一種快速測(cè)定飼料中嘔吐毒素的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

李 藝 霍路曼* 胡 劍 鄭百芹 李?lèi)?ài)軍 董李學(xué) 張思宇 龐學(xué)良*

（1．唐山市食品藥品綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心，河北 唐山 063000；2．農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)評(píng)價(jià)與營(yíng)養(yǎng)健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 唐山 063000；3．唐山市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河北 唐山 063000）

嘔吐毒素（DON）是動(dòng)物飼料中常見(jiàn)的真菌毒素之一，因其分子結(jié)構(gòu)為雪腐鐮刀菌烯醇的4-脫氧衍生物，又被稱(chēng)為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）。目前，在米、面、油中均不同程度地檢出DON[1]。糧食飼料作為動(dòng)物主要的食物來(lái)源，其品質(zhì)直接影響畜禽產(chǎn)品質(zhì)量。據(jù)調(diào)查，每年大約有25%的飼料因貯存、運(yùn)輸不當(dāng)受到不同程度的霉菌毒素污染[2-3]。

研究表明，飼料中DON污染較普遍[4-6]。當(dāng)動(dòng)物攝入了被DON污染的飼料后，會(huì)抑制腸道吸收，降低腸道功能，從而導(dǎo)致動(dòng)物免疫力下降，食欲減退，甚至造成死亡[7-9]。1998 年，在國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的評(píng)價(jià)報(bào)告中，DON 被列為3 類(lèi)致癌物。Trenholm 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)DON 含量在0～14 mg/kg，每增加1 mg/kg，豬的采食量降低6%，當(dāng)含量達(dá)到10 mg/kg 以上時(shí)，豬出現(xiàn)拒食現(xiàn)象。

我國(guó)《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB 13078—2017）中對(duì)飼料產(chǎn)品DON限量值有著嚴(yán)格的規(guī)定，其中犢牛、羔羊、泌乳期精料補(bǔ)充料要求DON含量≤1 mg/kg，其他精料補(bǔ)充料要求DON含量≤3 mg/kg，豬配合飼料要求DON含量≤1 mg/kg，其他配合飼料要求DON 含量≤3 mg/kg[11]。目前，檢測(cè)飼料中DON常用的國(guó)標(biāo)方法為《飼料中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測(cè)定免疫親和柱凈化-高效液相色譜法》（GB/T 30956—2014），該方法檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、成本高。隨著檢測(cè)儀器的不斷升級(jí)，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法因具有分析范圍廣、檢測(cè)限低和靈敏度高等特點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)行業(yè)[12]。

本研究針對(duì)飼料中DON檢測(cè)方法時(shí)間長(zhǎng)、成本高的問(wèn)題，建立一種基于超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的測(cè)定飼料中DON的方法，以期能夠達(dá)到短時(shí)間、大批量飼料樣本檢測(cè)，提高試驗(yàn)效率，節(jié)省檢測(cè)成本的目的。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

G6470B超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（安捷倫公司），KN-026S 渦旋振蕩器（北京科德諾思技術(shù)有限公司），KQ-800KDB超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），離心機(jī)、JJ200A電子天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠），有機(jī)微孔濾膜（0.22 μm），嘔吐毒素免疫親和柱（青島普瑞邦生物工程有限公司），真菌毒素凈化柱（北京科德諾思技術(shù)有限公司）。

嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（100 mg/L，天津阿爾塔科技有限公司），飼料樣品購(gòu)自河北省唐山市。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

準(zhǔn)確移取100 mg/L 的嘔吐毒素（DON）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)1.00 mL于10 mL容量瓶中，使用乙腈定容至刻度，配制質(zhì)量濃度為10.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，有效期一個(gè)月。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

使用時(shí)，使用空白基質(zhì)溶液將標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成質(zhì)量濃度分別為0.01、0.02、0.05、0.10、0.20 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4 ℃冰箱保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.3 樣品前處理

