梓醇對IL-1β誘導軟骨細胞損傷的保護機制研究

馬玲，鐘利國，崔裕如，劉彬

骨關節炎（osteoarthritis，OA）屬于慢性退行性關節疾病，是導致殘疾的主要原因，而炎性細胞因子與OA 發病關系密切［1-2］。白細胞介素（IL）-1β 可誘導軟骨細胞釋放蛋白水解酶和其他炎性細胞因子產生，促進OA 發生［3］。梓醇是一種中藥提取物，具有減輕IL-1β 誘導的大鼠軟骨細胞炎癥反應、細胞凋亡以及細胞外基質降解的作用，是治療OA的潛在藥物［4-5］，但其作用機制尚不明確。miR-140-5p 為調節軟骨穩態的特異性miRNA，其表達失調與OA 嚴重程度有關［6］。研究顯示，miR-140-5p 水平在OA和IL-1β 誘導的軟骨細胞損傷中表達下調，其過表達可抑制IL-1β誘導的軟骨細胞炎癥反應和細胞凋亡［7］。新近研究發現，梓醇可通過上調miR-140-5p表達抑制肝癌細胞增殖并促進其凋亡［8］。本研究旨在探討梓醇對OA 的改善作用與miR-140-5p 的關系。

1 材料與方法

1.1 主要材料

選取2019 年7 月—2020 年7 月于荊州市第一人民醫院接受治療的20例膝關節炎患者為研究對象，所有患者均行膝關節置換術，術中切除軟骨組織。其中男12例，女8例，年齡43～56歲，平均（48.63±3.26）歲。梓醇購自成都瑞芬思生物科技有限公司（純度90%）；IL-1β 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自美國Sigma公司；IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、γ 干擾素（IFN-γ）ELISA 試劑盒購自英國Abcam 公司；RNA提取試劑盒、miRNA 提取試劑盒、SYBR Green 試劑盒、反轉錄試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；DMEM 培養基、胰蛋白酶、胎牛血清、凋亡試劑盒購自碧云天生物；Lipofectamine2000 購自美國Invitrogen；miR-NC、miR-140-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-140-5p 購自廣州銳博生物科技有限公司；兔抗人活化的胱天蛋白酶3（Cleavedcaspase 3）、活化的胱天蛋白酶9（Cleaved-caspase 9）抗體購自武漢艾美捷公司；內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體與辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔IgG 二抗購自美國Santa Cruz 公司。MIR-162-PC/MIR-262-PC 型培養箱購自日本松下公司；BD FACSCanto Ⅱ型流式細胞儀購自美國BD 公司；ABI StepOnePlus 熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems 公司；MODEL550型酶標儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 研究方法

1.2.1 人膝關節軟骨細胞分離和培養

取出軟骨組織標本后剪碎，加入胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶后置于培養箱內消化細胞，接種于含10%胎牛血清的DMEM培養基，取第3代細胞進行后續實驗［9］。

1.2.2 CCK-8法檢測梓醇的細胞毒性

將軟骨細胞以2 000個/孔接種于96孔板中。在37 ℃和5%CO2條件下孵育24 h后，用不同濃度的梓醇（0、0.1、1、10、20、50和100 ng/L）處理細胞24 h。每孔加入10 μL的CCK-8溶液。在37 ℃下孵育2 h，使用酶標儀測量各孔在450 nm波長處的吸光度（A450），計算細胞活力（%）=（經藥物處理的細胞A450/對照細胞A450）×100%。

1.2.3 分組及處理

軟骨細胞接種于6 孔板，加入含有10 μg/L IL-1β 的DMEM培養基培養48 h［10］，記為IL-1β組，不含IL-1β的正常完全培養基培養的軟骨細胞為對照（Con）組。分別加入含有不同濃度（10、20及50 ng/L）的梓醇［4］與IL-1β（10μg/L）培養24 h，分別記為IL-1β+梓醇-低組、IL-1β+梓醇-中組、IL-1β+梓醇-高組。采用脂質體轉染法將miR-NC、miR-140-5p mimics分別轉染至軟骨細胞，轉染成功后加入IL-1β（10μg/L）培養24 h，分別記為IL-1β+miR-NC 組、IL-1β+miR-140-5p組。采用脂質體轉染法將anti-miR-NC、anti-miR-140-5p分別轉染至軟骨細胞，轉染成功后加入梓醇（50 ng/L）、IL-1β（10μg/L）培養24 h，分別記為IL-1β+梓醇+anti-miR-NC 組、IL-1β+梓醇+anti-miR-140-5p組。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞活力

