一個大麥黃化突變體的突變機理及其遺傳機制研究

白道寬， 郭寶健， 洪益， 張萌娜， 朱娟， 呂超， 王菲菲， 許如根

（揚州大學農學院，江蘇省作物基因組學和分子育種重點實驗室，植物功能基因組學教育部重點實驗室，江蘇省作物遺傳生理重點實驗室，江蘇省糧食作物現代產業技術協同創新中心，江蘇 揚州，225009）

葉綠體是植物光合作用的場所，可將太陽能轉化成化學能供植株生長和發育，最終形成作物產量[1]。葉綠素含量直接影響光合效率，最終決定農藝性狀和作物產量[2]。葉綠素分為葉綠素a和葉綠素b，葉綠素a是主要光合色素，直接從太陽光獲取能量；葉綠素b是輔助光合色素，將光能傳遞給葉綠素a。葉色與葉綠素組分和含量有關，易于識別。葉色突變體是最常見的葉色變異材料，突變往往造成相關基因的缺陷，使葉綠素合成受到影響，造成植株葉片黃化，是研究葉綠素形成機理的重要材料[3-4]。

近年來，利用葉色突變體對葉綠素合成、葉綠體結構發育、光合作用以及色素合成相關酶的生物學功能等進行了大量研究，水稻中已有百余個葉色突變體被報道（http://www.gramene.org）[5]，部分表現出條紋、斑點、葉脈黃化等特殊表型[6-8]。玉米中分離克隆的與葉色相關的數量性狀座位（quantitative trait locus，QTLs）或基因已達200余個（http://www.maizegdb.org）[9]。目前，已報道的大麥黃化相關基因主要與葉綠素代謝途徑和葉綠體發育相關，其中包含多個葉綠素合成關鍵酶基因，如PORA、PORB、CAO、Xantha-h、Xantha-g、Xantha-f等[10-13]，PORA與PORB突變使蛋白復合物合成缺失，導致植株體內單線態氧積累，造成植株黃化；Xantha-h、Xantha-g、Xantha-f分別編碼大小為40、70和140 kD的3個大小不同的多肽亞基，組成鎂螯合酶，任一基因突變均會影響Mg2+插入原卟啉IX（Proto IX）；CAO突變導致葉綠素b合成途徑受阻，形成獨特的缺葉綠素b型黃化。此外，葉綠體與核糖體發育途徑及光系統中的基因發生突變同樣會導致葉色變化，如HvCMF7[14]、HvCMF3[15]、HvLST[16]等。Landau等[17]發現，YCF3基因突變致使PSI組件發生缺陷，導致PSII嚴重的光抑制和降解。Lencina等[18]利用cpm突變體進行研究發現，MSH1基因突變會造成細胞質體發育不穩定，從而影響葉綠體發育。Bosco等[19]利用大麥葉色缺陷突變體闡述了葉綠體發育缺陷對COR(cold-regulated)基因表達的影響，從一定程度上解釋了葉綠體發育與抗逆性之間的關聯。相比較于水稻、擬南芥等模式植物，大麥由于基因組較大，已定位的與葉綠素合成、葉綠體分化及光形態建成相關基因較少，隨著大麥全基因組測序完成，越來越多調控大麥葉色的基因逐漸被發掘出來，但是涉及響應冷脅迫的大麥葉色突變體偏少，開展有關溫度對大麥葉色突變體的發育及光合特性影響的研究，可用于探究大麥的葉綠素合成、葉綠體發育及光合對溫度的響應機制。

本課題組以二棱啤用大麥品種‘揚農啤5號’為材料，利用甲磺酸乙酯（ethyl methanesulfonate，EMS）誘變的方法，篩選得到1個溫敏黃化突變體G039。該突變體在揚州秋播，自出苗即呈現出黃化表型，春季隨氣溫升高，葉片逐漸轉綠。本文通過表型觀察、生理指標、組織結構及相關基因分析，探究突變體G039的基因突變機理及遺傳特點，以期為大麥葉綠素合成及光合能力相關研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以野生型‘揚農啤5號’（Yangnongpi 5，YNP 5）、‘揚農啤5號’種子EMS誘變后連續6代自交的溫敏黃化突變體G039及突變體分別與野生型和江蘇主推大麥品種‘揚農啤7號’配置的雜種F1與F2群體為材料。供試材料均來自揚州大學農學院大麥研究所。

