circRASSF2靶向miR-1343-3p對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖和凋亡的影響

趙津津，王振宇，馬貞秀

乳腺癌是一種嚴重危害女性健康的惡性腫瘤，隨著對乳腺癌發病機制認識的加深，分子靶向逐漸應用于乳腺癌的治療［1-2］。確定潛在的分子靶標有助于開發新的靶向治療藥物。研究表明，circRNA在多種癌癥中異常表達，可作為腫瘤診斷的生物標志物，可提供新的癌癥治療的靶標［3］。circRASSF2是位于20 號染色體且來源于Ras 相關序列家族2（ras association domain family 2，RASSF2）的一種circRNA。文獻報道，circRASSF2在喉鱗狀細胞癌組織和細胞系中顯著上調，敲除circRASSF2 可通過上調miR-302b-3p/IGF-1R 軸顯著抑制喉鱗癌細胞增殖和遷移［4］。circRASSF2在結直腸癌組織和細胞系中上調，敲除circRASSF2 可通過上調miR-195-5p、下調卷曲蛋白4（frizzled 4，FZD4）表達，從而抑制結直腸癌細胞的增殖并促進其凋亡［5］。然而，circRASSF2在乳腺癌中的作用及機制尚不清楚。在卵巢癌中，miR-1343-3p 表達下調，miR-1343-3p 的過表達可抑制卵巢癌的細胞生長和遷移［6］。LINC02323可通過海綿化miR-1343-3p促進肺腺癌的上皮-間質轉化和轉移［7］。lncRNA GAS8-AS1 通過靶向下調miR-1343-3p/自噬相關蛋白7 軸，從而促進甲狀腺癌細胞的自噬［8］。據此，筆者認為miR-1343-3p 可能參與調控了多種癌癥的進展。目前，miR-1343-3p 對乳腺癌的影響及其是否被circRASSF2 調控尚未知。 本研究旨在探討circRASSF2 對乳腺癌細胞增殖、凋亡的影響及其與miR-1343-3p的靶向調控關系。

1 材料與方法

1.1 主要材料

收集2021 年1 月—2022 年4 月于青海省第五人民醫院收治的37例乳腺癌患者的癌及癌旁組織，均為手術切除后超低溫冰箱內保存。乳腺癌細胞株MDA-MB-231（上海烜雅生物科技有限公司）；轉染物si-circRASSF2及其陰性對照物si-NC，miR-1343-3p 及其陰性對照物miR-NC（廣州銳博生物有限公司）；Lipofectamine?2000 Transfection Reagentt 轉染試劑購自美國Invitrogen公司；抗體Cleaved-caspase 3、Cleavedcaspase 9（英國abcam 公司）；Trizol 試劑、逆轉錄熒光定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）試劑盒（日本Takara公司）；蛋白提取試劑盒（上海臻諾生物科技有限公司）；四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）試劑盒、凋亡試劑盒（日本同仁研究所）；RPMI-1640培養基（美國Gibco 公司）；雙熒光素酶報告實驗試劑盒（上海澤葉生物科技有限公司）；T100PCR儀（美國Bio-Rad公司）；Multiskan GO 酶標儀、Western blot 系統、凝膠成像分析系統和細胞培養箱（美國賽默飛世爾公司）；FACSAria?Fusion 流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2 細胞轉染與分組

將MDA-MB-231 細胞培養于RPMI-1640 培養基中，至對數生長期時按5.0×105個/孔接種至96 孔板。將細胞分為miR-1343-3p 組（轉染miR-1343-3p）、si-circRASSF2 組（轉染si-circRASSF2）、si-NC 組（轉染si-NC）、miR-NC 組（轉染miR-NC）、si-circRASSF2+anti-miR-1343-3p 組（共轉染sicircRASSF2 和anti-miR-1343-3p）及si-circRASSF2+antimiR-NC組（共轉染si-circRASSF2和anti-miR-NC）。

1.3 RT-qPCR 檢測circRASSF2、miR-1343-3p 的相對表達水平

取乳腺癌組織、癌旁組織及各組細胞，加入Trizol 試劑提取總RNA，取200 ng RNA 逆轉錄合成cDNA，以cDNA 為模板進行PCR。circRASSF2引物序列：上游5'-CTTTTCAAA GAGAGTGGCCCAG-3'，下游5'-ACGGTGTACTTGCGCATCA G-3'；miR-1343-3p：上游5'-CGAAGTTCCCTTTGTCATCCT-3'，下游5'-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3'；GAPDH：上游5'-AGTCAGGCTGGGGCTCATTG-3'，下游5'-AGGGGCCATC CACAGTCTTC-3'；U6：上游5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。反應條件：94 ℃2 min；94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃60 s，循環30 次。GAPDH和U6 分別為circRASSF2 和miR-1343-3p 的內參基因，采用2-ΔΔCt法計算circRASSF2、miR-1343-3p相對表達量。