將各組軟骨細胞接種到96孔板（2 000個/孔）中，按1.2.3進行分組與處理。培養24 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液。酶標儀檢測每個孔中的A450值。

1.2.5 ELISA檢測IL-6、TNF-α、IFN-γ水平

收集各組軟骨細胞培養液，4 ℃下12 000×g離心10 min后吸取上清液，參照試劑盒說明書，檢測各組IL-6、TNF-α、IFN-γ水平。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡

各組軟骨細胞胰蛋白酶消化后，重懸于500μL結合緩沖液中。隨后，加入5μL Annexin-V-FITC 和5μL PI 染色液，混合后避光孵育30 min。使用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.7 實時熒光定量（qPCR）檢測miR-140-5p表達水平

用RNA 提取試劑盒提取各組軟骨細胞總RNA，反轉錄合成cDNA，在熒光定量PCR儀上進行擴增。miR-140-5p引物：上游5'-CGCATGGCAGTGGTTTTACCCTA-3'，下游5'-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3'；U6引物：上游5'-CTCGCT TCGGCAGCACATATACT-3'，下游5'-ACGCTTCACGAATTT GCGTGTC-3'。反應體系（20μL）：SYBR mix 9.0μL、上下游引物各0.5μL、cDNA 模板2.0μL、RNase dH2O 8.0μL。反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，共40個循環；72 ℃延伸1 min。以U6為內參，2-ΔΔCt法計算miR-140-5p的相對表達量。

1.2.8 Western blot 法檢測Cleaved-caspase 3、Cleavedcaspase 9蛋白相對表達水平

提取各組軟骨細胞總蛋白，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質（30μg）并轉移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜封閉2 h，與一抗Cleaved-caspase 3（1∶1 000）、Cleavedcaspase 9（1∶1 000）、GAPDH 抗體（1∶2 000）在4 ℃孵育24 h，加二抗（1∶3 000）室溫孵育1 h，用增強的化學發光試劑顯影，Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 梓醇對軟骨細胞的細胞毒性作用

0、0.1、1、10、20、50 和100 ng/L 梓醇處理后，軟骨細胞活性（%）分別為100.12±13.46、99.47±12.58、 98.56±13.11、 96.70±12.65、 95.82±12.39、96.35±12.42、93.47±12.51，差異無統計學意義（n=9，F=0.299，P＞0.05），梓醇濃度在0～100 ng/L 之間對軟骨細胞沒有細胞毒性作用。

2.2 梓醇對IL-1β誘導軟骨細胞的影響

2.2.1 細胞活力和炎癥反應

與Con組比較，IL-1β組細胞活力降低，而IL-6、TNF-α、IFN-γ 水平升高（P＜0.05）；與IL-1β 組比較，IL-1β+梓醇-低組、IL-1β+梓醇-中組、IL-1β+梓醇-高組細胞活力升高，而IL-6、TNF-α、IFN-γ水平依次降低（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of chondrocyte viability and expression levels of inflammatory cytokines between the five groups表1 各組軟骨細胞活力和炎性因子表達水平比較（n=9，±s）

Tab.1 Comparison of chondrocyte viability and expression levels of inflammatory cytokines between the five groups表1 各組軟骨細胞活力和炎性因子表達水平比較（n=9，±s）

