四環素和土霉素對羊糞好氧堆肥過程的影響

溫增欣，索全義，萬宇宸，王艷紅

（內蒙古農業大學草原與資源環境學院，內蒙古自治區土壤質量與養分資源重點實驗室，農業生態安全與綠色發展自治區高等學校重點實驗室，呼和浩特 010018）

近年來，我國畜禽養殖業迅速發展，為了預防動物疾病、促進動物生長、提高養殖的經濟效益，抗生素被廣泛使用[1-2]。但抗生素很難被動物吸收，有30%~90%的抗生素以原形通過糞便和尿液排出體外，導致抗生素在畜禽糞便中大量殘留，造成環境污染[3-5]。

畜禽糞便可通過好氧堆肥工藝進行資源化利用，堆肥過程是利用好氧微生物來降解有機物的過程，國內外已有許多學者進行了相關研究[6-7]。梁天等[8]發現堆肥C/N 為35 時的堆肥效果最好，徐寧[9]的研究指出堆肥pH 應控制在5.5~9.0。上述研究表明，適宜的溫度與C/N 是堆肥正常進行的必要條件。抗生素是可以阻止其他活細胞發育的化學物質，它可以改變微生物的種類、數量以及群落結構功能，使堆肥方向發生改變，因此抗生素對堆肥過程的影響引起了關注[10]。時紅蕾等[11]發現堆肥中存在的抗生素顯著抑制了堆體溫度的升高，增加了水溶性碳的殘留，并阻礙了脫氫酶和脲酶活性。曹永森[12]也發現抗生素對堆體溫度影響較大，且對過氧化氫酶、蛋白酶、脲酶、纖維素酶以及蔗糖酶的活性普遍存在抑制現象。此外，還有研究證明磺胺二甲嘧啶的存在擾亂了堆體微生物多樣性，短期內延緩了堆肥進程[13]。因此，畜禽糞便中殘留的抗生素會對堆體理化性質產生影響，但不同類型的抗生素對堆體產生的影響是否相同并不明確。

四環素類抗生素是畜禽養殖業中使用量最大的抗生素之一[14]，但有關四環素類抗生素對堆肥過程影響的研究相對較少，因此本研究將四環素和土霉素分別添加到畜禽糞便中，監測好氧堆肥過程中溫度、pH、電導率、C/N、過氧化氫酶、脲酶等決定好氧堆肥良好運行的重要參數，為含四環素類抗生素的畜禽糞便資源化和無害化利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 堆肥裝置

采用自制的保溫泡沫箱堆肥反應器，泡沫箱尺寸為535 mm×395 mm×400 mm，在泡沫箱側方插入兩支水銀溫度計，并在泡沫箱上打小孔保持通風環境。

1.2 供試材料

供試抗生素為土霉素和四環素，抗生素購于獸藥店，四環素規格≥98%，土霉素規格≥50%。

堆肥原料：以風干羊糞為主材料，玉米秸稈為輔材料進行堆料C/N的調節。堆肥原料的基本性質見表1。

表1 堆肥原料的基本性質（干基）Table 1 Basic properties of compost materials（dry base）

1.3 試驗設計與方法

試驗在內蒙古農業大學遮雨棚進行，采用好氧堆肥的方式。每個堆肥反應器中加入10 kg 風干羊糞，每千克羊糞中加入218 g 玉米秸稈混合，調整C/N 約為30，將初始含水率調整為60%左右。四環素類抗生素添加量為10 mg·kg-1（按照各地區抽樣檢測平均殘留水平添加，具體見表2）。根據堆肥溫度變化進行翻堆。

表2 各地區抽樣檢測抗生素殘留水平Table 2 Antibiotic residue levels in all region by sampling

試驗設置添加四環素（TC）、添加土霉素（OC）和不加抗生素（CK）3 個處理，每個處理3 次重復。試驗從2021 年7 月10 日至8 月13 日，共堆制35 d，于堆肥的第0、3、7、14、24、35 天，在堆體中對角線三點通體取樣約200 g。取得的樣品均勻混合，風干后用于各項指標的分析測定。