1.4 MTT法檢測細胞活性

各組細胞培養48 h后接種于96孔板（200μL，3×103個/孔）。每孔加10μL MTT 試劑（5 g/L），培養4 h加入150μL DMSO，多功能酶標儀檢測490 nm波長處光密度（OD）值。

1.5 克隆形成實驗檢測細胞克隆形成數

分別取各組細胞并接種至6 孔板（1×103個/孔），37 ℃培養2 周。磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗2 次，加入甲醇固定2～3 min 后滴加吉姆薩染色液染色，于光學顯微鏡下計數克隆形成數（＞50個細胞）。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡

轉染48 h 后用0.125%胰蛋白酶制備細胞懸液，室溫250×g離心5 min，用4 ℃預冷PBS 洗滌2 次后將細胞重懸于結合緩沖液，濃度為1×106個/mL。隨后，在暗室中用Annexin V-FITC和PI孵育15 min；上流式細胞儀檢測，FlowJo 7.6.1分析細胞凋亡情況。

1.7 Western blot 檢測Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9蛋白相對表達水平

取各組細胞，通過蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，進行蛋白定量后行SDS-PAGE 凝膠電泳，轉膜、封閉，加Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9 一抗稀釋液（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，加二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h，曝光顯影，Image Lab軟件分析各蛋白條帶灰度值。

1.8 雙熒光素酶實驗檢測circRASSF2 和miR-1343-3p 的靶向關系

采用Starbase 軟件（https://starbase.sysu.edu.cn/）預測circRASSF2與miR-1343-3p有無結合位點。將野生型（WT）和突變型（MUT）circRASSF2 雙熒光素酶報告載體、miR-NC及miR-1343-3p共轉染乳腺癌細胞株MDA-MB-231，48 h后按照試劑盒說明書檢測miR-NC組和miR-1343-3p組細胞中circRASSF2 熒光素酶相對活性。分別將pcDNA、pcDNAcircRASSF2、si-circRASSF2、si-NC 轉染MDA-MB-231 細胞，記為pcDNA組、pcDNA-circRASSF2組、si-circRASSF2組、si-NC組，按照1.3方法檢測各組miR-1343-3p表達水平。

1.9 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以±s表示，2組間比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 circRASSF2、miR-1343-3p在乳腺癌中的表達

與癌旁組織比較，乳腺癌組織中circRASSF2 表達水平升高，miR-1343-3p 表達水平降低（P＜0.01），見表1。

Tab.1 Comparison of circRASSF2 and miR-1343-3p expression levels between breast cancer tissue and paracancer tissue表1 乳腺癌組織和癌旁組織中circRASSF2和miR-1343-3p的表達水平比較（n=37，±s）

Tab.1 Comparison of circRASSF2 and miR-1343-3p expression levels between breast cancer tissue and paracancer tissue表1 乳腺癌組織和癌旁組織中circRASSF2和miR-1343-3p的表達水平比較（n=37，±s）

＊＊P＜0.01。

組織癌旁組織乳腺癌組織t circRASSF2 1.00±0.02 4.03±0.21 89.518＊＊miR-1343-3p 1.00±0.05 0.37±0.03 60.709＊＊

2.2 si-NC組和si-circRASSF2組細胞增殖水平比較

與si-NC 組比較，si-circRASSF2 組circRASSF2表達水平和MDA-MB-231細胞活性降低，細胞克隆形成數減少（P＜0.01），見圖1、表2。

Tab.2 Comparison of cell proliferation between the si-NC group and the si-circRASSF2 group表2 si-NC組和si-circRASSF2組細胞增殖水平比較（n=3，±s）

Tab.2 Comparison of cell proliferation between the si-NC group and the si-circRASSF2 group表2 si-NC組和si-circRASSF2組細胞增殖水平比較（n=3，±s）

＊＊P＜0.01。

組別si-NC組si-circRASSF2組t circRASSF2 1.00±0.06 0.34±0.02 19.219＊＊OD490 0.71±0.06 0.34±0.03 9.992＊＊克隆形成數/個101.25±8.96 48.79±2.34 9.815＊＊