稱(chēng)取飼料樣品2.00 g 于50 mL 離心管中，加入DON標(biāo)準(zhǔn)溶液（外標(biāo)法），加入10 mL 超純水，3 000 r/min 振蕩20 min，超聲提取10 min，8 000 r/min離心10 min，取上層清液，使用真菌毒素凈化柱去除雜質(zhì)，過(guò)0.22 μm的有機(jī)微孔濾膜，濾液供LC-MS/MS測(cè)定。

1.2.4 精密度測(cè)定

稱(chēng)取2 g 飼料樣品，添加水平分別為0.01、0.05、0.10 μg/kg，每個(gè)濃度做3次平行，計(jì)算精密度。

式中：RSD為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差；S為標(biāo)準(zhǔn)偏差；xˉ為算數(shù)平均值；xi為樣品測(cè)定值；n為樣品重復(fù)測(cè)定次數(shù)。

1.2.5 回收率測(cè)定

在飼料樣品中，添加DON 標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平為0.01、0.05、0.1 μg/kg，每個(gè)水平做3 次平行，每個(gè)平行重復(fù)6次，計(jì)算回收率。

式中：c0為回收濃度（μg/kg）；c1為樣品添加濃度（μg/kg）。

1.3 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜條件

超高效液相色譜條件為C18 色譜柱（100 mm ×2.1 mm）、柱溫40 ℃、流速0.30 mL/min、進(jìn)樣體積5 μL；流動(dòng)相A 為0.1%甲酸水，流動(dòng)相B 為乙腈。流動(dòng)相度洗脫時(shí)間見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫時(shí)間

質(zhì)譜條件為ESI 正離子掃描模式，干燥氣溫度300 ℃，干燥氣流速7 L/min，噴嘴電壓500 V，毛細(xì)管電壓3 500 V，鞘氣溫度350 ℃，鞘氣流速11 L/min，霧化氣45 psi，其他質(zhì)譜條件見(jiàn)表2。

表2 DON質(zhì)譜條件

2 結(jié)果與分析

2.1 定性分析

0.01 mg/L DON標(biāo)準(zhǔn)溶液定性離子與定量離子色譜結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1 可知，按照1.3 設(shè)定的超高效液相色譜與質(zhì)譜條件，通過(guò)分析，DON 在1.69 min 峰形良好，出峰附近無(wú)任何雜峰干擾，是理想的色譜檢測(cè)方法。

圖1 0．01 mg/L DON標(biāo)準(zhǔn)溶液定性離子與定量離子色譜結(jié)果

2.2 定量分析

經(jīng)調(diào)研與檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，飼料樣品中大多含有嘔吐毒素。進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)前，為保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，對(duì)多批次飼料樣品進(jìn)行檢測(cè)篩選，選取空白樣品作為試驗(yàn)基質(zhì)，空白飼料樣品DON色譜結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 空白飼料樣品DON色譜結(jié)果

使用空白基質(zhì)溶液，配制質(zhì)量濃度分別為0.01、0.02、0.05、0.10 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作液，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖3，加標(biāo)樣品色譜結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖3 DON標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 加標(biāo)樣品色譜圖

取空白飼料樣品，添加一定量的DON標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其添加水平分別為0.01、0.05、0.10 μg/kg，每個(gè)添加水平做6個(gè)平行樣品，連續(xù)重復(fù)3 d，計(jì)算樣品回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。本研究以DON 回收率80%～120%、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%時(shí)的最小添加濃度為定量限，DON的回收率及精密度結(jié)果見(jiàn)表3。兩種檢測(cè)方法相關(guān)參數(shù)對(duì)比見(jiàn)表4。

表3 嘔吐毒素的回收率及精密度

表4 兩種檢測(cè)方法相關(guān)參數(shù)對(duì)比

由圖3、表3和表4可知，DON在飼料樣品中線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.999 0～0.999 9 范圍內(nèi)，得到的回收率在83.92%～94.65%之間，RSD 值在6.35%～7.09%之間，檢出限為0.01 μg/kg，符合檢測(cè)要求。與《飼料中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測(cè)定 免疫親和柱凈化-高效液相色譜法》（GB/T 30956—2014）相比，檢測(cè)時(shí)間由250 min縮短至44 min，檢測(cè)成本由300 元/批降低至160 元/批。定量限由0.10 mg/kg降低至0.01 mg/kg。

