黑果腺肋花楸果中原花青素和花色苷的提取及其結合牛磺膽酸鈉能力研究

王旭輝 鐘方麗 王曉林郭 浩 陳 浩

（吉林化工學院化學與制藥工程學院，吉林 吉林 132022）

黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa）原產于北美，屬薔薇科腺肋花楸屬灌木，果實具有多種生物活性[1]。目前，尚未見黑果腺肋花楸果實作為飼料添加劑在動物養殖方面大規模使用的報道，但已有學者對其在動物養殖中的應用開展了研究。原花青素食用安全，具有抗炎、抗氧化等功效[2]。田躍等[3]研究表明，在肉雞日糧中添加葡萄籽原花青素可以提高肉雞平均日增重，降低料重比，改善肉雞機體的免疫能力。自然條件下游離的花青素較少，常與糖通過糖苷鍵形成花色苷[4]。花青素的抗氧化作用有助于維持畜禽生產過程中的氧化狀態平衡，改善畜禽的健康[5]。黑果腺肋花楸果中多酚類物質主要包括花青素、原花青素等，在飼料中添加富含多酚的黑果腺肋花楸果渣，可提高羔羊肌肉組織的抗氧化能力[6]。黑果腺肋花楸果渣可作為改善豬生長性能、抗氧化酶活性和肉品質的飼料添加劑[7]。

關于黑果腺肋花楸果原花青素、花色苷提取的研究已有報道[8-9]，但未見同時提取原花青素、花色苷的工藝研究。本試驗以黑果腺肋花楸果為原料，擬采用單因素試驗探究其原花青素、花色苷同時提取工藝并進行正交優化，與超聲波、微波、超聲波-微波協同、添加表面活性劑幾種輔助方式提取效果作對比，測定提取物與牛磺膽酸鈉的結合率，為黑果腺肋花楸在動物營養中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黑果腺肋花楸果購自吉林省黑果花楸農業科技開發有限責任公司。

表兒茶素對照品購自成都曼斯特生物科技有限公司。

1.2 儀器設備

TU-1950 紫外分光光度計購自北京普析通用儀器有限責任公司，XH-300UL-2 雙頻超聲波微波紫外光組合催化合成儀購自北京祥鵠科技發展有限公司，FA3204B電子分析天平購自上海天美天平儀器有限公司，SK5210HP 超聲波清洗器購自上海科導超聲儀器有限公司，H1580 醫用離心機購自長沙高新技術產業開發區湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 黑果腺肋花楸果原花青素、花色苷提取工藝

采用乙醇水溶液提取黑果腺肋花楸果中原花青素、花色苷，將黑果腺肋花楸果置于60 ℃干燥6～8 h，粉碎，過80目篩。稱取黑果腺肋花楸果干粉2.0 g，在設定的提取條件下提取，定容，搖勻。

1.3.2 原花青素提取量的測定

1.3.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的表兒茶素對照品5.0 mg，置于10 mL 容量瓶中，加適量無水甲醇溶解，定容，配制成質量濃度為0.5 g/L的對照品溶液。

1.3.2.2 供試品溶液的制備

按提取工藝進行提取，過濾，濾液用提取溶劑定容，即為供試品溶液。

1.3.2.3 檢測波長的確定

吸取供試品溶液、對照品溶液各2.0 mL，置于25 mL棕色容量瓶中（錫箔包裹嚴實，避光），加入4%香草醛甲醇溶液5 mL，混合均勻，加入3 mL濃鹽酸，混勻，甲醇定容，水浴30 ℃避光下顯色30 min，以甲醇代替樣品液為空白，按照紫外可見分光光度法，在300～700 nm進行波長掃描，確定檢測波長為500 nm。

1.3.2.4 標準曲線的繪制

分別吸取表兒茶素對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，于25 mL 棕色容量瓶中，按照1.3.2.3的方法，以甲醇代替樣品液為空白，按照紫外可見分光光度法測定500 nm處的吸光度值（A）。以吸光度值為縱坐標，表兒茶素質量濃度為橫坐標繪制標準曲線。標準曲線方程為y=7.088 1x+0.019 3，R2=0.999 4，表兒茶素在0.01～0.12 g/L之間線性良好。