2.3 si-NC組和si-circRASSF2組細胞凋亡比較

與si-NC組比較，si-circRASSF2組細胞凋亡率、Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9 表達水平升高（P＜0.01），見圖2、3，表3。

Fig.2 Apoptosis of the si-NC group and the si-circRASSF2 group圖2 si-NC組和si-circRASSF2組細胞凋亡情況

Fig.3 Expression levels of apoptosis related proteins in the si-NC group and the si-circRASSF2 group圖3 si-NC組和si-circRASSF2組細胞凋亡相關蛋白表達

Tab.3 Comparison of apoptosis rate and related protein expression levels between the si-NC group and the si-circRASSF2 group表3 si-NC組和si-circRASSF2組細胞凋亡率及凋亡相關蛋白表達比較（n=3，±s）

Tab.3 Comparison of apoptosis rate and related protein expression levels between the si-NC group and the si-circRASSF2 group表3 si-NC組和si-circRASSF2組細胞凋亡率及凋亡相關蛋白表達比較（n=3，±s）

＊＊P＜0.01。

組別si-NC組si-circRASSF2組t細胞凋亡率/%8.75±0.13 23.89±3.21 8.156＊＊Cleavedcaspase 3 0.27±0.04 0.75±0.09 8.486＊＊Cleavedcaspase 9 0.20±0.02 0.54±0.06 10.304＊＊

2.4 circRASSF2靶向調控miR-1343-3p

circRASSF2與miR-1343-3p存在互補的核苷酸序列，見圖4。與miR-NC 組比較，miR-1343-3p 組WT-circRASSF2 熒光素酶活性降低（t=9.076，P＜0.05），而2 組MUT-circRASSF2 熒光素酶活性差異無統計學意義（t=0.475，P＞0.05），見圖5A。RT-qPCR結果顯示，與pcDNA 組比較，pcDNA-circRASSF2 組miR-1343-3p 表達水平降低（t=51.898，P＜0.05），與si-NC組比較，si-circRASSF2組miR-1343-3p表達水平升高（t=23.106，P＜0.05），見圖5B。

Fig.4 Binding sequence of circRASSF2 and miR-1343-3p圖4 circRASSF2與miR-1343-3p的結合序列

Fig.5 circRASSF2 targeting regulates the expression of miR-1343-3p圖5 circRASSF2靶向調控miR-1343-3p的表達

2.5 miR-NC 組和miR-1343-3p 組乳腺癌MDAMB-231細胞增殖、凋亡水平比較

與miR-NC組比較，miR-1343-3p組miR-1343-3p 表達水平升高，細胞凋亡率升高，Cleavedcaspase 3、Cleaved-caspase 9 表達水平升高，細胞活性下降，克隆形成數減少（P＜0.01），見圖6、7，表4。

Fig.6 Clonal formation and apoptosis in the miR-NC group and the miR-1343-3p group圖6 miR-NC組和miR-1343-3p組細胞克隆形成和凋亡

Fig.7 Expression of apoptosis related proteins in the miR-NC group and the miR-1343-3p group圖7 miR-NC組和miR-1343-3p組細胞凋亡相關蛋白表達

Tab.4 Comparison of proliferation and apoptosis between the miR-NC group and the miR-1343-3p group表4 miR-NC組和miR-1343-3p組細胞增殖和凋亡比較（n=3，±s）

＊＊P＜0.01。表5同。

組別miR-NC組miR-1343-3p組t miR-1343-3p 1.01±0.02 3.21±0.13 28.357＊＊OD490 0.70±0.05 0.42±0.03 9.058＊＊克隆形成數/個99.87±8.43 50.23±2.45 9.794＊＊細胞凋亡率/%7.48±0.51 19.96±2.03 10.317＊＊Cleaved-caspase 3 0.25±0.03 0.73±0.08 9.821＊＊Cleaved-caspase 9 0.19±0.02 0.48±0.05 10.793＊＊

2.6si-circRASSF2+anti-miR-NC 組 和 sicircRASSF2+anti-miR-1343-3p 組乳腺癌MDAMB-231細胞增殖和凋亡比較

與si-circRASSF2+anti-miR-NC 組比較，sicircRASSF2+anti-miR-1343-3p 組miR-1343-3p 表達水平、細胞凋亡率、Cleaved-caspase 3、Cleavedcaspase 9 表達水平降低，細胞活性和克隆形成數升高（P＜0.05），見表5，圖8、9。

