牛源致病性肺炎克雷伯氏菌的分離鑒定※

●李 彬 彭樹德 白和平 史秋梅

（1.秦皇島撫寧區農業農村局 河北 秦皇島 066004；2.唐山市食品藥品綜合檢驗檢測中心 河北 唐山 063000；3.河北科技師范學院 河北 秦皇島 066004；4.唐河縣和杰農業專業合作社 河南 南陽 473000）

肺炎克雷伯氏菌為革蘭氏陰性、需氧、無動力桿菌，是一種條件性致病菌，歸屬于腸桿菌科克雷伯氏菌屬[1]，廣泛存在于自然界中，也是引起醫源性感染的最主要致病菌。1822年，研究人員首次從大葉性肺炎病人痰液里分離出肺炎克雷伯氏菌[2]，之后在全世界范圍內相繼被報道，近年來陸續報道出該菌引起不同動物源性疾病，據報道已在兔、大熊貓、貉、貂、鹿、雞、豬、犬、牛、羊[3-4]等物體內分離出致病性肺炎克雷伯氏菌，主要癥狀為出血性肺炎、菌血癥、腸炎、腦膜炎、泌尿道炎癥，嚴重者導致死亡。研究表明該菌對環境適應性和不利條件抵抗力強，還具有多重抗生素抗性和耐藥機制，不僅危害養殖業的健康發展還造成了嚴重的公共衛生問題。2021年11月河北秦皇島某荷斯坦奶牛養殖養殖場出現母?；撔匀榉垦准盃倥：粑腊Y狀，為查明此次牛只發病原因，本研究采集化膿性乳汁與犢牛鼻腔分泌物，進行病原菌的分離鑒定、革蘭氏染色、生化鑒定，并通過致病性試驗明確牛只發病原因，為該病的預防和治療提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源及試驗動物

樣品為河北秦皇島荷斯坦奶牛養殖養送檢的化膿性乳汁與患呼吸道疾病牛的鼻拭子；試驗動物為北京維利通化動物實驗中心的6～8周齡BALB/c普通級健康小鼠。

1.2 主要試劑及儀器

LB培養基、綿羊血瓊脂培養基，均購自北京陸橋；PCR試劑均購自天根公司；ID32E生化鑒定試紙條、ABI微生物全自動生化鑒定儀，購自法國梅里埃生物公司；細菌DNA提取試劑盒，購自康為世紀生物科技有限公司；革蘭氏染色試劑、麥康凱肌醇阿冬醇氨芐青霉素鈉瓊脂，購自青島海博生物技術有限公司。

1.3 引物設計與合成

肺炎克雷伯氏菌引物序列：5'-ATGAAACGACCTGATTGCAT-TCGC-3'和5'-TTACTTTT TCCGCGGCTTACCGTC-3'，由上海生工生物科技有限公司合成[5]。

1.4 細菌的分離純化及革蘭氏染色

無菌操作取化膿性乳汁100 μL并加入900 μL滅菌PBS均勻稀釋備用；將鼻拭子放入裝有3 mL滅菌PBS的EP管中，充分旋轉擠壓后棄掉棉拭子，分別取一管稀釋后的奶液和菌懸液劃線于LB瓊脂培養基，37℃培養24 h后挑取優勢菌純化至形態單一，再將純化后單菌落劃線于麥康凱肌醇阿冬醇氨芐青霉素鈉培養基，觀察分離菌的生長特性。最后取純化后的細菌培養物進行革蘭氏染色，染色完成后在油鏡下觀察染色結果，并拍照記錄。

1.5 細菌的生化鑒定

使用ID32E腸桿菌科生化鑒定試紙條鑒定分離菌的生化特性，挑取適量純化的細菌培養物，使用0.9%的生理鹽水調整菌液濃度為0.5麥氏比濁度（約1×108CFU/mL），然后在每個檢測孔滴加70 μL菌懸液，0～6孔滴加1滴滅菌甘油（創造厭氧條件）引起吲哚實驗，放置在濕盒內，37℃培養箱培養24 h后使用ABI微生物全自動生化鑒定儀讀取結果。

1.6 PCR鑒定及序列分析

按照細菌DNA提取試劑盒提取分離菌DNA作為PCR模板，以16S rRNA通用引物擴增分離菌16S rRNA基因，反應體系為20 μL，其中2×TaqPCRMasterMix10 μL，上游引物、下游引物、細菌基因組DNA各1 μL，超純水補足充至20 μL，PCR結束后取擴增產物5 μL，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶符合預期即判斷為陽性，并將陽性擴增產物送上海生工生物工程技術服務有限公司純化、測序，其測序結果在NCBI網站做BLAST比對，并建立系統發育進化樹分析種屬關系。