1.2 材料種植

1.2.1 田間種植 2020—2021連續2年秋季將供試材料點播于揚州大學大麥試驗田，行長1.2 m，行距0.2 m，株距0.06 m，每個材料3個重復，每個重復2行。

1.2.2 氣候箱培養 將野生型‘揚農啤5號’及突變體G039種子置于25 ℃下催芽1 d，選取萌發程度一致的種子種植于裝有營養土的盆缽，每盆均種2粒，各種植50盆，置于光照培養箱（合肥達斯卡特生物科技有限公司，RGLC-P1200-D3）中培養7 d，培養條件：12000 lx、光16 h/暗8 h、70%濕度、25 ℃。之后將‘揚農啤5號’和G039幼苗同時分別置于不同溫度（10、15、20、25 ℃）光照培養箱中生長2周，光照和濕度同上。2周后進行葉色觀察、SPAD值、葉綠素含量及光合特性參數的測定。

1.3 指標測定

1.3.1 主要農藝性狀調查 在大田成熟期，隨機取20株‘揚農啤5號’與G039調查株高（cm）、穗長（cm）、穗下節間長（cm）、分蘗數與每穗粒數5項農藝性狀，取平均數作為各材料的性狀值；收獲后隨機取‘揚農啤5號’與G039的種子，利用自動考種分析儀（萬深SC-G）考察粒長（mm）、粒寬（mm）和千粒重（g），重復3次。利用SPSS 22.0軟件進行t測驗，比較二者主要農藝性狀及產量構成因素差異性。

1.3.2 SPAD值測定 不同溫度下分別取3株‘揚農啤5號’與G039，利用柯尼卡美能達SPAD儀（SPAD-502PLUS）測量第2葉最寬處的葉綠素SPAD值，重復3次。

1.3.3 光合色素含量測定 不同溫度下分別取3株‘揚農啤5號’與G039，取第2葉中間部位，將葉片兩端剪去并分離主葉脈，稱取葉片重量并記錄。將葉片剪成0.2 cm×0.2 cm的小塊，放置于10 mL離心管中，加入8 mL 95%的乙醇，避光浸提48 h。參考Qin等[20]的方法利用紫外分光光度計測量上清液吸光度值，計算葉綠素a (chlorophyll a, Chl a)、葉綠素b (chlorophyll b, Chl b)及總葉綠素含量，重復3次。用同樣方法測定田間條件下苗期與灌漿期‘揚農啤5號’和G039的葉綠素含量。

1.3.4 光合速率測定 使用CIRAS-3型光合儀（漢莎科學儀器有限公司）在植株第2葉葉片中下部進行測定，不同溫度處理下‘揚農啤5號’與G039各選擇3株，取平均值。測定的主要指標包括：凈光合速率（net photosynthate，Pn）、蒸騰速率（transpiration rate，Tr）、氣孔導度（stomatal conductance，Gs）、水分利用率（water utilization rate，WUE）、胞間CO2濃度（intercellular CO2concentration，Ci）。

1.3.5 葉綠體超微結構觀察 取樣方法同1.3.3，取樣后將葉片剪成面積約1 mm2的正方形，置于2.0 mL離心管中，立即放入2.5%的戊二醛固定液（25%戊二醛∶0.2 mol·L-1磷酸緩沖液∶無菌水體積比為1∶4∶5），于4 ℃下保存，固定好后進行清洗，然后再固定、洗滌、脫水與硬化，再經置換、浸漬、包埋、聚合、修塊、切片、染色等一系列過程處理后，用透射電鏡（Hitachi 7800型）進行觀察、拍照[7]。