2.3 實(shí)際樣品測(cè)定

采用試驗(yàn)方法測(cè)定216批飼料樣品，其中有194批樣品不同程度地檢出DON，但均不超國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)（≤1 000 μg/kg），檢出率為89.81%，檢出最大值為578.2 μg/kg，見(jiàn)表5、圖5。

圖5 216批飼料樣品嘔吐毒素分布柱形圖

表5 216批飼料樣品檢測(cè)結(jié)果單位：μg/kg

由圖5可知，大部分飼料中含有DON，DON 含量在0～100 μg/kg 有136 批，100～200 μg/kg 有41 批，200～300 μg/kg有11批，300～400 μg/kg有4批，400～500 μg/kg有2批。

2.4 提取溶液的選擇（見(jiàn)圖6～圖8）

圖6 提取液為0．2%甲酸乙腈為時(shí)的色譜結(jié)果

圖7 提取液為乙腈水（84∶16）時(shí)的色譜結(jié)果

圖8 提取液為純水時(shí)的色譜結(jié)果

為了驗(yàn)證不同提取溶液對(duì)提取效果的影響，試驗(yàn)采用同一方法進(jìn)行試驗(yàn)，只改變提取溶液種類(lèi)。由圖6、圖7、圖8 可知，當(dāng)提取溶液中加入部分超純水后，回收率要高于提取液全部為乙腈，當(dāng)提取溶劑全部為超純水時(shí)，響應(yīng)強(qiáng)度最高、峰形最好、回收率最高。

免疫親和柱和真菌毒素凈化柱等不同固相萃取小柱對(duì)嘔吐毒素提取效果的影響見(jiàn)表6。由表6可知，當(dāng)提取溶劑為超純水時(shí)，免疫親和柱回收率為90.53%，凈化柱回收率為88.75%，兩者回收率相差不大，但從檢測(cè)成本分析，真菌毒素凈化柱要低于免疫親和柱。

表6 不同固相萃取小柱對(duì)DON提取效果的影響 單位：%

3 討論

施琦等[13]使用乙腈水（4∶1）為提取溶劑，建立了蝦飼料中DON液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法，檢出限12.63 μg/kg。張大偉等[14]以50%乙腈水溶液為提取溶劑，建立了飼料中DON液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，檢出限為2 μg/kg。符金華等[15]使用乙腈-水-乙酸溶液（70∶29∶1）作為提取溶劑，建立飼料中DON液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。范志辰等[16]使用5 mL水和5 mL含1%甲酸的乙腈溶液作為提取液，建立了飼料中DON檢測(cè)方法，檢出限為20 μg/kg。

本試驗(yàn)對(duì)比了酸化乙腈、乙腈水和純水等不同溶液作為提取溶劑時(shí)對(duì)飼料中嘔吐毒素提取效果的影響，以添加水平為0.01 μg/kg 的回收率為判定依據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)提取溶液中加入部分超純水后回收率要高于提取液全部為乙腈時(shí)的回收率，當(dāng)提取溶劑全部為超純水時(shí)，響應(yīng)強(qiáng)度最高、峰形最好、回收率最高，這可能與嘔吐毒素屬于醇類(lèi)物質(zhì)，易溶于水有關(guān)。本試驗(yàn)表明，免疫親和柱回收率要高于真菌毒素凈化柱，但相差不大，真菌毒素凈化柱比免疫親和柱低140元/批。

4 結(jié)論

本研究基于超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，結(jié)合優(yōu)化的前處理與上機(jī)條件，建立了一種操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短、成本低、準(zhǔn)確性高、實(shí)用性強(qiáng)的飼料中嘔吐毒素快速定量檢測(cè)技術(shù)，為進(jìn)行大規(guī)模飼料監(jiān)測(cè)提供了參考。