實驗室養殖條件下麥穗魚Pseudorasbora parvaeDNA濃度與生物量相關性曲線的擬合與比較分析

郭娟 曾燏 鄭羽晨 趙雨雙 鐘清

摘? ? 要：為探究實驗室養殖條件下麥穗魚（Pseudorasbora parva）eDNA濃度與其生物量間關系，根據麥穗魚線粒體COⅠ基因序列設計特異性引物，通過實時熒光定量PCR（qPCR），得到qPCR標準曲線，采用線性、指數和對數3種模型對麥穗魚生物量與eDNA濃度的相關性曲線進行擬合和比較分析。結果表明：基于CO I基因設計的引物對麥穗魚DNA具有特異性擴增，擴增效率為90.94%；qPCR的閾值循環數（Cycle threshold，Ct值）與已知濃度或拷貝數的樣品（標準品）間呈現良好的線性關系（R2=0.995 2），說明標準品的拷貝數與Ct值之間相關的可信度較好。通過3種曲線進一步擬合比較分析顯示：線性模型為麥穗魚生物量與eDNA濃度間的最佳擬合模型，其R2高達0.933 8，y=72.087x+81.978。這表明在本試驗條件下，eDNA濃度與麥穗魚生物量呈正相關性。

關鍵詞：eDNA濃度；生物量；麥穗魚

中圖分類號：S932? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2023.06.008

Abstract：In order to investigate the relationship between the environmental DNA （eDNA） concentration and biomass of Pseudorasbora parva reared in the laboratory， specific primers were designed based on the mitochondrial COI gene sequence of Pseudorasbora parva. The qPCR standard curve was obtained through quantitative real-time PCR （qPCR）. The correlation curves between Pseudorasbora parva biomass and eDNA concentration were fitted and compared using linear， exponential， and logarithmic models. The results showed that the primers designed based on the COI gene specifically amplified Pseudorasbora parva DNA， with an amplification efficiency of 90.94%. The cycle threshold （Ct） value of qPCR showed a good linear relationship with known concentration or copy number of samples （standards） （R2=0.995 2）， indicating a good credibility of the correlation between the copy number of standards and the Ct value. Further fitting and comparison of the three curves revealed that the linear model was the best fit for the relationship between Pseudorasbora parva biomass and eDNA concentration， with a high R2 of 0.933 8 and y=72.087x+81.978. This indicates a positive correlation between eDNA concentration and Pseudorasbora parva biomass under the experimental conditions.

Key words： eDNA concentration; biomass; Pseudorasbora parva

監測魚類生物量是入侵物種種群管理工作的重要組成部分，然而，直接使用傳統捕撈調查方法會破壞水生生態環境，也難以準確評估個體小和群眾數量少的物種生物量[1]。近年來，隨著分子生物學的發展，eDNA技術作為一種新的監測方法，憑借便捷、環境友好、經濟高效等優點在珍稀瀕危物種和入侵物種監測領域發揮了重要作用[2-3]。環境DNA（Environmental DNA，eDNA）是指從環境樣本中（水、土壤、空氣等）提取到的總DNA[4]。目前，eDNA主要運用于4個方面。一是檢測目標物種的有無，通過檢測水體中是否有目標物種釋放的DNA來判斷水體中是否有該物種的存在[5]；二是生物多樣性評估，高通量測序的出現使得從一個eDNA樣品中同時檢測多種生物的DNA成為可能，現階段已被用于水生生態系統生物多樣性的檢測[6-7]；三是魚類分布，利用eDNA方法可以識別出一個特定物種在一個大區域（如海灣和大湖泊）上的分布，明確目標物種分布將有助于管理和監測海洋和大型湖泊中的魚類[8]；四是生物量估算，對目標生物的生物量進行調查是水生生物資源監測的重要內容[9-10]。