1.3.6 遺傳分析方法 觀察F1表型，統計2個F2群體中突變表型和野生表型株數及性狀分離比；利用卡方檢驗，分析G039突變性狀的遺傳方式。

1.3.7 光合相關基因定量分析方法 選取不同溫度下野生型和突變體G039葉片相同位置提取植物總RNA，采用諾威贊生物科技（南京）有限公司的Fast Pure Universal Plant Total RNA Isolation Kit 試劑盒提取總RNA；采用該公司的HiScript III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) 試劑盒進行反轉錄；使用Ensembleplants (https://plants.ensembl.org/Hordeum_vulgare/Info/Index）下載葉綠素合成相關基因PORA、PORB、CAO、Xantha-h、Xantha-g、Xantha-f，與光合作用相關的基因ycf（光系統I組裝蛋白），葉綠體發育相關基因CMF7、CMF3、PTOX、LST和LFN1，編碼錯配修復蛋白的基因MSH1，與冷脅迫相關的基因COR的編碼區序列；利用primer 5.0軟件設計實時熒光定量PCR引物,交由擎科生物科技有限公司合成（表1）。以大麥GAPDH（HORVU.MOREX.r3.7HG0703580）基因和α-tublin（HORVU.MOREX.r3.1HG0082050）基因為內參，參照95 ℃ 30 s、95 ℃ 3 s、60 ℃ 20 s，40個循環的程序在7500 Real-time PCR 儀(Applied Biosystems 公司)上擴增, 利用自帶軟件分析 CT值，計算目的基因的相對表達量。利用G039與‘揚農啤5號’的比值代表各溫度下基因的相對表達量，試驗重復3次，取平均值。

表1 葉綠素合成、光合作用相關基因的定量引物Table 1 Primer of chlorophyll synthesis， photosynthesis related genes used fou quantitative real-time PCR

2 結果與分析

2.1 ‘揚農啤5號’與G039的大田表現分析

2.1.1 葉色分析 通過2020—2021與2021—2022年度連續2年的田間觀察發現，在大田生長條件下，相比較于野生型‘揚農啤5號’，突變體G039出苗即表現出明顯葉色黃化，并隨溫度降低二者差異愈發明顯（圖1A、1B）;至次年3月份，隨著氣溫逐漸回升，葉色逐漸轉綠，灌漿期G039與‘揚農啤5號’之間葉色差異消失（圖1C）。為進一步探索突變體G039出現黃葉表型原因，測定2個不同時期葉綠素含量。結果表明，與野生型相比，突變體G039苗期的總葉綠素、葉綠素a和葉綠素b含量極顯著降低（圖2A）;在灌漿期，突變體G039的葉綠素a含量與野生型‘揚農啤5號’無顯著差異，而葉綠素b和總葉綠素含量仍顯著低于‘揚農啤5號’（圖2B）。以上結果表明，G039葉色黃化原因是葉片葉綠素含量降低。

圖1 自然條件下野生型‘揚農啤5號’和突變體G039的表型Fig. 1 Phenotypes of ‘YNP5’ and G039 under natural condition

圖2 野生型‘揚農啤5號’和突變體G039葉綠素含量Fig. 2 Contents of chlorophyll pigments in ‘YNP5’ and G039

2.1.2 農藝性狀分析 通過對野生型與突變體成熟期相關農藝性狀的考察（表2）發現，突變體G039的株高、穗長、穗下節間長、分蘗數與每穗粒數均顯著低于野生型‘揚農啤5號’；而突變體G039的粒長、粒寬與千粒重均高于‘揚農啤5號’，并達到極顯著水平（圖1D、1E）。

表2 野生型‘揚農啤5號’與突變體G039的主要農藝性狀Table 2 Agronomic traits of the wild type ‘YNP5’ and mutant G039

2.2 不同溫度下葉片SPAD值分析

為了系統觀察突變體G039葉色受溫度的影響，對植株進行不同溫度處理。由圖3可知，‘揚農啤5號’與G039在不同溫度下培養2周后，葉片的SPAD值在各個溫度下均存在顯著差異，但隨著溫度的升高，‘揚農啤5號’與G039的SPAD值差異幅度不斷縮小，葉色差異也變小（圖4），說明G039葉色變化與生長環境溫度有關。