Fig.8 Clonal formation and apoptosis in the si-circRASSF2+antimiR-NC group and the si-circRASSF2+anti-miR-1343-3p group圖8 si-circRASSF2+anti-miR-NC組和si-circRASSF2+anti-miR-1343-3p組細胞克隆形成和凋亡

Tab.5 Proliferation and apoptosis in the si-circRASSF2+anti-miR-NC group and the si-circRASSF2+anti-miR-1343-3p group表5 si-circRASSF2+anti-miR-NC組和si-circRASSF2+anti-miR-1343-3p組細胞增殖和凋亡（n=3，±s）

Tab.5 Proliferation and apoptosis in the si-circRASSF2+anti-miR-NC group and the si-circRASSF2+anti-miR-1343-3p group表5 si-circRASSF2+anti-miR-NC組和si-circRASSF2+anti-miR-1343-3p組細胞增殖和凋亡（n=3，±s）

組別si-circRASSF2+anti-miR-NC組si-circRASSF2+anti-miR-1343-3p組t miR-1343-3p 1.00±0.03 0.28±0.02 35.040＊＊OD490 0.39±0.02 0.65±0.04 10.373＊＊克隆形成數/個40.78±3.51 82.63±8.74 7.696＊＊細胞凋亡率/%27.45±3.11 12.13±0.98 8.140＊＊Cleavedcaspase 3 0.75±0.09 0.32±0.04 7.460＊＊Cleavedcaspase 9 0.52±0.06 0.24±0.02 7.545＊＊

3 討論

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，其治療方法包括手術、化療和免疫治療，然而由于局部復發和轉移發生率較高，晚期乳腺癌患者預后仍然很差［9］。因此，確定新的生物標志物對開發乳腺癌新靶向治療很有必要。研究顯示，circRNA 參與調控乳腺癌的惡性生物學行為，如circ_0025202 可以抑制乳腺癌細胞的增殖、集落形成和遷移，并增加癌細胞凋亡［10］。沉默circ_0004771 通過靶向miR-653/ZEB2以抑制乳腺癌的增殖并誘導其凋亡［11］。Zhong 等［12］研究顯示，circRASSF2 在乳腺癌組織和血清中表達增加，敲除circRASSF2 后乳腺癌細胞的增殖能力下降。本研究結果亦顯示，circRASSF2 在人乳腺癌組織中表達水平升高，抑制circRASSF2 表達可降低MDA-MB-231 細胞增殖活性，并使細胞凋亡率升高，表明抑制circRASSF2 可促進乳腺癌細胞凋亡和抑制癌細胞增殖，提示circRASSF2 的失調參與了乳腺癌的進展。

通過生物信息學分析發現，circRASSF2 可以靶向調控各種miRNAs 表達。本研究選擇了其中的miR-1343-3p 作為circRASSF2 的靶點。研究顯示，miR-1343-3p 在胰腺癌中低表達，LINC01559 通過充當miR-1343-3p的競爭性內源RNA 來上調RAF1表達，從而促進胰腺癌的進展［13］。LINC01559 海綿化miR-1343-3p，上調PGK1，激活PI3K/AKT 途徑，進而促進胃癌的發展［14］。EIF3J-AS1 通過海綿化miR-1343-3p 上調ANXA11 表達，從而促進神經膠質瘤細胞增殖［15］。本研究結果顯示，在乳腺癌組織中miR-1343-3p低表達，且miR-1343-3p過表達后，細胞活性、克隆形成數下降，凋亡率升高，表明上調miR-1343-3p表達可抑制乳腺癌細胞增殖和促進細胞凋亡，提示miR-1343-3p 具有抗乳腺癌作用。通過雙熒光素酶報告基因檢測驗證了circRASSF2 與miR-1343-3p有靶向關系，發現兩者表達水平相反。在檢測細胞增殖和凋亡后，本研究發現circRASSF2敲除對乳腺癌細胞的影響可以通過抑制miR-1343-3p表達部分逆轉，提示抑制circRASSF2表達可通過上調miR-1343-3p，從而抑制MDA-MB-231 細胞增殖并促進其凋亡。

綜上所述，circRASSF2在乳腺癌中高表達，抑制circRASSF2可通過上調miR-1343-3p來抑制乳腺癌細胞增殖，并促進細胞凋亡。circRASSF2 通過下調miR-1343-3p的表達，促進乳腺癌增殖并阻礙凋亡，circRASSF2有望成為乳腺癌的潛在診斷生物標志物和治療靶點。然而，由于本研究所納入的臨床標本有限，且檢測手段單一、缺乏體內實驗等，因此后續需針對此類問題進行完善和深入探討。