近年來我國開展了大量與eDNA技術相關的研究，但主要運用的是檢測目標物種、生物多樣性評估和魚類分布3個方面，關于eDNA技術評估生物量的研究較少[1]。魚類資源的評估不僅要定性地評估魚類多樣性，也要定量地評估生物量，實現這些將有助于eDNA技術成為管理魚類資源的一般工具[11]。生物量是指某一特定時刻單位空間的個體數、質量，如何科學地開展生物量評估是魚類種群生態的一個重難點問題，準確的生物量評估有助于魚類資源的合理開發利用和外來入侵物種的有效管理，建立eDNA濃度與生物量間關系是基于eDNA技術探究野生魚類生物量的重要依據[12]。

麥穗魚（Pseudorasbora parva）隸屬于鯉形目（Cypriniformes）、鯉科（Cyprinidae）、鮈亞科（Gobioninae）、麥穗魚屬（Pseudorasbora）。麥穗魚主要以浮游動物為食，分布廣，世代周期短，繁殖能力和適應能力強，已成功入侵全球超過30個國家[13-14]。當前通過傳統種群生態學方法難以準確的評估麥穗魚種群的生物量，eDNA方法的大量應用使得這一難題的順利解決成為了可能。目前關于麥穗魚的研究主要包括麥穗魚養殖、生活史和疾病等方面，而基于eDNA評估麥穗魚生物量未見報道[15-17]。

因此，本試驗以實驗室人工養殖的麥穗魚為目標物種，通過設計麥穗魚的特異性引物，實時熒光定量PCR建立標準曲線和熔解曲線，采用線性、指數和對數3種模型對麥穗魚生物量與eDNA濃度的相關性曲線進行了擬合和分析。研究結果有助于建立實驗室條件下eDNA濃度與其生物量的最佳相關性曲線，為eDNA濃度評估野外麥穗魚生物量提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 特異性引物設計

針對麥穗魚的線粒體CO I基因設計特異性引物。在GenBank上檢索麥穗魚的基因序列，根據已發表的麥穗魚序列（基因序列號MT805712.1），利用相關軟件Primer-Blast設計引物，使用引物分別對麥穗魚DNA和12種鮈亞科魚類DNA進行擴增，PCR試驗程序為：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，40個循環；72 ℃延伸7 min。擴增后對PCR產物凝膠電泳檢測，DNA的膠回收、連接和測序，最后比對測序結果是否是目的基因。

1.2 eDNA采集和提取

在5個魚缸（50 cm×45 cm×40 cm）中加入50 L曝氣水，溫度為5 ℃。分別在5個缸中放置0、2、4、8、16尾麥穗魚，平均每尾質量4.5 g。試驗期為7 d，7 d內不喂食，不換水。在試驗第7天采集樣本，使用消毒殺菌后的EP管取養殖缸表層水50 mL，每個缸做3次重復，設置1個蒸餾水陰性對照，共計18個樣本。采樣后立即用直徑為50 mm，孔徑為0.45 μm的混合纖維素濾膜進行無菌真空抽濾裝置抽濾，每次抽濾之前用無菌水沖洗過濾漏斗，防止交叉污染。抽濾完成后，用無菌鑷子將每張濾膜單獨卷起來，放入5 mL 的離心管中并做好標記，按照DNeasy PowerWater kit（Qiagen，Germany）試劑盒的操作方法提取eDNA，將收集到的DNA放置-20 ℃保存。

1.3 實時熒光定量PCR

使用TOYOBO的SYBR Green Real-time PCR Master Mix 試劑盒和 Applied Biosystems StepOneTM qPCR儀。將10 μL的2× SYBR real-time PCR premixture和0.4 μL的正向引物與0.4 μL反向引物（10 μmol·L-1）混合為mixture A體系，上機體系為：8 μL的mixture A和8 μL模板稀釋樣。試驗程序為：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，40個循環；72 ℃延伸7 min，在每次運行退火之后采集熒光信號。首先，將目標片段用Taq酶擴增，連接T載體，裝入感受態細菌，挑單克隆，搖菌，經測序確認片段正確后，在潔凈工作臺進行質粒小抽和定量。將標準品依次稀釋，形成 101～107 copies·μL-1的7個梯度，制作熒光定量PCR標準曲線。每次試驗均設置陰性對照品。為了確定PCR反應效率和定量未知樣本，計算并繪制熔解曲線和標準曲線。