1.4 測定項目及方法

溫度的測定使用水銀溫度計，每天14：00 測定堆體中層偏下點位溫度及室內溫度；pH 采用pH計測定，電導率采用電導率儀測定，水土比均為10∶1；總有機碳采用重鉻酸鉀容量法測定，全氮采用凱氏定氮法測定；總腐植酸的測定采用焦磷酸鈉浸提-重鉻酸鉀容量法；酶活性測定參照關松蔭[19]的方法，脲酶采用納氏比色法，過氧化氫酶采用高錳酸鉀滴定法。

積溫計算方法如下：

式中：k為堆肥第j天時堆體溫度。

1.5 數據處理與分析

數據利用Microsoft Excel 2019 進行基本運算和制圖，采用SAS 通過單因素方差分析法進行相同時間、不同處理間差異顯著性檢驗，以評估Duncan 多重極差檢驗在0.05水平上的顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 四環素類抗生素對堆肥溫度的影響

溫度是影響堆肥過程的重要因素之一，它影響微生物的代謝活動及有機物的降解速率，并對堆肥的腐殖化程度起著決定性作用[20]。從圖1 可知，各處理溫度變化趨勢基本相同，均經歷升溫期、高溫期、降溫期和后熟期4個階段。

圖1 抗生素對堆肥過程中溫度的影響Figure 1 Effects of antibiotics on temperature during composting

3 個處理均經歷1 d 的升溫期后進入高溫期（表3），CK、TC 和OC 處理均在堆肥第3天達到最高溫度，分別為56、53、55 ℃。從表3可以看出，各處理的高溫期持續時間表現出差異，持續時間由長到短排序為CK>OC>TC，其中，CK 處理與TC、OC 處理之間差異達到顯著水平，由此可知抗生素的添加抑制了堆體溫度的上升，縮短了堆體的高溫期持續時間。將各處理高溫期積溫進行比較發現，四環素與土霉素的加入并未顯著影響堆肥高溫期積溫的變化。在降溫期與后熟期，抗生素對溫度的影響較小，3 個處理溫度基本一致，與CK 處理總積溫相比，TC 處理顯著下降49.3 ℃。由此得知，抗生素主要在堆肥前期對堆體溫度產生一定程度的影響，且四環素對堆體溫度的影響大于土霉素。

表3 抗生素對堆體關鍵溫度參數的影響Table 3 Effects of antibiotics on key temperature parameters of the reactor

2.2 四環素類抗生素對堆肥過程中化學性質的影響

2.2.1 對pH的影響

pH 也是影響堆肥過程的重要因素，表4為3個處理pH 的變化趨勢。抗生素對pH 的影響主要在堆肥的3~14 d，在堆肥第3 天時，CK、TC、OC 處理的pH 分別為8.65、8.60、8.55，相比CK 處理，OC 處理顯著降低了0.10 個單位，TC 處理pH 有所降低，但并未達到顯著水平。隨著堆肥的進行，各處理pH開始上升，在堆肥第7 天時，CK、TC、OC 處理的pH 分別達到8.73、8.65、8.68，與CK 處理相比，添加抗生素處理的pH 相對較低。在堆肥第14 天時各處理pH 達到峰值，分別為9.15、9.10、8.99。與CK、TC處理相比，OC處理顯著降低，降幅為0.11~0.16 個單位。14 d 后各處理間pH差異逐漸縮小，至堆肥結束時CK、TC 和OC 處理的pH 分別為8.77、8.73、8.78。上述結果表明，土霉素的添加能夠輕度降低堆體的pH。

