響應(yīng)面法優(yōu)化單環(huán)刺螠酶解工藝

郭沫然，俞 偉，，賈若冰，劉思萌，劉夢萱，程永強(qiáng)，甘 晶

（1.煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264000；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品營養(yǎng)與工程學(xué)院，北京 100083）

0 引言

單環(huán)刺螠，俗稱“海腸”，有“裸體海參”的稱號，主要分布于膠東地區(qū)，煙臺、青島等地是海腸的主要產(chǎn)區(qū)，生長于淺海灘中，肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富，得到了很多人青睞[1]。單環(huán)刺螠體內(nèi)具有許多特定功能的多肽和多糖、酶等活性物質(zhì)，如纖溶酶、速激肽、抗菌肽、糖胺聚糖、抗硫化物等，研究表明這些物質(zhì)對抗菌、抗腫瘤、抗氧化具有積極作用[2]。劉春娥等人[3]發(fā)現(xiàn)單環(huán)刺螠酶解產(chǎn)物具有抗氧化的功效；初金鑫[4]從單環(huán)刺螠中分離出纖溶酶，其具有溶血栓的活性；陳翔[5]通過大鼠試驗(yàn)證實(shí)纖溶酶可以抑制肌酸磷酸激酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的升高，使血漿凝血酶的時(shí)間得以延長；溫春光等人[6]從單環(huán)刺螠體內(nèi)分離出速激肽，這些肽類物質(zhì)具有消炎和抗癌的功效，單環(huán)刺螠因其具有的功能活性肽而深受人們的喜愛，更被開發(fā)成高檔調(diào)味品。

調(diào)味品是一種可以調(diào)節(jié)食物風(fēng)味（氣味和滋味）并且可以起到增鮮、解膩、去腥等作用的產(chǎn)品[7]。目前，市場上的調(diào)味品主要分為復(fù)合調(diào)味品（蝦油、雞汁、蠔油等） 和單一呈味調(diào)味品（食鹽、味精、白砂糖等）。如今，隨著生活水平的提高，人們不僅注重調(diào)味品的風(fēng)味，更加注重其營養(yǎng)和健康，因此一些具有特定功能的調(diào)味品不斷出現(xiàn)。

目前，制備功能活性肽主要是有以下4 種方法，分別為化學(xué)水解法、酶解法、化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法。

趙翊君[8]將鱸魚魚肉用木瓜蛋白進(jìn)行水解，然后經(jīng)超濾、凝膠層析分離純化出抗氧化肽；Jiang Xin等人[9]利用枯草芽孢桿菌來發(fā)酵玉米麩皮來制備多肽，并且通過小鼠試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這種活性肽具有抗氧化功效。隨著酶解技術(shù)的廣泛應(yīng)用，酶解水產(chǎn)品提取工藝已應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中。

通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面法，以水解度為指標(biāo)，確定最佳酶的種類、料液比、酶解時(shí)間、酶解溫度、pH 值及超聲時(shí)間，以期提高其水解度，獲取更多功能多肽，為開發(fā)高檔單環(huán)刺螠調(diào)味品提供理論依據(jù)及深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

海腸，購自煙臺萊山區(qū)水產(chǎn)市場。

胰蛋白酶，上海如吉生物技術(shù)有限公司提供；木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶，Solarbio 公司提供；甲醛，煙臺健碩化工有限公司提供。

1.2 儀器

電熱鼓風(fēng)干燥箱，南京第一醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；超聲波清洗器，濟(jì)寧科源儀器有限公司產(chǎn)品；電爐，龍口市電爐制造廠產(chǎn)品；數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司產(chǎn)品；超低溫冰箱，杭州碩聯(lián)電器有限公司產(chǎn)品；超純水系統(tǒng)，萊特萊德有限公司產(chǎn)品；pH 計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；電子天平，梅特勒-托利多精密儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

單環(huán)刺螠→去內(nèi)臟、清洗→冷凍干燥→研磨粉碎→調(diào)pH 值→加酶→保溫酶解→離心→上清液→單環(huán)刺螠酶解液。

1.3.2 操作要點(diǎn)

將新鮮的海腸去內(nèi)臟、清洗后放入-80 ℃的冰箱中，將冷凍后的海腸放入冷凍干燥器中，24 h 后拿出冷凍干燥好的海腸，研磨粉碎后溶于適量蒸餾水，對其進(jìn)行pH 值調(diào)節(jié)，加入適量蛋白酶，再放入恒溫水浴中進(jìn)行酶水解。水解完成后，于95 ℃下進(jìn)行滅酶、冷卻、離心，取上清液。