1.3.2.5 原花青素提取量的計算

吸取每次試驗所得供試品溶液2 mL，按照1.3.2.3 的方法，以未加顯色劑的供試品溶液為空白，按照紫外可見分光光度法，測定500 nm處的吸光度值（A），根據標準曲線計算提取液中原花青素的濃度及提取量。

式中：W為原花青素提取量（mg/g）；c為根據吸光度值計算出的溶液質量濃度（g/L）；V為提取液體積（mL）；m為黑果腺肋花楸果粉取樣量（g）。

1.3.3 花色苷提取量的測定

吸取2 份1 mL 供試品溶液，置于10 mL 容量瓶中，分別用pH值1.0、4.5的緩沖液稀釋定容，40 ℃恒溫水浴平衡30 min，分別在510、700 nm 波長下測定吸光度值[10-11]，計算花色苷的提取量。

式中：W為花色苷提取量（mg/g）；DF為稀釋因子；A為吸光度，A=(A510nm-A700nm)pH值1.0-(A510nm-A700nm)pH值4.5；M為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的相對分子質量，取值為449.2；m為黑果腺肋花楸果粉取樣量（g）；V為供試品溶液體積（mL）；ε為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的消光系數，取值為26 900；L為光程，取值為1 cm。

1.3.4 單因素試驗

以黑果腺肋花楸果原花青素、花色苷總提取量為考察指標，原花青素、花色苷提取量為次要指標，進行單因素提取試驗。稱取干燥的黑果腺肋花楸果粉2.0 g，考察提取溶劑乙醇體積分數（0、10%、30%、50%、70%、90%）、提取溫度（25、40、50、60、70、80 ℃）、提取時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h）、液料比（5、10、20、30、40、50、60、70 mL/g）、提取次數（1、2、3、4、5）對原花青素、花色苷提取量及總提取量的影響。

1.3.5 正交試驗設計

根據單因素試驗結果，以原花青素、花色苷總提取量為考察指標，設計三因素三水平的正交試驗，L9(34)正交試驗因素水平設計見表1。試驗中固定提取溫度為80 ℃，提取次數為2次。

表1 L9（34）正交試驗因素水平設計

1.3.6 工藝穩定性驗證試驗

根據正交試驗確定的最佳提取工藝條件重復3 次，計算干浸膏的質量。

1.3.7 輔助提取方法研究

1.3.7.1 微波輔助提取稱取干燥的黑果腺肋花楸果粉2.0 g，微波功率設定為500 W，按照1.3.6 中的方法進行提取[12]，其中微波輔助提取的時間設定為30 min，提取結束后過濾，濾液用提取溶劑定容，測定濾液的吸光度值，計算提取量。

1.3.7.2 超聲輔助提取

稱取干燥的黑果腺肋花楸果粉2.0 g，超聲功率設定為300 W，按照1.3.6 中的方法進行提取[13]，超聲輔助提取的時間設定為30 min。

1.3.7.3 微波-超聲協同輔助

稱取干燥的黑果腺肋花楸果粉2.0 g，微波功率設定為500 W，超聲功率設定為300 W，按照1.3.6 中的方法進行提取[12-13]，輔助提取的時間設定為30 min。

1.3.7.4 表面活性劑輔助

稱取干燥的黑果腺肋花楸果粉2.0 g，加入果粉重量2%的表面活性劑十二烷基硫酸鈉，按照1.3.6中的方法進行提取[13]。

1.3.8 體外結合牛磺膽酸鈉能力的測定

1.3.8.1 溶液的配制

取Na2HPO435.8 g 溶于500 mL 的蒸餾水中，搖勻，得到溶液A；取NaH2PO47.8 g 溶于250 mL 的蒸餾水中，混勻，得到溶液B。吸取22.5 mL溶液A和77.5 mL溶液B，混勻，即為pH 值6.3 的磷酸鹽緩沖液。稱取牛磺膽酸鈉0.016 g 溶解于磷酸鹽緩沖液中，配制0.3 mmol/L 的牛磺膽酸鈉標準溶液。