圖3 不同溫度下野生型‘揚農啤5號’與突變體G039的SPAD值Fig. 3 SPAD values of the ‘YNP5’ and G039 under different temperature conditions

圖4 不同溫度下野生型‘揚農啤5號’和突變體G039表型Fig. 4 Phenotypes of ‘YNP5’ and G039 under different temperature conditions

2.3 不同溫度葉片葉綠素含量分析

由圖5可知，4種溫度（10、15、20、25 ℃）下‘揚農啤5號’葉綠素含量與G039均存在顯著差異。在10 ℃條件下，G039的葉綠素含量最低，葉綠素a含量僅為‘揚農啤5號’的27.35%，葉綠素b含量為‘揚農啤5號’的20.83%，總葉綠素含量為‘揚農啤5號’的25.83%；隨著溫度的不斷上升，突變體G039的葉綠素a、葉綠素b含量呈現不斷增加的趨勢。G039葉綠素a與葉綠素b含量在不同溫度間變化明顯，說明G039葉片葉綠素含量變化與環境溫度相關，溫度越低，黃化越嚴重，葉綠素含量越低。

圖5 不同溫度下野生型‘揚農啤5號’與突變體G039的葉綠素含量Fig. 5 Chlorophyll content of the ‘YNP5’ and G039 under different temperature conditions

2.4 不同溫度葉片光合特性指標分析

不同溫度（10、15、20、25 ℃）下‘揚農啤5號’與G039的5種光合特性參數如圖6所示，‘揚農啤5號’的凈光合速率在不同溫度下無顯著變化，G039凈光合速率隨著溫度升高先升后降，在10 ℃時顯著低于‘揚農啤5號’，至20 ℃時與‘揚農啤5號’無顯著差異，之后出現轉折，25 ℃時與‘揚農啤5號’出現顯著差異（圖6A）?！畵P農啤5號’與G039的蒸騰速率與氣孔導度在4種溫度下均無顯著差異，且隨溫度變化趨勢相同，蒸騰速率均隨溫度升高持續上升，氣孔導度在10～20 ℃內大幅上升，在25 ℃時有所下降（圖6B、6C）?！畵P農啤5號’和G039的水分利用率與胞間CO2濃度在10 ℃時具有極顯著差異，在25 ℃時差異不顯著，并且二者隨溫度表現出了迥然不同的變化趨勢，‘揚農啤5號’的水分利用率隨溫度升高持續下降，G039的水分利用率在10～20 ℃時穩定上升，在25 ℃時有所下降；‘揚農啤5號’的胞間CO2濃度在10～20 ℃時表現出上升，在25 ℃時下降；G039則在10～25 ℃范圍內呈現穩定下降趨勢（圖6D、6E）。值得注意的是，‘揚農啤5號’與G039的多個光合指標在25 ℃時出現轉折。

圖6 不同溫度下‘揚農啤5號’與G039的光合指標Fig. 6 Photosynthetic indices of ‘YNP 5’ and G039 under different temperature conditions

2.5 不同溫度下葉綠體超微結構的差異分析

對10 和20 ℃下生長的突變體G039葉肉細胞中的葉綠體超微結構進行觀察，結果（圖7）顯示，相比于20 ℃，10 ℃下生長的突變體G039葉綠體數目明顯減少（圖7A、7D）；葉綠體內部結構也存在差異，10 ℃下的突變體G039類囊體發育紊亂，基粒片層堆疊更少，排列更疏松（圖7B、7C、7E、7F）。以上表明，低溫條件下突變體G039葉綠體發育受到嚴重影響，光合色素合成受阻，進而產生黃化葉表型。

圖7 不同溫度下突變體G039葉肉細胞的葉綠體超微結構Fig. 7 Ultrastructure of chloroplasts in cells of G039 mutant under different temperatures conditions