1.3.3 蛋白酶的選擇

以水解度為指標(biāo)，在所得最適的條件下用胰蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶分別對海腸體壁肌進(jìn)行酶解，選擇水解度最高的3 種蛋白酶。

不同蛋白酶的最適酶解參數(shù)見表1。

表1 不同蛋白酶的最適酶解參數(shù)

1.3.4 單環(huán)刺螠的酶解單因素試驗(yàn)

通過控制加酶量4%，超聲時(shí)間50 min，料液比1∶50 不變，探究反應(yīng)時(shí)間、pH 值、反應(yīng)溫度對酶解液水解度的影響。

（1） pH 值對酶解液水解度的影響。為了探究pH 值對酶解液水解度的影響，選取pH 值7.0，7.5，8.0，8.5，9.0 這5 個(gè)梯度進(jìn)行試驗(yàn)。

（2） 酶解時(shí)間對酶解液水解度的影響。為了探究酶解時(shí)間對酶解液水解度的影響，選取1，2，3，4，5 h 這5 個(gè)梯度進(jìn)行試驗(yàn)。

（3） 酶解溫度對酶解液水解度的影響。為了探究酶解溫度對酶解液水解度的影響，選取45，50，55，60，65 ℃這5 個(gè)溫度梯度進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.5 響應(yīng)曲面優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，采用Box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，用pH 值、酶解溫度、酶解時(shí)間進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，以酶解液的水解度作為指標(biāo)，探究酶解的最優(yōu)條件。

響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.3.6 水解度的測定

用中性甲醛法[10]測定游離氨基酸，用凱氏定氮法[11]測定總氮含量。

水解度按式（1） 計(jì)算。

式中：DH——水解度；

C——NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；

V——酶解液消耗的NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；

V0——空白液消耗的NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；

0.014——1 mL 濃度為1.000 mol/L 的NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)于氮的質(zhì)量，g；

N——底物樣品的總氮含量，g。

2 結(jié)果與分析

3.1 蛋白酶的選擇

水解度，即蛋白質(zhì)經(jīng)過酶解后游離氨基酸的量與總氮的比值，反映肽鍵的斷裂程度，是一種可以反映蛋白質(zhì)水解程度的重要指標(biāo)。通常情況下，蛋白質(zhì)的水解程度越大，其水解度就越高。

不同蛋白酶對酶解效果的影響見表3。

表3 不同蛋白酶對酶解效果的影響/ %

由表3 可知，胰蛋白酶的水解度最高，為28.1%，其次為風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶分別為22.1%，19.4%，水解度最低的是胃蛋白酶。胰蛋白酶[12]水解度最高是因?yàn)樗鼘儆陔逆渻?nèi)切酶，能把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側(cè)切斷，是特異性最強(qiáng)的蛋白酶。海腸作為一種氨基酸豐富的海產(chǎn)品，精氨酸和賴氨酸的含量較高。因此，其水解度較高。綜合來看，選用水解較高的胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶來進(jìn)行后續(xù)的復(fù)合酶解。

3.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 pH 值對酶解液水解度的影響

pH 值對酶解效果的影響見圖1。

圖1 pH 值對酶解效果的影響

為了探究pH 值對酶解液水解度的影響，選取pH 值7.0，7.5，8.0，8.5，9.0 這5 個(gè)梯度進(jìn)行試驗(yàn)。由圖1 可知，隨著pH 值的升高，水解度呈先升高后降低的趨勢，在pH 值為8.5 時(shí)，水解度最高為34.4%。主要是因?yàn)殡S著pH 值的升高，復(fù)合蛋白酶的活性增強(qiáng)，但當(dāng)pH 值超過8.5 時(shí)，其會超過復(fù)合酶的最佳pH 值范圍，因此水解度會下降[13]。

3.2.2 酶解時(shí)間對酶解液水解度的影響

為了探究酶解時(shí)間對酶解液水解度的影響，選取1，2，3，4，5 h 這5 個(gè)梯度進(jìn)行試驗(yàn)。由圖2 可知，隨著酶解時(shí)間的延長，水解度逐漸增加，之后趨于平穩(wěn)。主要是因?yàn)槊附鈺r(shí)間越長，蛋白質(zhì)被水解得越充分，在酶解時(shí)間到達(dá)3 h 后，水解度趨于平緩，主要是隨著反應(yīng)的進(jìn)行，底物在不斷減少，水解速率也會下降。