表4 抗生素對堆體pH的影響Table 4 Effects of antibiotics on heap pH

2.2.2 對電導率的影響

電導率反映了堆肥浸提液中可溶性鹽的含量，與堆肥原料性質及發酵過程相關[21]。由圖2 可知，3 個處理的堆體電導率均呈現先上升后下降的趨勢，0~7 d 堆體電導率上升，14~35 d 堆體電導率下降。抗生素對堆體電導率的影響主要在堆肥第14 d 時，此時，CK、TC、OC 處理的電導率分別為2.94、3.83、4.74 mS·cm-1，受四環素類抗生素影響，堆體第14 天時的電導率有所增加，與CK 處理相比，OC 處理電導率增加較為明顯，顯著高于CK 處理1.80 mS·cm-1（P<0.05），而TC 處理電導率增加了0.89 mS·cm-1，并未達到顯著水平。堆肥14 d 后，3 個處理電導率差異開始減小，直至堆肥結束時，CK、TC、OC 處理的電導率分別為4.38、4.40、4.60 mS·cm-1。

圖2 抗生素對堆體電導率的影響Figure 2 Effects of antibiotics on electrical conducivity of pile

2.2.3 對C/N的影響

碳氮元素是微生物的重要能源物質，許多研究將C/N 的變化作為堆肥過程中的重要指標。四環素與土霉素的添加對堆肥過程中C/N 的影響見圖3，整個堆肥過程中3 個處理的變化趨勢相同，即先降低趨于穩定并在后期有短暫上升的趨勢。抗生素對堆體C/N 的影響主要在堆肥的3~14 d，在堆肥3~7 d 時，CK、TC 與OC 的C/N 分 別 從26.5、27.7、27.2 降至22.5、25.2、24.4，分別下降15.1%、9.0%、10.3%。在堆肥第14 天時，CK、TC、OC 處理的C/N 分別為18.6、20.1、20.4，與CK 處理相比，四環素與土霉素的添加使堆體的C/N 增高。在堆肥第24 天時CK、TC、OC 處理的C/N 達到最低值，其比值均降至20 以下，分別為16.9、18.7、18.1。上述結果說明抗生素的添加使堆體有機質分解速率減慢。

圖3 抗生素對碳氮比的影響Figure 3 Effects of antibiotics on C/N

2.2.4 對腐植酸含量的影響

腐植酸及其各組分是腐殖化過程中生成的最具代表性的次生產物，其變化與堆肥的穩定性與腐熟程度密切相關。如圖4 所示，CK、TC、OC 3 個處理總腐植酸含量均呈現先下降后短暫上升的趨勢，說明堆料中原本存在的腐植酸并不穩定，在前期會大量礦化分解，后期才能形成穩定的腐植酸。在整個堆肥過程中抗生素的添加并未對總腐植酸含量產生顯著影響，但在堆肥前期，添加抗生素處理的總腐植酸含量相對較高，證明TC與OC處理腐植酸礦化分解較弱。在堆肥后期各處理差異逐漸減小，至堆肥結束時，腐植酸含量分別為11.5%、10.3%、11.9%。

2.3 四環素類抗生素對堆肥過程中酶活性的影響

2.3.1 過氧化氫酶

過氧化氫酶是好氧堆肥過程中的重要酶之一，與堆肥中有機質（主要為木質素）的轉化速度密切相關。從圖5 可以看出，在整個堆肥過程中，抗生素對過氧化氫酶產生影響的時期主要在7~24 d。在堆肥第7天時，添加抗生素處理組的酶活性相對較低，其中TC處理的過氧化氫酶活性為3.22 mg·g-1·min-1，與CK 相比顯著降低0.24 mg·g-1·min-1。CK、TC 和OC 處理在堆肥第14 天時的過氧化氫酶活性分別為3.41、3.17、3.28 mg·g-1·min-1，相比CK 處理，TC 和OC 處理分別降低7.0%、3.8%，顯著抑制了堆體的過氧化氫酶活性（P<0.05）。在堆肥第24天時，CK、TC、OC處理的過氧化氫酶活性分別為3.80、3.42、3.79 mg·g-1·min-1，證明過氧化氫酶活性受到了四環素與土霉素抑制，但TC和OC 處理影響程度不同，其中TC 處理顯著低于CK處理，降低了10.0%，而OC 處理降低幅度較小，未達到顯著水平。