1.4 擬合曲線模型的選擇

選用線性、指數和對數3種曲線模型進行擬合，利用R軟件繪制曲線圖，通過比較不同模型曲線擬合度R2的值大小來確定最佳擬合曲線。

2 結果與分析

2.1 提取DNA分析

從水體樣本提取的 eDNA和魚類肌肉中提取的 DNA 濃度分別為20～89? ng·μL-1和376～719 ng·μL-1。提取 eDNA 的OD值（A260/A280）為1.60～2.04，肌肉 DNA 的OD值為 1.79～2.13。盡管有部分eDNA濃度較低，但總體DNA的OD值能滿足后續試驗需求。陰性對照組和空白組均無擴增。

2.2 麥穗魚引物和標準曲線

得到麥穗魚引物F：CCGATTCTCATTGGGGGCTT，

R：CCTGCGAGAGGGGGATAAAC，片段長度188 bp。將麥穗魚eDNA擴增得到的PCR原液進行凝膠電泳并測序，目的條帶單一且明亮清晰，其測序結果在NCBI 網站上經過 Blast 比對分析，其結果顯示與原始序列片段同源性達 100%。如圖1所示，目的條帶清晰明亮且無非特異性擴增。

通過實時熒光定量PCR擴增，閾值循環數（Cycle threshold，Ct值）平均值分別為4.83、12.75、14.53、20.09、24.56（圖2）。Ct值是指每個反應管內的熒光信號到達設定閾值時所經歷的循環數。Ct值與模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始模板濃度越高，Ct值越小；起始模板量濃度越低，Ct值越大。系統根據標準品濃度與擴增Ct值生成麥穗魚引物擴增的標準曲線。標準曲線用于確定實驗中未知樣本的目標DNA的相對或絕對量。標準曲線為：Ct=-3.56 x+38.89，（x為樣本中麥穗魚 eDNA 稀釋濃度的對數值），曲線的相關系數 R2=0.995 2，擴增效率為90.94%，說明標準品的拷貝數與Ct值之間相關的可信度較好。反應完成后，得到的熔解曲線如圖2所示。熔解曲線是指隨溫度升高 DNA 的雙螺旋結構降解程度的曲線。本研究得到的溶解曲線出現單峰，說明反應具有特異性。

2.3 麥穗魚eDNA濃度與生物量相關性曲線

根據公式Ct=-KlogX0+b計算可得（X0表示拷貝數，k 表示標準曲線斜率，b 表示標準曲線截距），0、2、4、8、16尾麥穗魚養殖缸中得到的平均拷貝數分別為0、275.56、354.03、596.67、1 264.28個·L-1。采用線性、對數和對數3種模型對麥穗魚生物量與eDNA濃度的相關性曲線進行了擬合。結果如圖3所示，3種曲線的擬合分析結果顯示：線性模型為麥穗魚生物量與eDNA濃度的最佳擬合模型，y = 72.087x+81.978，其R2高達0.933 8。eDNA濃度與麥穗魚生物量呈正相關性，即麥穗魚生物量越大，eDNA濃度也會越高。

3 討論與結論

3.1 引物和標準曲線

麥穗魚eDNA擴增后進行凝膠電泳并測序，目的條帶單一且明亮清晰，測序結果為麥穗魚。這說明基于COI基因設計的引物對麥穗魚DNA具有特異性擴增，且其擴增效率為90.94%，引物特異性好。