1.7 致病性試驗

取10只普通級健康BALB/c小鼠，分為攻毒組和對照組，每組各5只，攻毒組處理為向5只小鼠腹腔內注射菌液濃度為1.0×108CFU/mL的細菌懸液0.2 mL，對照組處理為向5只小鼠腹腔內注射0.2 mL滅菌PBS，試驗期間小鼠可自由采食和飲水，每天記錄小鼠的狀況，對死亡的小鼠要及時進行剖檢。

2 結果與分析

2.1 臨床診斷結果

6周歲左右荷斯坦奶牛臨床癥狀表現為體溫40.5℃、拒絕哺乳、乳房紅腫、乳頭有傷口，乳汁為淡黃色絮狀并伴有血絲。30日齡犢牛具有體溫升高、精神沉郁、食欲減退、伴有輕微的咳嗽等癥狀，約2 d后呼吸道癥狀加重，并伴有流鼻涕現象。

2.2 分離菌形態學觀察

分離菌在LB瓊脂培養基上生長良好，呈邊緣光滑、中間凸起、中等大小的乳白色菌落（圖1-A）；在麥康凱肌醇阿冬醇氨芐青霉素鈉培養基上生長良好，菌落呈粉紅色，伴有粉色沉淀環，黏稠且不易挑起，有明顯“拉絲”現象（圖1-B）；革蘭氏染色后，油鏡下可看到陰性短小桿菌，兩端頓圓，散在或成對存在（圖1-C）。

圖1 細菌的形態特征

2.3 生化鑒定結果

取經24 h培養的生化鑒定試紙條，在IND孔滴加1滴吲哚試劑，用ABI微生物自動生化鑒定儀讀取鑒定結果，鑒定結果，如表1所示，2株菌的生化特性一致且均與肺炎克雷伯氏菌生化特性相符，初步鑒定為肺炎克雷伯氏菌。

表1 生化鑒定結果

2.4 PCR鑒定及序列分析

通過擴增分離菌16S rRNA基因，得到1500 bp左右條帶（圖2），與目標片段條帶大小相符。經16S rRNA測序結果雙向拼接后，結果顯示2株菌序列相似性為100%，經NCBI網站中BLAST比較同源性，與肺炎克雷伯氏菌同源性達99.93%。選取同源性較高的序列，利用MEGA7.0軟件采用NJ法構建系統進化樹，分離菌與肺炎克雷伯氏菌自然聚為一支，與鮑曼不動桿菌、流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌不在同一分支（圖3）。以上結果綜合分析，證實分離菌為肺炎克雷伯氏菌，并命名為kp-1、kp-2。

圖2 分離菌16S rRNA鑒定結果

圖3 分離菌16S rRNA基因系統進化樹構建結果

2.5 致病性試驗

小鼠攻毒24 h后，臨床表現為行動遲緩、呼吸急促、畏寒扎堆，48 h后攻毒組全部死亡，刨檢可見肺臟出血性浸潤，取肺組織進行細菌的分離鑒定，從肺臟中分離出與肺炎克雷伯氏菌生化特性、染色特征結果均為一致的分離菌株，經PCR鑒定為陽性；而對照組肺炎克雷伯氏菌檢測結果為陰性。以上試驗結果證實本次分離的2株肺炎克雷伯菌均有較強致病性。

3 討論與結論

克雷伯氏菌是一種重要的人畜共患條件性致病菌，長期存在于動物腸道及上呼吸道，在機體免疫力低下或環境條件發生改變時易引起繼發性感染。本研究從乳腺炎奶牛的奶樣及呼吸道癥狀牛鼻拭子中分離鑒定到2株優勢菌，通過實驗室診斷方法鑒定為肺炎克雷伯氏菌，動物性試驗結果顯示小鼠死亡，說明該分離菌有較強致病性，且死亡小鼠均出現出血性肺炎的癥狀，能夠從病變肺臟中分離到同源性肺炎克雷伯氏菌，證實肺炎克雷伯氏菌是致此次牛只發病的主要病原菌。在對2株菌16s rRNA基因序列進行同源性分析發現兩株菌的同源性為100%，且在系統發育進化樹中同處一個分支，這提示2株菌可能來自同一祖先。此外2株菌均能在48 h內致死小鼠，可能這與菌株的毒力基因相關，肺炎克雷伯氏菌的致病性主要與毒力基因的表達與調控因子相關，包括莢膜多糖、黏附素、鐵攝入能力、脂多糖。但是對于犢牛是否通過食物鏈感染該菌，需進一步進行相關研究。

綜上，本研究從乳腺炎奶牛的奶樣及呼吸道癥狀牛鼻拭子中分離到2株毒力較強的分離株，不僅為肺炎克雷伯氏菌的臨床診治提供一定參考，也為牛源肺炎克雷伯氏菌生物制品研發提供一定基礎數據。