＊＊P＜0.01；a與Con組比較，b與IL-1β組比較，c與IL-1β+梓醇-低組比較，d與IL-1β+梓醇-中組比較，P＜0.05。

組別Con組IL-1β組IL-1β+梓醇-低組IL-1β+梓醇-中組IL-1β+梓醇-高組F細胞活力/A450 0.78±0.08 0.31±0.04a 0.42±0.05ab 0.52±0.06abc 0.64±0.07abcd 80.005＊＊IL-6/（ng/L）9.97±0.93 86.55±7.18a 64.19±5.47ab 43.40±4.87abc 16.67±1.39abcd 429.566＊＊組別Con組IL-1β組IL-1β+梓醇-低組IL-1β+梓醇-中組IL-1β+梓醇-高組F TNF-α/（ng/L）5.78±0.56 74.05±7.01a 55.88±4.56ab 30.88±3.44abc 9.89±0.85bcd 471.325＊＊IFN-γ/（ng/L）31.71±3.11 163.14±11.33a 115.22±10.34ab 79.56±7.38abc 44.61±4.17abcd 408.467＊＊

2.2.2 細胞凋亡和miR-140-5p表達

與Con組比較，IL-1β組細胞凋亡率和Cleavedcaspase 3、Cleaved-caspase 9 蛋白表達水平升高，miR-140-5p表達水平降低（P＜0.05）；與IL-1β組比較，IL-1β+梓醇-低組、IL-1β+梓醇-中組、IL-1β+梓醇-高組細胞凋亡率和Cleaved-caspase 3、Cleavedcaspase 9蛋白表達水平依次降低，miR-140-5p表達水平依次升高（P＜0.05），見圖1、2，表2。

Fig.1 Apoptosis of chondrocytes in each group圖1 各組軟骨細胞凋亡水平

Fig.2 Expression levels of apoptosis-related proteins in each group圖2 各組軟骨細胞凋亡相關蛋白表達

Tab.2 Comparison of apoptosis rate,Cleaved-caspase 3,Cleaved-caspase 9 protein expression and miR-140-5p expression levels between the five groups表2 各組軟骨細胞凋亡率、Cleaved-caspase 3、Cleavedcaspase 9蛋白表達和miR-140-5p表達水平比較（n=9，±s）

Tab.2 Comparison of apoptosis rate,Cleaved-caspase 3,Cleaved-caspase 9 protein expression and miR-140-5p expression levels between the five groups表2 各組軟骨細胞凋亡率、Cleaved-caspase 3、Cleavedcaspase 9蛋白表達和miR-140-5p表達水平比較（n=9，±s）

＊＊P＜0.01；a與Con組比較，b與IL-1β組比較，c與IL-1β+梓醇-低組比較，d與IL-1β+梓醇-中組比較，P＜0.05。

組別Con組IL-1β組IL-1β+梓醇-低組IL-1β+梓醇-中組IL-1β+梓醇-高組F凋亡率/%6.31±0.52 32.63±3.16a 22.90±2.13ab 15.71±1.41abc 9.04±0.73abcd 297.530＊＊Cleaved-caspase 3 0.13±0.02 0.58±0.04a 0.45±0.04ab 0.31±0.03abc 0.19±0.02abcd 314.265＊＊組別Con組IL-1β組IL-1β+梓醇-低組IL-1β+梓醇-中組IL-1β+梓醇-高組F Cleaved-caspase 9 0.28±0.03 0.77±0.06a 0.64±0.05ab 0.51±0.04abc 0.35±0.03abcd 193.026＊＊miR-140-5p 1.00±0.00 0.26±0.03a 0.46±0.03ab 0.69±0.06abc 0.96±0.07bcd 442.922＊＊

2.3 miR-140-5p 過表達對IL-1β 誘導后軟骨細胞的影響

2.3.1 細胞活力和炎癥反應

與IL-1β+miR-NC 組比較，IL-1β+miR-140-5p組細胞活力升高，而IL-6、TNF-α、IFN-γ 水平降低（P＜0.05），見表3。

Tab.3 Comparison of cell viability and inflammatory cytokines in chondrocytes between the two groups表3 各組軟骨細胞活力A值和炎性因子表達水平比較（n=9，±s）

Tab.3 Comparison of cell viability and inflammatory cytokines in chondrocytes between the two groups表3 各組軟骨細胞活力A值和炎性因子表達水平比較（n=9，±s）