本研究得到的標準曲線為Ct=- 3.56 x + 38.89，曲線的相關系數 R2=0.995 2，說明Ct值與標準品間呈現良好的線性關系，標準品的拷貝數與Ct值之間相關的可信度較好。結果表明，本研究在此麥穗魚eDNA濃度范圍內具有良好的線性關系，所建立的標準曲線能夠正確反映出麥穗魚目的基因的擴增。

實時熒光定量PCR的SYBR Green Ⅰ熒光染料法其優勢在于檢測方法簡便，檢測成本低。不足之處是染料與DNA雙鏈分子的結合是非特異性的，它可以和反應體系中的所有DNA分子結合，易受到非特異性擴增和引物二聚體的影響，使定量結果不可靠[18]。解決這一問題可以借助熔解曲線分析法來區分非特異性產物和引物二聚體而排除假陽性[19]。熔解曲線如出現多峰，證明反應非特異或存在二聚體。本研究得到的熔解曲線中出現單峰（圖2），說明定量結果是特異可靠的。

3.2 eDNA濃度與生物量相關性曲線

Takahara[9]等發現eDNA 濃度在第6天至第9天之間變化不大，得出eDNA濃度在第6天趨于穩定的結論。因此，本研究在試驗第7天進行采樣時，eDNA濃度差異不明顯，得到的eDNA濃度與生物量的關系更為可靠。

通過3種曲線進一步擬合比較分析顯示：線性模型為麥穗魚生物量與eDNA濃度間的最佳擬合模型，其R2高達0.933 8，y=72.087x+81.978，表明在本試驗條件下，eDNA濃度與麥穗魚生物量呈正相關性。雖然在小型水族箱和人工池塘中eDNA濃度與生物量存在線性關系[20-22]，但在湖泊河流中eDNA與生物量的關系會更加的復雜，可能是線性或非線性。閆卉果[9]等在養殖桶中得到巖原鯉eDNA濃度與其生物量為線性關系；Coulter[23]等在河流中發現鰱魚eDNA濃度與其生物量存在非線性關系。本研究的擬合分析結果顯示：線性模型為麥穗魚生物量與eDNA濃度的最佳擬合模型，y=72.087x+81.978，其R2高達0.933 8，研究結果與養殖桶條件下目標魚eDNA濃度與其生物量間關系一致。

3.3 eDNA濃度的影響因素

eDNA技術作為一種新的監測方法，具有便捷、環境友好、經濟高效等優點。eDNA產生后能在水體中保留一段時間，直至被降解不能檢測[24]。因此，它被認為提供了近似的實時數據。eDNA的降解與產生會導致eDNA濃度發生變化，但eDNA濃度的變化受多種因素的影響，進而影響eDNA濃度與其生物量的關系，主要包括生物因素和非生物因素2個方面。

生物因素方面體現在魚類的生物量會影響eDNA濃度。Michael等[25]發現，當大馬哈魚的密度越高，eDNA濃度也越高；Lacoursière等[26]研究表明，在同一溫度條件下，生物量越大，eDNA濃度越高。本研究結果發現，隨著養殖缸中麥穗魚的增加（0、2、4、8、16尾），eDNA濃度也呈正相關的線性關系。除生物因素外，其他非生物因素也會影響eDNA濃度，主要包括溫度、紫外線、pH等外界環境因素[27-30]。因此，在實際野外工作中需要綜合考慮各種因素，建立麥穗魚生物量和eDNA濃度關系模型才能準確評估麥穗魚的種群生物量。

本研究通過麥穗魚線粒體COI基因設計了麥穗魚特異性引物，F：CCGATTCTCATTGGGGGCTT，R： CCTGCGAGAGGGGGATAAAC，片段長度188 bp。確定了實驗室養殖麥穗魚eDNA濃度與其生物量的最佳擬合模型為線性模型，y=72.087x+81.978，R2=0.933 8。eDNA濃度與麥穗魚生物量呈正相關性。

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