1.3.8.2 牛磺膽酸鈉結合率的測定

稱取25 mg黑果腺肋花楸果提取物，60%的乙醇溶液溶解，定容，即為供試品溶液。吸取供試品溶液1、2、3、4、5、6 mL分別置于具塞試管中，用60%乙醇溶液補至6 mL，分別加入4 mL牛磺膽酸鈉標準溶液。以磷酸鹽緩沖液替代黑果腺肋花楸果提取物溶液為空白對照組，以磷酸鹽緩沖液替代牛磺膽酸鈉標準溶液為對照組。試驗組、對照組、空白對照組均在37 ℃水浴恒溫振蕩1 h，8 000 r/min 離心10 min。取2.5 mL 上清液，加入7.5 mL 60%硫酸，搖勻，70 ℃水浴20 min，取出，冰浴5 min，測定387 nm的吸光度，計算膽酸鹽結合率[14]。

式中：A1為試驗組的吸光度值；A0為對照組的吸光度值；A鹽為空白對照組的吸光度值。

以供試品溶液與牛磺膽酸鈉的結合率為縱坐標，質量濃度為橫坐標繪制曲線，計算供試品的IC50值。

1.4 數據統計與分析

試驗重復3次，采用WPS和Origin 8軟件進行數據處理，結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取溶劑對提取量的影響（見圖1）

圖1 提取溶劑對提取量的影響

由圖1 可知，隨著乙醇體積分數的增加，原花青素提取量及總提取量均先增加后下降。當乙醇體積分數為30%時提取量最高。可能是因為原花青素作為多酚化合物，易溶于水和多數有機溶劑，當體系極性與原花青素極性相近時，更容易將其萃取[15]。花色苷提取量也呈先增加后下降的趨勢，當乙醇體積分數為50%時提取量最大；當乙醇體積分數增大到90%時，提取量明顯下降。可能花色苷具有水溶性，乙醇體積分數過高抑制了花色苷的溶出。綜合考慮以原花青素、花色苷總提取量為主要考察指標，選擇30%的乙醇水溶液進行后續試驗。當乙醇體積分數在30%～70%之間提取量較高。因此，選擇30%、50%、70% 3個水平進行正交試驗。

2.1.2 提取溫度對提取量的影響（見圖2）

圖2 提取溫度對提取量的影響

由圖2 可知，原花青素、花色苷提取量隨溫度升高不斷增加，80 ℃時原花青素、花色苷及總提取量最高。乙醇的沸點為78.3 ℃，當提取溫度為80 ℃時，提取溶劑已處于微沸狀態，繼續提高水浴溫度意義不大，且水浴溫度越高所需能耗越大。因此，選擇80 ℃為提取溫度進行后續試驗。

2.1.3 提取時間對提取量的影響（見圖3）

圖3 提取時間對提取量的影響

由圖3可知，原花青素提取量在0.5～1.5 h逐漸增加，1.5 h時提取量最高，1.5 h后隨著提取時間的延長，提取量下降。可能是時間過短，原花青素提取不夠充分，時間過長，原花青素酚羥基被破壞，影響提取量[16]。花色苷提取量0.5 h最大，且隨提取時間延長變化不大。原花青素、花色苷總提取量1.5 h時最大，綜合考慮選擇1.5 h為提取時間進行后續試驗。提取時間大于1.5 h后，總提取量有所下降，而在0.5～1.5 h 之間總提取量較高，且差別不明顯。因此，選擇0.5、1.0、1.5 h 3個水平進行正交試驗。