2.6 突變基因的遺傳分析

利用突變體G039分別與正常葉色的大麥品種‘揚農啤5號’和‘揚農啤7號’進行雜交，2個F1組合都表現為正常葉色，對2個F2分離群體的正常葉色與黃化類型單株進行統計與分析。由表3可知，2個F2分離群體野生型單株和突變型單株分離比均符合3∶1的分離比例（χ2=0.49,χ2=0.14,χ20.05=3.84），表明該突變性狀受1對隱性核基因獨立控制。

表3 突變性狀的遺傳分析Table 3 Genetic analysis of the mutant trait

2.7 光合相關基因表達分析

為研究G039葉色突變和低溫響應的分子調控機制，分析了G039及其野生型中與葉綠素合成、葉綠體發育及光系統建成等相關基因的表達水平。由圖8可知，與光系統組裝相關的YCF3在10、20和25 ℃時在G039中表達量顯著下調；與葉綠素合成相關的HvCAO和與葉綠體發育相關的HvPTOX在突變體G039中的表達量顯著下調，且不受溫度變化的影響；PORA與PORB編碼形成復合蛋白，在葉綠素合成途徑中有關鍵作用，10 ℃下G039中2個基因的表達量顯著低于‘揚農啤5號’，隨著溫度升高到20 ℃，G039與‘揚農啤5號’之間2個基因的表達不存在顯著差異；冷脅迫響應基因COR在20～25 ℃的G039與‘揚農啤5號’中均不表達，在10～15 ℃下G039中的表達量顯著低于‘揚農啤5號’。在4種溫度下，葉綠體發育相關的HvCMF3基因及編碼錯配修復蛋白的MSH1基因在G039中的表達量均顯著高于‘揚農啤5號’。因此，部分葉綠素合成途徑和葉綠體分化發育相關基因及冷脅迫響應基因表達異常可能是導致突變體G039葉綠素含量降低的重要因素。

圖8 不同溫度下葉綠素合成相關基因的相對表達量Fig. 8 Expression levels in genes involved in chlorophyll synthesis of YNP 5 and G039 under different temperature conditions

3 討論

葉色突變具有突變頻率高、表型易識別的特點，在大麥遺傳育種中有多方面的應用價值，是研究葉綠體發育與光合作用機制的重要材料；此外，也可作為標記性狀應用于雜交種篩選[21-22]。本研究中的黃化突變體G039苗期葉色黃化，葉綠素a與葉綠素b含量較野生型‘揚農啤5號’顯著下降。隨著溫度升高，突變體G039逐漸返綠，葉片SPAD值上升，對各項光合色素單獨測定，顯示葉綠素a與葉綠素b含量均顯著升高，葉綠體透射電鏡觀察顯示，10 ℃下G039較20 ℃下葉綠體數目顯著減少，形態異常，類囊體發育紊亂，基粒片層堆疊減少，認為突變體G039黃葉的表型是由于葉綠體發育異常和光合色素下降引起的，且表現出低溫敏感性。相比于SPAD儀法，乙醇浸提法測量色素含量具有穩定性高、精確性強的特點，能夠反映出特定種類葉綠素的含量，有利于判斷葉綠素合成途徑如何受到影響。

閆偉平等[23]研究發現，26～28 ℃條件下最利于玉米光合作用的進行；江華等[24]、楊淑巧等[25]研究認為，小麥光合作用的最適溫度在20 ℃左右。本研究中，突變體G039凈光合速率隨溫度上升而升高，20 ℃時與‘揚農啤5號’無差異；至25 ℃時再次產生差異，可能是由于溫度偏高導致凈光合速率產生微小降低，G039的凈光合速率在20與25 ℃時無顯著差異，因此大麥光合作用的最適溫度在20 ℃左右。

