影響小麥面團強度的貯藏蛋白基因表達研究

晁岳恩,王沙沙,楊 劍,楊 攀,黃 超,汪慶昌,曹廷杰

(河南省農業科學院小麥研究所,河南鄭州 450002)

小麥是我國主要農作物之一,是多種面食的原料。小麥面粉的獨特性在于其蛋白與水相互作用能交聯形成疏松多孔的面筋。小麥的加工品質與其蛋白含量密切相關,小麥粉含有8%～20%的蛋白質,其中面筋蛋白約占小麥總蛋白質含量的80%～85%,面筋蛋白的類型和含量影響面團的強度、粘彈性、延展性等指標,決定著面粉的加工適用性[1-5]。在實際面制品加工中發現,部分小麥品種蛋白含量較低,但面筋強度較高,說明面粉質量不僅受籽粒蛋白含量影響,蛋白成份也是重要的影響因素[6]。面筋蛋白的主要成份是麥谷蛋白和醇溶蛋白,麥谷蛋白按分子量大小可分為高分子量麥谷蛋白(HMW-GS)和低分子量麥谷蛋白(LMW-GS);HMW-GS通過分子間或分子內二硫鍵作用形成面筋骨架,決定著面團的強度和彈性[5-10]。HMW-GS僅占總面筋蛋白的10%,其亞基的組合方式被認為決定著70%的面粉質量特性[11-12];除遺傳因素外,栽培措施對面粉質量也有影響[13]。

在育種過程中卻發現,即使HMW-GS組合完全一致、蛋白含量相同的小麥品種的面粉質量存在較大差異,面團強度參數存在顯著差異,暗示除HMW-GSs外,可能還存在其它影響面團強度性狀的蛋白類型。本研究以具有一定親緣關系且HMW-GS組合完全一致、蛋白含量基本相同、面粉質量有較大差異的兩個品種為材料,在籽粒面筋蛋白積累速度較為穩定的灌漿中期[14-16],通過轉錄組測序分析兩個品種面筋蛋白相關基因的表達差異,探討其面粉質量差異的可能原因,為小麥品質育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試品種為鄭麥369和鄭麥158,前期研究發現,二者間HMW-GS組含完全相同,蛋白含量相同,面團強度差異顯著。于2019—2020年度種植在河南省農業科學院試驗基地,小區長6 m,寬2 m,行距0.2 m,相鄰種植,無重復,常規管理。鄭麥369親本組合為鄭麥366×良星99,鄭麥158親本組合為(Bigeaz-250/96)×周麥16)×鄭麥366。轉錄組測序分析樣品分別取自花后14、21、28 d的穗中部兩側籽粒,液氮速凍后帶回試驗室保存于-80 ℃冰箱。收取成熟籽粒,磨粉并測定面粉質量參數。

1.2 面粉品質參數檢測

制粉:參照AACC 26-20方法,用BUHLER實驗磨磨粉。粗蛋白含量:用丹麥FOSS公司凱氏定氮儀Kjeltec測定。面團流變學參數:用德國Brabender公司的810104型粉質儀(Farinograph),按GB/T14614-93測定吸水率、面團形成時間、穩定時間、弱化度。面筋參數:用瑞典Perten公司的2200型面筋儀(Glutomatic),按GB/T14608-93測定小麥粉濕面筋含量及濕面筋指數。

1.3 面粉蛋白提取

醇溶蛋白和麥谷蛋白提取按照文獻優化的方法[17],其中,SDS-PAGE分離膠濃度12%,濃縮膠濃度4%,考馬斯亮藍(R-250)染色。

1.4 轉錄組測序及生物信息學分析

RNA提取、轉錄組測序及生物學信息分析由杭州聯川生物技術有限公司(中國,杭州)完成,所有技術操作、基因組比對、轉錄本組裝、FPKM定量及GO和KEGG富集分析工作均由該公司完成。每個樣品三次生物學重復。使用StringTie軟件(https://ccb.jhu.edu/software/hisat2)對基因或轉錄本進行組裝并用FPKM[每百萬測序片段中來自某一基因每千堿基長度的數目:FPKM = total_exon_fragments / mapped_reads(millions) 的exon_length(kB)]定量,使用R包edgeR(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html)對樣本之間的差異基因進行分析,差異倍數>2倍或<0.5倍,且P<0.05定義為差異表達基因。

1.5 面粉硫及巰基含量測定

硫含量檢測:濃硝酸消化后用液相離子色譜測定硫元素含量(IC-2001; TOSOH, Japan),陰離子標準液使用Wako Pure Chemicals(Japan),詳細操作采用Maruyama優化的方法[18]?？値€基和自由巰基含量測定及二硫鍵含量計算參考Wang等[19]的方法。

