的恒溫儀處理，1 h 后取出，記錄結果變化，判斷陽性和陰性情況。

③體外溶血試驗：體外溶血試驗在動物紅細胞懸液基礎上進行，制備濃度為2%，具體操依據《中國藥典》2015年版進行，加入供試液、新西蘭兔紅細胞懸液和0.9%氯化鈉注射液，硫辛酸注射液為30 mg/mL 的濃度，陽性對照使用滅菌純凈水，陰性對照使用0.9%氯化鈉注射液[9]。參照藥典計算溶血率，a 是供試品各管的上清液吸收度，b 是滅菌純凈水上清液吸收度，c 是0.9%氯化鈉注射液對照管上清液吸收度，具體計算方法為先調零處理，使用0.9%氯化鈉注射液在分光光度計作用下操作，波長在545 nm 時使用分光光度計測定吸收度，溶血率=（a-c）/（b-c）×100%。

④體內溶血試驗：體內溶血試驗通過靜脈給藥，首先給藥前2 h 采集耳中動脈血2 mL 置于抗凝管，緊接著對6只試驗兔子以1 mL/kg容積、30 mg/mL濃度以及30 mg/kg 的劑量進行耳靜脈注射給藥，僅注射1 次，隨后于2 h 同樣采集耳中動脈血。使用低速離心機分別測定給藥前后血漿中游離Hb 水平，對比前后變化，判斷體內溶血試驗陽性情況。

1.3 觀察指標

觀察兩組兔子體內溫度值，統計較正常體溫升高的水平，判斷兩組熱原反應陽性結果，觀察細菌內毒素檢查結果，判斷致熱原是否為內毒素，觀察分光光度計吸收度數值，計算體外溶血率，判斷體外溶血反應是否導致熱原反應，觀察兔子體內血漿游離Hb 水平。

1.4 統計方法

采用SPSS 22.0 統計學軟件分析數據，計量資料以(±s)表示，LSD 檢驗用于方差齊的數據，t檢驗用于方差不齊的數據，通過單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 熱原檢查結果

觀察組初檢和復檢結果中，每只兔子體溫升高均＞0.6℃，溫度升高總和分別為2.3℃、3.7℃，熱原反應結果均為陽性，硫辛酸注射液劑量為30 mg/kg，而對照組每只兔子體溫升高均＜0.6℃，溫度升高總和為0.9℃，熱原反應結果為陰性。見表1、表2。

表1 初檢硫辛酸注射液熱原檢查情況（℃）

表2 復檢硫辛酸注射液熱原檢查情況（℃）

2.2 內毒素檢查結果

內毒素檢測結果中兩組均顯示陰性，與熱原反應無必要聯系，內毒素含量在規定范圍內，符合標準，見表3。

表3 硫辛酸注射液內毒素檢查結果

2.3 體外溶血試驗結果

體外溶血試驗中觀察組溶血率超過5%，硫辛酸注射液濃度＜30 mg/mL，加樣0.3 mL 后即出現了明顯溶血反應，觀察組為陽性結果，對照組溶血率顯然不足5%，為陰性結果。見表4。

表4 硫辛酸注射液體外溶血試驗結果

2.4 體內溶血試驗結果

體內溶血試驗中觀察組兔子注射硫辛酸后血漿游離Hb 水平較對照組明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.001），且觀察組較注射前Hb 水平提升明顯，差異有統計學意義（P＜0.001），而對照組注射后Hb 水平較注射前升高不明顯，差異物統計學意義（P=0.179）。見表5。

表5 硫辛酸注射液體內溶血試驗結果(±s)

表5 硫辛酸注射液體內溶血試驗結果(±s)

組別觀察組（n=3）對照組（n=3）t 值P 值注射劑量（mg/kg）3030注射前（g/L）46.15±9.1747.21±4.69-0.1780.867注射后（g/L）128.54±11.7651.36±8.239.3130.001 t 值55.0982.031 P 值＜0.0010.179

3 討論

致熱原是引起臨床用藥出現熱原反應的主要原因，熱原反應也是常見不良反應，持續高熱可能誘發休克，危及患者生命，因此用藥說明應嚴格進行，降低熱原反應發生率[10]。常見致熱原分為內源性和外源性兩種，細菌內毒素屬外源性，在臨床最多見，而內源性機制復雜，但與機體中樞的調節和溶血反應具有一定聯系，但具體結果尚待研究。有關研究采用4 種中藥制劑以檢查家兔熱原反應試驗結果提示，細菌內毒素檢查法可為熱原檢查提供一定依據[11]。有關研究指出，鱟試劑熱原檢查法易出現假陽性結果，且靈敏度受多因素影響，建議兔法與內毒素法聯合檢測，以降低干擾因素，提高準確性[12]。兔試驗和鱟試劑法常被作為熱原檢查的通用方法，在熱原反應的藥品質量檢查中具有重要意義[13-14]。而上述試驗中使用鱟試劑檢查內毒素是否為熱原反應的主要因素，結果提示陰性，而兔試驗結果顯示硫辛酸注射液熱原反應陽性，兩項研究結論不同的原因可能在于注射制劑的差異，具體原因有待進一步探討。本研究結論表明致熱原與外源性細菌內毒素聯系不大，后續可進行深入研究，分析具體原因。溶血試驗的設計邏輯源于紅細胞破裂可致免疫因子這類內源性致熱原釋放，最終引起體溫變化，依據此種思路設計溶血試驗[15]。田恩圣等[8]通過對體外溶血試驗的實踐，證明了硫辛酸注射液濃度30 mg/mL 情況下可引起溶血反應，而體內溶血試驗結果提示注射30 mg/mL 硫辛酸后2 h 新西蘭兔血漿中游離Hb 為（125.9±31.5）g/L，較注射前（45.2±11.8）g/L 提升明顯（P＜0.01），證明了體內溶血反應陽性。在上述研究中，體外溶血試驗陽性，判斷一定濃度的硫辛酸可致溶血，而體內溶血試驗結果顯示觀察組兔子血漿游離Hb 水平為（128.54±11.76）g/L，較對照組（51.36±8.23）g/L 明顯升高（P＜0.05），且較給藥前提升明顯（P＜0.05），而對照組Hb 水平較給藥前相比變化不大（P＞0.05），進一步表明體內溶血反應的發生可誘導新西蘭兔體內細胞因子、激素、免疫介質等內源性致熱原入血，紅細胞的破壞和相關炎性因子干擾了體溫調節中樞，從而引起體溫升高現象[16-17]。

綜上所述，硫辛酸注射液熱原反應與細菌內毒素關系不大，而實驗樣品在30 mg/kg 注射劑量條件下可致熱原反應呈現陽性結果，過程中實驗兔子體內外發生了溶血反應，可能與熱原反應存在內在聯系，需引起高度重視。