圖2 酶解時(shí)間對酶解效果的影響

酶解時(shí)間對酶解效果的影響見圖2。

3.2.3 酶解溫度對酶解效果的影響

酶解溫度對酶解效果的影響見圖3。

圖3 酶解溫度對酶解效果的影響

為了探討酶解溫度對酶解液水解度的影響，選擇了45，50，55，60，65 ℃這5 個(gè)溫度梯度進(jìn)行試驗(yàn)。由圖3 可知，隨著溫度的升高，水解度先升高后降低。當(dāng)溫度為50℃時(shí)，最大水解度為30.2%。這主要是因?yàn)閺?fù)合蛋白酶的活性隨著溫度的升高而增加，但當(dāng)溫度超過55 ℃時(shí)，會導(dǎo)致蛋白酶變性，因此水解程度會降低[14]。

3.3 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)上述試驗(yàn)因素和水平，以水解度作為響應(yīng)值，采用Design Expert 8.0 軟件進(jìn)行三因素三水平的Box-behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表4。

表4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

用Design Expert 12 對響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合[15]，得到酶解pH 值（A）、酶解溫度（B）、酶解時(shí)間（C） 的二次多項(xiàng)回歸方程：

DH=34.06+0.662 5A+0.475 0B+0.637 5C-0.375 0AB+0.000 0AC-0.225 0BC-1.88A2-1.96B2-1.88C2.

方差分析見表5。

表5 方差分析

由表5 可知，模型具有p＜0.000 1，不匹配不顯著（p=0.234 3＞0.05），表明模型顯著，所選二次模型是合適的。模型的R2=0.988 3，R2Adj=0.973 4 表明，該模型擬合度好，試驗(yàn)誤差小，適合于分析和預(yù)測海腸的水解度。此外，因素A、B、C、A2、B2和C2對結(jié)果有顯著影響（p＜0.01），而因素AB、AC 和BC對結(jié)果沒有顯著影響（p＞0.05）。根據(jù)因子分析，3 個(gè)反應(yīng)條件對水解度的影響依次為pH 值＞酶解時(shí)間＞酶解溫度。

響應(yīng)面分析圖和等高線圖見圖4。

圖4 響應(yīng)面分析圖和等高線圖

由圖4 可知，AB、AC 和BC 的等高線圖大致呈圓形，表明酶解溫度、酶解時(shí)間和pH 值之間的相互作用不顯著。AB 三維圖是固定酶解時(shí)間，即3 h。基于此，可以得出結(jié)論，當(dāng)酶解時(shí)間固定時(shí)，pH 值軸上的響應(yīng)值比酶解溫度軸上的響應(yīng)值更陡，這表明pH 值對水解度的影響大于酶解溫度。AC 立體圖是將酶解溫度固定為50 ℃。由此可以得出結(jié)論，當(dāng)酶解溫度恒定時(shí)，pH 值軸上的響應(yīng)值比酶解時(shí)間軸上的響應(yīng)值陡峭，這表明pH 值對水解程度的影響大于酶解時(shí)間。BC 三維圖確定酶解pH 值為7。基于此，可以得出結(jié)論，當(dāng)酶解pH 值恒定時(shí)，酶解時(shí)間軸上的響應(yīng)值比酶解溫度軸上的響應(yīng)值更陡，這表明酶解時(shí)間對水解度的影響大于酶解溫度。可以看出，該結(jié)論與方差分析的結(jié)論是一致的。此外，根據(jù)AB 的三維圖，水解度隨著pH 值和酶解溫度的升高而增加，但在達(dá)到峰值時(shí)逐漸減弱。AC 的三維圖與BC 的三維圖大致相同，這可以通過相同的原因獲得。

根據(jù)對響應(yīng)面的結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合所得響應(yīng)面擬合方程進(jìn)行參數(shù)最優(yōu)分析，最終預(yù)測得到最佳工藝條件為pH 值8.58，酶解時(shí)間3.16，酶解溫度50.48。為了便于操作，酶解時(shí)間設(shè)為3 h，酶解溫度設(shè)為50 ℃，pH 值設(shè)為8.5，在此條件下進(jìn)行3 組平行試驗(yàn)，水解度的實(shí)際測得值為34.4%，與模型的預(yù)測值34.19%接近，相對誤差為1.33%。

3 結(jié)論

以海腸為原材料研究其酶解的最佳工藝，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法建立了海腸酶解工藝的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，對酶解條件進(jìn)行了優(yōu)化。通過分析酶解pH 值、酶解溫度、酶解時(shí)間三因素交互作用對酶解海腸水解度的影響，得到最佳酶解時(shí)間3.16 h，pH 值8.58，酶解溫度50.48 ℃，此時(shí)的水解度DH 值34.19%。該研究可獲取更多功能多肽，為開發(fā)高檔單環(huán)刺螠調(diào)味品提供理論依據(jù)及深加工提供參考。