圖5 抗生素對過氧化氫酶活性的影響Figure 5 Effects of antibiotics on catalase activity

圖6 抗生素對脲酶活性的影響Figure 6 Effects of antibiotics on urease activity

堆肥結束時，添加抗生素處理與CK 處理未產生顯著變化，但TC 處理與OC 處理產生差異，TC 處理顯著低于OC 處理0.24 mg·g-1·min-1（P<0.05），抑制了堆體的過氧化氫酶活性。總體來看，四環素類抗生素的添加抑制了堆肥過程中過氧化氫酶活性，且四環素和土霉素對過氧化氫酶活性的影響表現出差異，過氧化氫酶活性受四環素的影響較大。

2.3.2 脲酶

脲酶作為水解酶是堆肥過程中含氮有機物礦化的關鍵酶，與堆肥過程中的氮元素密切相關，其活性可以表明含氮有機物降解的速度與強度[22]。在發酵前期各處理間脲酶活性差異較小，主要在堆肥第14天和第35天時有顯著影響。在堆肥第14天時，CK處理和OC 處理的脲酶活性分別為43.73、42.12 mg·g-1·d-1，TC 處理脲酶活性最高，達到62.12 mg·g-1·d-1，此時，TC 處理脲酶活性顯著高于CK 處理18.39 mg·g-1·d-1（P<0.05），促進了堆體脲酶活性，OC 處理與CK 相比未達顯著水平，但與TC 處理相比產生差異，TC 處理脲酶活性顯著高于OC 處理，證明不同種類抗生素對堆體脲酶活性的影響有所差異。

堆肥結束時，CK、TC 和OC 處理的脲酶活性分別為22.80、40.18、43.74 mg·g-1·d-1，說明四環素類抗生素的添加促進了堆體脲酶活性，與CK 相比，TC 和OC 處理分別顯著增加17.38、20.94 mg·g-1·d-1（P<0.05）。綜上所述，四環素類抗生素的添加促進了堆體脲酶活性。

3 討論

溫度的變化反映了堆肥進程，是堆肥過程中需要監測的重要指標。本試驗結果表明，抗生素對堆體溫度的影響主要表現在堆肥前期，四環素和土霉素的添加縮短了堆肥高溫期持續時間，添加抗生素并未對高溫期積溫產生顯著影響，但3 個處理堆體的總積溫表現出差異，其中CK處理總積溫高于TC和OC處理，且與TC處理達到顯著差異水平。證明四環素和土霉素的添加均能抑制堆體溫度的升高。這與馬駿[23]的研究結果一致，但馬駿的研究中添加抗生素組溫度下降得較為明顯，而在本試驗中抗生素組溫度下降幅度較小，這可能是馬駿的研究中抗生素添加量較大的原因。在堆肥后熟期所有處理均達到一個相對穩定的溫度并逐漸接近室溫，Sun 等[24]的研究也得到相同的結果。這是由于隨著堆肥過程的進行，抗生素逐漸降解，濃度減小，對微生物活動的抑制作用減弱[25]。楊振邊[26]曾指出抗生素的降解主要發生在堆肥高溫期，且經過50 d堆肥處理，抗生素的去除率高達92%；Sel-vam 等[27]也發現四環素類抗生素較喹諾酮類抗生素更容易被降解，21 d內四環素類抗生素的去除率高達100%，這為本試驗結果提供了理論支撐。