2.1.4 液料比對提取量的影響（見圖4）

圖4 液料比對提取量的影響

由圖4 可知，原花青素提取量隨液料比增加呈增加趨勢，液料比為70 mL/g時提取量最高。隨著溶劑用量的增加，溶質不斷從原料中析出，當液料比達到70 mL/g時，溶質析出呈最高水平，較液料比60 mL/g 時變化不大。液料比為40 mL/g時，花色苷提取量最大，增加液料比提取量略有下降，但總體變化不大。而總提取量液料比70 mL/g時最大，因此，選擇液料比70 mL/g進行后續實驗。總提取量隨著液料比加大而提高，當液料比達到60 mL/g 后，雖然總提取量隨著液料比加大而繼續提高，但提高幅度有限。因此，選擇65、70、75 mL/g 3個水平進行正交試驗。

2.1.5 提取次數對提取量的影響（見圖5）

圖5 提取次數對提取量的影響

由圖5 可知，第3 次提取原花青素提取量為0，花色苷提取量明顯變小。前2 次提取原花青素、花色苷總提取量之和為10.87 mg/g，因此，選擇提取2次進行試驗。

2.2 正交試驗及方差分析結果（見表2、表3）

表2 正交試驗結果

表3 正交試驗方差分析

由表2可知，根據R值判斷各因素影響提取量大小排序為B＞C＞A，表明提取時間對提取量的影響最大，其次為液料比，乙醇體積分數影響最小。最優條件為A2B3C1，即提取溶劑為50%的乙醇水溶液、提取時間為1.5 h、提取液料比為65 mL/g、提取溫度為80 ℃、連續提取2次。

由表3 方差分析可知，各因素對總提取量無顯著性差異。

2.3 工藝穩定性試驗結果（見表4）

表4 工藝穩定性試驗結果

由表4 可知，3 批樣品中原花青素提取量平均值為10.37 mg/g，花色苷提取量平均值為0.88 mg/g，總提取量平均值為11.25 mg/g。3批試驗結果原花青素、花色苷總提取量接近，平行性較好，證明該提取條件穩定，可以作為黑果腺肋花楸果原花青素、花色苷同時提取的工藝參數。

2.4 輔助試驗結果（見表5）

由表4 可知，輔助試驗中原花青素及總提取量均比工藝驗證批次平均提取量略高，花色苷提取量微波輔助高于工藝驗證批次平均提取量，其他與工藝驗證平均提取量相同或略低，花色苷提取效果受輔助條件影響更小。幾種輔助條件下原花青素及總提取量升高，可能是因為超聲波的機械效應、空化效應和熱效應增大了溶劑分子的運動速度和穿透力，加快了原花青素的提取。在微波場中，由于微波的輻射作用，物料內部溫度迅速升高，壓力增大，使原花青素快速溶出[17]。表面活性劑的雙親結構可降低溶液的表面張力，增強溶劑對物料潤濕和滲透作用，起增溶效果，加快了原花青素的提取[18]。

2.5 體外結合牛磺膽酸鈉能力試驗的結果（見圖6）

圖6 牛磺膽酸鈉結合率結果

由圖6 可知，在一定質量濃度范圍內，黑果腺肋花楸果原花青素、花色苷提取物與牛磺膽酸鈉結合率（y，%），隨著加入樣品質量濃度（x，g/L）的增大而逐漸增大，且呈線性關系，擬合方程為：y=25.24x+29.151，IC50值為0.83 g/L，說明黑果腺肋花楸果原花青素、花色苷提取物具有與牛磺膽酸鈉結合的能力。

3 結論

本試驗采用紫外分光光度法、pH示差法分別測定黑果腺肋花楸果提取液中原花青素、花色苷的含量，通過單因素和正交試驗優化了黑果腺肋花楸果原花青素、花色苷同時提取工藝，最佳工藝條件為提取溶劑為50%的乙醇水溶液，時間為1.5 h、溫度為80 ℃、液料比為65 mL/g、提取為2 次，在優化條件下原花青素提取量為10.37 mg/g、花色苷提取量為0.88 mg/g，總提取量為11.25 mg/g。黑果腺肋花楸果提取物與牛磺膽酸鈉具有結合能力，IC50值為0.83 g/L。