本研究中，‘揚農啤5號’與G039的蒸騰速率均隨溫度上升而升高，這與閆蓉等[26]的結論相同；‘揚農啤5號’與G039的氣孔導度在10～20 ℃隨著蒸騰速率的上升而升高，這與董樹亭等[27]的結論一致，但在25 ℃時氣孔導度下降，可能是由于溫度高于大麥光合作用的最適溫度，造成‘揚農啤5號’與G039的氣孔導度下降。此外，‘揚農啤5號’的胞間CO2濃度與G039的水分利用率在25 ℃時也發生轉折，可能與氣孔導度下降有一定關系。在10～20 ℃范圍，‘揚農啤5號’的水分利用率隨著溫度升高而降低，胞間CO2濃度隨著氣孔導度變大而升高，與劉亮等[28]的研究結論一致；但G039在2項上的變化卻與‘揚農啤5號’相反，認為G039凈光合速率大幅上升，抵消了氣孔導度對胞間CO2濃度的影響，造成胞間CO2濃度持續下降，而在光合學中水分利用率為凈光合速率與蒸騰速率的比值，因此，G039的水分利用率隨之上升。本試驗中，突變體G039的蒸騰速率與氣孔導度與野生型無差異，而凈光合速率、水分利用率顯著低于‘揚農啤5號’，胞間CO2濃度顯著高于‘揚農啤5號’，表明黃化會導致植株凈光合速率顯著下降，但蒸騰速率、氣孔導度、胞間CO2濃度等其他指標的變化取決于突變對細胞結構及葉綠體發育造成的不同影響。值得注意的是，G039在株高、穗長、穗下節間長、分蘗數、每穗粒數上顯著低于野生型‘揚農啤5號’，但粒長、粒寬與千粒重均顯著高于‘揚農啤5號’，表明葉色基因可能參與調控粒型。千粒重作為決定產量的關鍵因素，進一步研究有利于探究葉色基因調控大麥產量的機理，對增加大麥產量具有重要的理論意義。

迄今為止，不同物種中已有數個葉色基因被克隆，如直接編碼葉綠素合成與降解的基因HvCAO、Xantha-f、PORB等，參與調節葉綠體發育的基因virescent-1(v1)[29]、virescent-2(v2)[30]、OsPPR16[31]等，參與光合作用及光系統發育的基因OspsaA[32]與YCF3等。CAO基因控制葉綠素a轉化為葉綠素b，由3個結構域構成：A域感知葉綠素b含量并調控CAO蛋白水平，B域鏈接器控制域間的聯系，C域催化葉綠素a轉化為葉綠素b；域與域之間相互協作，任一結構域受損均會影響葉綠素b合成。本研究中，在低溫條件下突變體G039的葉綠素合成及葉綠體分化相關基因表達量下調，其中編碼葉綠素a加氧酶基因HvCAO在不同溫度下的表達量均顯著低于野生型‘揚農啤5號’，該酶將葉綠素a一條支鏈的甲基轉化為甲?；?，形成葉綠素b，在葉綠素代謝途徑中發揮不可替代的作用[12]。HvPTOX是光合作用及葉綠體分化相關基因簇成員，該基因下調表達導致G039光合速率的下降，可能與葉綠體發育缺陷有關[33]。PORA與PORB編碼原葉綠素酸酯氧化還原酶，低溫下在G039中二者均顯著下調表達，隨著溫度升高，其在G039與‘揚農啤5號’中的表達量差異逐漸縮小，20 ℃以上PORB在G039與‘揚農啤5號’之間不存在顯著差異，說明突變體植株的葉綠素合成在低溫下受阻，使葉綠素含量大幅下降。HvCMF3作用于光系統Ⅱ及葉綠體分化[15]，不同溫度下，突變體G039的HvCMF3均較野生型‘揚農啤5號’上調表達，G039基因突變可能反饋上調HvCMF3的表達。此外，突變體中光系統編碼基因YCF3的轉錄水平顯著下調，G039基因突變可能阻礙了光系統的正常組裝，對其結構和功能造成影響，抑制光反應的正常進行；而編碼錯配修復蛋白的MSH1基因在不同溫度G039中的表達量均明顯高于‘揚農啤5號’，G039基因突變可能通過反饋調節改變該基因的表達水平；COR編碼1個低溫響應蛋白，20～25 ℃時不表達，10～15 ℃時突變體G039中表達量顯著低于野生型‘揚農啤5號’，表明COR基因受低溫脅迫誘導，且表達受葉綠體發育影響。