＊＊P＜0.01。

組別IL-1β+miR-NC組IL-1β+miR-140-5p組t細胞活力/A450 0.33±0.04 0.56±0.06 9.569＊＊IL-6/（ng/L）87.72±7.93 23.21±2.18 23.532＊＊組別IL-1β+miR-NC組IL-1β+miR-140-5p組t TNF-α/（ng/L）77.31±6.24 13.61±1.19 30.083＊＊IFN-γ/（ng/L）165.82±14.54 55.09±4.99 21.830＊＊

2.3.2 細胞凋亡和Cleaved-caspase 3、Cleavedcaspase 9蛋白水平以及miR-140-5p表達

與IL-1β+miR-NC 組比較，IL-1β+miR-140-5p組細胞凋亡率、Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9蛋白水平降低，miR-140-5p 表達水平升高（P＜0.01），見圖3、表4。

Fig.3 Apoptosis levels of chondrocytes in each group圖3 過表達miR-140-5p后各組軟骨細胞凋亡水平

Tab.4 Comparison of apoptosis rate,Cleaved-caspase 3,Cleaved-caspase 9 protein expression and miR-140-5p expression levels between the two groups表4 miR-140-5p過表達后各組軟骨細胞凋亡率，Cleavedcaspase 3、Cleaved-caspase 9蛋白表達和miR-140-5p表達水平比較（n=9，±s）

Tab.4 Comparison of apoptosis rate,Cleaved-caspase 3,Cleaved-caspase 9 protein expression and miR-140-5p expression levels between the two groups表4 miR-140-5p過表達后各組軟骨細胞凋亡率，Cleavedcaspase 3、Cleaved-caspase 9蛋白表達和miR-140-5p表達水平比較（n=9，±s）

＊＊P＜0.01。

組別IL-1β+miR-NC組IL-1β+miR-140-5p組t凋亡率/%31.73±2.96 12.12±1.16 18.505＊＊Cleaved-caspase 3 0.59±0.05 0.25±0.02 18.941＊＊組別IL-1β+miR-NC組IL-1β+miR-140-5p組t Cleaved-caspase 9 0.79±0.06 0.40±0.04 16.225＊＊miR-140-5p 1.00±0.12 2.88±0.24 21.019＊＊

2.4 下調miR-140-5p 表達逆轉了梓醇對IL-1β 誘導軟骨細胞損傷

2.4.1 細胞活力和炎癥反應

與IL-1β+梓醇+anti-miR-NC組比較，IL-1β+梓醇+anti-miR-140-5p 組細胞活力降低，而IL-6、TNF-α、IFN-γ水平升高（P＜0.01），見表5。

Tab.5 Comparison of cell viability and inflammatory cytokines in chondrocytes between the two groups表5 下調miR-140-5p后各組軟骨細胞活力和炎性因子表達水平比較（n=9，±s）

＊＊P＜0.01。

組別IL-1β+梓醇+anti-miR-NC組IL-1β+梓醇+anti-miR-140-5p組t細胞活力/A450 0.65±0.06 0.39±0.04 10.817＊＊IL-6/（ng/L）15.96±1.29 73.17±6.54 25.747＊＊組別IL-1β+梓醇+anti-miR-NC組IL-1β+梓醇+anti-miR-140-5p組t TNF-α/（ng/L）9.07±0.75 61.39±5.07 30.625＊＊IFN-γ/（ng/L）42.37±4.29 123.94±10.94 20.824＊＊

2.4.2 細胞凋亡、Cleaved-caspase 3、Cleavedcaspase 9蛋白水平以及miR-140-5p表達

與IL-1β+梓醇+anti-miR-NC組比較，IL-1β+梓醇+anti-miR-140-5p 組細胞凋亡率，Cleavedcaspase 3、Cleaved-caspase 9 蛋白水平升高，miR-140-5p表達水平降低（P＜0.01），見圖4、表6。

Fig.4 Apoptosis levels of chondrocytes in each group圖4 下調miR-140-5p后各組軟骨細胞凋亡水平

Tab.6 Comparison of apoptosis rate,Cleaved-caspase 3,Cleaved-caspase 9 protein expression and miR-140-5p expression levels between the two groups表6 下調miR-140-5p后各組軟骨細胞凋亡率，Cleavedcaspase 3、Cleaved-caspase 9蛋白表達和miR-140-5p表達水平比較（n=9，±s）