1.6 蛋白質量評價

從NCBI數據庫下載不同類型的HMW-GSs氨基酸序列信息,利用巰基和二硫鍵含量預測在線程序(SCRATCH Protein Predictor:http://scratch.proteomics.ics.uci.edu),對部分差異表達基因編碼蛋白和HMW-GSs的自由巰基、二硫鍵含量進行預測,并利用蛋白質量評價模型進行評分比較[20]。

1.7 數據處理

采用 Excel 2007進行數據分析和顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 面粉質量參數分析

從表1可知,兩個品種的粗蛋白含量無顯著差異,鄭麥158的濕面筋含量和吸水率顯著低于鄭麥369,但面筋指數、形成時間和穩定時間顯著高于后者,鄭麥158穩定時間約為鄭麥369的兩倍,推測鄭麥158含有較多對面團強度貢獻較大的面筋蛋白。

2.2 面筋蛋白亞基分析

從圖1可以看出,兩個品種的HMW-GS組合完全一致(1、5+10、7+8),說明HMW-GS組合可能不是兩個品種之間面粉質量差異的主要原因;LMW-GSs和醇溶蛋白的電泳圖譜稍有差異,推測這些蛋白的組成和含量差異可能是導致兩個品種之間品質差異的原因。

圖1 兩個品種的麥谷蛋白和醇溶蛋白電泳圖

2.3 面筋蛋白的基因表達差異

根據測序結果,發現在小麥花后14、21、28 d時,兩個品種間籽粒中HMW-GS基因表達均無顯著性差異,這與其蛋白檢測結果相同,說明HMW-GSs不是兩個品種間面團強度性狀差異的主要原因。由表2可知,與鄭麥369比較,鄭麥158在3個時間點共有24個(46次)基因表達有顯著差異,其中顯著上調表達基因12個(23次),顯著下調表達基因12個(23次)。上調表達基因包括9個燕麥類似蛋白基因(18次)、2個γ-醇溶蛋白基因(4次)和1個α-醇溶蛋白基因;下調表達基因包括11個α-或α/β-醇溶蛋白基因(21次)和1個燕麥類似蛋白基因(2次)。其中,燕麥類似蛋白基因占鄭麥158顯著上調表達基因總量的75%,暗示燕麥類似蛋白可能對面團強度性狀有重要作用。

表1 兩品種的面粉品質特性

表2 不同發育時期籽粒中表達顯著差異的貯藏蛋白基因

鄭麥158顯著上調表達基因的染色體組定位分析顯示,上調表達的基因全部位于A、D染色體組,其中A染色體組基因出現15次,占總數的65%。另外,從燕麥類似蛋白的染色體定位看,這些基因分別定位在7A、7D和4A染色體,7B染色體未發現差異表達的燕麥類似蛋白基因。所以,從本研究兩個材料來說,A組染色體編碼的面筋蛋白與面粉強度性狀的相關性最高,D組次之。

2.4 面粉硫及巰基集團含量分析

為分析兩個品種的巰基集團含量與面粉品質的相關性,對面粉中的硫和巰基(自由巰基、總巰基)及分子內二硫鍵含量進行了分析,結果(表3)發現,二者間總巰基含量無顯著差異,鄭麥158的總硫含量明顯較低,其自由巰基含量顯著高于鄭麥369。面粉中面筋蛋白占總蛋白含量的80%以上,可以用面粉中的硫及巰基含量衡量其在面筋蛋白中的含量。暗示在含硫氨基酸的組成上,鄭麥158面筋蛋白中的半胱氨酸殘基含量比例較高,且分子內二硫鍵比例較低,而鄭麥369面筋蛋白中的甲硫氨酸殘基含量比例較高。

表3 兩個品種面粉中的巰基含量

2.5 差異表達蛋白的質量評價

根據在線軟件(SCRATCH Protein Predictor)的分析原理,蛋白分子內二硫鍵的有無和自由巰基數量分屬兩個獨立的預測,即:當一個蛋白被預測為無分子內二硫鍵時,也會預測潛在的二硫鍵含量。因此,在對蛋白的面粉質量貢獻進行評價時,首先考慮二硫鍵的有,然后再考慮二硫鍵的數量。當一個蛋白預測為無分子內二硫鍵時,其半胱氨酸數量全部視為自由巰基數量;有分子內二硫鍵時,總半胱氨酸數量減去形成二硫鍵的半胱氨酸數量后剩余的半胱氨酸數量即為自由巰基數量。具體評分方法按照分值=0.9x+0.3y計算,其中x為某個蛋白質的自由巰基數量,y為這個蛋白質的分子內二硫鍵數量[20]。