試驗前期pH 出現短暫的下降趨勢，這是由于微生物的代謝將堆料中的糖類、淀粉等物質分解為小分子的脂肪酸，導致堆料在最初幾天產生了酸化現象[28]。本研究結果表明添加抗生素處理組相比CK 處理pH 上升幅度慢，這可能是由于加入的抗生素抑制了微生物分解含氮有機物，因此產生的氨相比CK 處理較少。Liu 等[29]曾報道過抗生素可以抑制氨的釋放，因此pH上升幅度低于對照處理，這與本試驗結果一致。不同時期的結果表明四環素和土霉素的添加使堆體可溶性鹽含量增加，推測其原因可能是由于抗生素的添加促進了硝化細菌的增殖，使堆體物料不斷礦化，生成大量的NO-3促使堆體電導率增加[30]。這與李金津等[31]報道的不同添加量的抗生素并未顯著影響好氧堆肥電導率變化趨勢的結論相反，這可能是由堆肥材料不同導致的，李金津等采用的是蚯蚓好氧堆肥，王亞飛等[32]曾報道不同材料的畜禽糞便在堆肥過程中的各項指標變化存在明顯不同。C/N 與總腐植酸的結果表明，抗生素的加入使堆體有機物分解速率減慢，并隨著時間的推移影響逐漸減弱。這與李維華等[33]的研究結果相同。這與抗生素的加入使堆體中微生物代謝受到影響有關。林輝等[34]的研究表明磺胺類抗生素的添加抑制了堆體早期微生物代謝，但在14 d 內抗生素降解率高達100%，因此，抑制作用會隨著時間的延長而減弱。郭夢婷等[35]的研究表明抗生素不利于堆肥過程中水分的散失，造成堆肥結束后堆體高含水率。這為本研究結果的解釋提供了理論支撐。

好氧堆肥中酶促反應的速度可以揭示堆肥過程中營養物質的轉化程度。從過氧化氫酶活性的結果來看，抗生素的添加抑制了堆體過氧化氫酶活性，這可能是由于抗生素抑制了微生物分泌相關酶，進而抑制了過氧化氫酶活性。本試驗結果與李亞寧等[36]報道的磺胺類抗生素濃度的增加使過氧化氫酶活性顯著降低的研究結果相似。而李敏清等[37]發現過氧化氫酶活性與放線菌群有顯著正相關，因此，可能是抗生素的添加抑制了堆體中放線菌群的活性，使得過氧化氫酶活性降低，這也與Chessa 等[38]報道的外源四環素的添加會對土壤微生物活性產生不利影響的研究結果一致。徐晨光等[39]發現無論較高含量（>10 mg·kg-1）還是較低含量（<1 mg·kg-1）的抗生素均會顯著抑制微生物活性，使微生物群落結構發生變化。添加抗生素處理的脲酶活性要高于CK 組，這可能是由于抗生素的添加刺激了有利于含氮有機物降解的微生物。這與張凱煜等[40]報道的低濃度抗生素的添加可以促進脲酶活性的研究結果相似。綜上所述，四環素類抗生素的添加對堆體內物化指標產生了較為復雜的影響，物化指標與微生物活性密切相關。李文兵等[41]的研究表明評價細菌群落豐富度的Chao1 指數與腐熟度指標之間存在較強的相關性，因此，四環素類抗生素的存在可能會對堆體腐熟度與品質造成影響，王桂珍等[42]曾報道當抗生素含量高于50 mg·kg-1時會抑制堆肥過程順利進行并影響堆體腐熟度。因此，堆體中物化指標的變化與抗生素削減規律及堆料腐熟度的關系值得進一步研究。

4 結論

畜禽糞便中10 mg·kg-1四環素和土霉素的存在會顯著影響堆肥過程中各項指標的變化，四環素的添加使堆體總積溫顯著下降49.3 ℃，有機質分解速率及礦質化過程受到一定程度影響，最高使過氧化氫酶活性降低10.0%，并促進脲酶活性增加76.2%，相比之下，土霉素對好氧堆肥過程中物化指標影響較小。因此，不同抗生素對堆肥過程產生的影響表現出差異，在堆肥過程中要嚴格監控堆肥指標變化情況，合理控制堆肥條件，保證堆肥發酵質量。在人為控制和管理的基礎上實現預期的堆肥效果。