Tab.6 Comparison of apoptosis rate,Cleaved-caspase 3,Cleaved-caspase 9 protein expression and miR-140-5p expression levels between the two groups表6 下調miR-140-5p后各組軟骨細胞凋亡率，Cleavedcaspase 3、Cleaved-caspase 9蛋白表達和miR-140-5p表達水平比較（n=9，±s）

＊＊P＜0.01。

組別IL-1β+梓醇+anti-miR-NC組IL-1β+梓醇+anti-miR-140-5p組t凋亡率/%9.16±0.65 25.21±2.19 21.078＊＊Cleaved-caspase 3 0.17±0.02 0.49±0.05 17.827＊＊組別IL-1β+梓醇+anti-miR-NC組IL-1β+梓醇+anti-miR-140-5p組t Cleaved-caspase 9 0.33±0.03 0.66±0.04 19.800＊＊miR-140-5p 1.00±0.00 0.32±0.04 51.000＊＊

3 討論

OA 的主要治療藥物是非甾體抗炎藥，可緩解OA癥狀［11］。然而，長期使用非甾體抗炎藥可能導致胃腸道和心血管疾病［12］。因此，尋找新的潛在治療藥物對改善OA 有重要意義。軟骨細胞的過度凋亡和細胞炎癥反應是OA 的主要病理特征。基于OA的發病機制，已有研究表明部分中藥及其活性成分（如白藜蘆醇、燈盞花乙素）可用于治療OA，減輕軟骨細胞損傷［13］。梓醇是一種從地黃根中分離出來的環烯醚萜苷，有抗炎作用［4-5，14］。IL-1β 可觸發炎性細胞因子的釋放以及軟骨細胞凋亡，被廣泛應用于OA 的病理生理學研究［5，10］。本研究結果顯示，IL-1β 誘導的軟骨細胞中IL-6、TNF-α、IFN-γ 水平升高，軟骨細胞凋亡率和Cleaved-caspase 3、Cleavedcaspase 9 蛋白水平均升高，表明IL-1β 可誘導軟骨細胞凋亡。曾允富等［4］研究顯示，梓醇可抑制IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡。本研究亦顯示，梓醇可降低促炎細胞因子水平和細胞凋亡率以及Cleavedcaspase 3、Cleaved-caspase 9 蛋白表達，提示梓醇可抑制IL-1β 誘導的軟骨細胞炎性損傷和細胞凋亡，再次證實了梓醇可能是改善OA的潛在藥物。

miRNA 在骨關節炎中表達異常，并可參與OA發生、發展［15-16］。miR-140-5p 是一種在OA 中特異性表達的新型非編碼miRNA。研究顯示，miR-140-5p 在人OA 軟骨中表達降低［17］。過表達miR-140-5p對IL-1β誘導的軟骨細胞炎癥和細胞凋亡具有抑制作用［7］。本研究顯示，在IL-1β 誘導的軟骨細胞中，miR-140-5p 表達量較正常培養的軟骨細胞降低，過表達miR-140-5p 后，IL-1β 誘導的軟骨細胞凋亡和炎性損傷均減輕，表明miR-140-5p 在OA 中可能發揮保護作用。梓醇可增加IL-1β誘導的軟骨細胞中miR-140-5p 的表達量，表明梓醇可促進miR-140-5p 表達。此外，下調miR-140-5p 表達可拮抗梓醇對IL-1β誘導的軟骨細胞炎癥及細胞凋亡的抑制作用，提示梓醇可能通過上調miR-140-5p減緩IL-1β誘導的軟骨細胞炎癥反應及凋亡。

綜上所述，梓醇可通過上調miR-140-5p表達來減輕IL-1β誘導的軟骨細胞炎性因子的釋放以及凋亡，且miR-140-5p 可能是梓醇改善OA 的潛在靶點。在未來的研究中將對miR-140-5p 的下游靶標進行分析，并結合體內實驗進一步驗證梓醇對OA發揮保護作用的分子機制。