從數據庫下載的部分HMW-GSs和差異表達基因編碼蛋白的評估分值見表4和表5,按照HMW-GS對面團強度貢獻評分不低于3.6作為優質蛋白評價標準,11個上調的差異表達基因編碼蛋白中,有9個達到優質蛋白標準,其中γ-醇溶蛋白(TraesCS1D02G001100)在3個時間點都顯著上調表達,且分值超過了全部HMW-GS的評分;僅有有兩個基因(TraesCS4A02G451811:Avenin-like b1;TraesCS1A02G007700:Gamma-gliadin A)沒有達到優質亞基標準,但其評分(3.0分)也與中等類型的HMW-GS相同。在分析的3個下調基因中(在3個時間點出現8次),也有1個編碼蛋白達到了優質HMW-GS的分值,表明可能也有對面團強度有貢獻的蛋白在鄭麥158中呈下調表達趨勢。

表4 基于巰基預測結果的HMW-GS質量評價

表5 基于巰基預測結果的差異表達基因編碼蛋白的質量評價

3 討論

面團強度參數是衡量面粉品質的重要指標,與面包烘焙體積呈正相關[5]。HMW-GS及其組合方式是影響面團強度的主要遺傳因素[5-12]。本研究結果卻表明,燕麥類似蛋白和部分醇溶蛋白對面團強度性狀也有較大影響。

燕麥類似蛋白為近年來發現的一類富含半胱氨酸的小麥面筋蛋白,被視為非典型面筋蛋白質成分(atypical gluten components),包括a、b兩個大類,又可分為若干小類[21-22]。目前,燕麥類似蛋白與面粉品質的相關研究還不多,已有的研究與本研究結果相似,如Wang等[23]曾將中國春中的一個b類燕麥類似蛋白基因在鄭麥9023中表達,轉基因材料的面團強度明顯提高,但在這個蛋白中額外引入1個半胱氨酸突變后,面團強度和彈性下降;二硫鍵預測結果表明,新增加的巰基與分子內的其他自由巰基形成了分子內二硫鍵,表明與總巰基含量相比,面筋蛋白的高自由巰基含量才是其影響面團強度的根本原因。Ma等[24-25]研究也發現,類燕麥b貯藏蛋白具有改善面團強度的潛力。關于a類燕麥類似蛋白與面粉質量的關系,目前尚未檢索到相關研究文獻,但從本研究結果看,高面團強度品種鄭麥158的9個顯著上調的燕麥類似蛋白基因中,包括5個a類燕麥類似蛋白基因,且評分也全部達到了優質蛋白水平,由此推測a類燕麥類似蛋白在面團強度性狀中發揮著重要效應。

差異表達基因的染色體組定位分析顯示,燕麥類似蛋白基因全部位于A、D染色體組,在B組染色體上沒有發現燕麥類似蛋白基因。據推測,普通六倍體小麥的四倍體祖先中曾發生過4AL/7BS易位或近著絲粒倒位情況,可能導致了原來應該位于7BS的燕麥蛋白編碼位點轉移到了4AL上[26]。

醇溶蛋白是面筋蛋白的主要成分之一,通常認為,醇溶蛋白是以非共價鍵形式結合到面筋中,主要影響面團的粘性和延展性,對面團強度具有負向效應。本研究結果表明,高面團強度鄭麥158的顯著下調表達的基因中,醇溶蛋白基因數量占總數的78.6%,這與醇溶蛋白對于面團強度具有負向效應的觀點一致[27-29]。但是,在鄭麥158的顯著上調表達基因中,兩個γ-醇溶蛋白(TraesCS1D02G001100,TraesCS1A02G007700)基因也表現顯著性上調,其中位于1D染色體的醇溶蛋白(TraesCS1D02G001100)基因在3個時期均表現顯著性上調,生物信息學分析表明其含有8個自由巰基,面團強度的貢獻評分為7.2分,超過了公認的優質HMW-GS(1Dy10和1Dx5),暗示其面團強度有較大貢獻。有研究表明,某些醇溶蛋白也可以通過分子間二硫鍵結合到面筋中(尤其是奇數半胱氨酸殘基含量的蛋白質至少存在一個自由巰基),進而影響到面團的強度[20,30-34]。

研究表明,面粉蛋白中的自由巰基和二硫鍵對面團結構及面團穩定性有重要影響,在揉面過程中,不同面粉蛋白質分子的自由巰基相互結合成二硫鍵,形成的面筋骨架決定著面團的結構和特性[35-39]。因此,小麥蛋白中的巰基含量是決定面團流變學特性及烘焙質量的關鍵因素[40-41]。本研究表明,高面團強度的鄭麥158中,自由巰基含量、總巰基含量和總二硫鍵含量均高于面團強度較低的鄭麥369。因此,進一步探索小麥籽粒蛋白中的高半胱氨酸和高自由巰基含量形成原因,對于闡釋小麥面粉質量形成機制、完善優質小麥育種技術具有參考意義。

4 結論

燕麥類似蛋白在面團強度性狀上有較大貢獻,可能是決定面團強度性狀的另一遺傳因素,個別類型的γ-醇溶蛋白可能對面團強度性狀也有貢獻;探索小麥籽粒蛋白中高半胱氨酸和高自由巰基含量的形成原因,對于完善現有優質小麥育種技術具有一定的參考意義。