SASH1基因雜合變異c.1574C＞G（p.T525R）可促進黑色素合成增加

陳紅宇，張景，曾珍，楊娉娉，熊宇，張淼，周定安△

遺傳性泛發性色素異常癥（dyschromatosis universalis hereditaria，DUH）是一種罕見的遺傳性皮膚病，此病由Ichikawa和Higara于1933年首次報道，主要表現為常染色體顯性遺傳，少數病例存在常染色體隱性遺傳，該病典型臨床表現為全身泛發無癥狀的色素沉著斑和色素減退斑［1］。在線人類孟德爾遺傳（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）數據庫根據DUH 的連鎖定位區域和致病基因不同分為DUH1（OMIM 127500）、DUH2（OMIM 612715）和DUH3（OMIM 615402）3 種類型。目前發現，在人類染色體6q24.2～6q25.2 區域的SASH1基因變異和染色體2q33.3～q36.1區域的ATP結合盒轉運蛋白家族亞家族B 成員6（ABCB6）基因變異與DUH 發生相關。本研究擬探討引起DUH 臨床表型出現的SASH1基因變異是否影響黑色素合成。

1 對象與方法

1.1 研究對象

先證者，女，32歲，出生于中國湖北省，出生時皮膚正常，嬰幼兒時期面部出現皮膚病變，青春期早期，患者頸部、肘部、膝關節和指骨關節開始出現色素沉著斑。成年后，面部、腹部、背部、手臂、大腿、小腿和臀部開始逐漸出現不規則形狀、大小不一的色素沉著和色素減退斑，見圖1。手掌、足底、口腔黏膜、頭發、指甲和牙齒均正常。該患者經貴州醫科大學附屬醫院和成都醫學院2 名皮膚科專家確診為DUH。本研究所涉及的患者一切資料均經貴州醫科大學附屬醫院倫理委員會倫理審查（倫理號：2020073K），所有涉及研究對象均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

小鼠黑色素瘤細胞B16、人皮膚黑色素瘤細胞SK-MEL-1、正常人皮膚黑色素細胞PIG1。SK-MEL-1 細胞的專用培養基購自于武漢普羅賽爾生命科技有限公司；Nano drop超微量分光光度計購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；ABI 3730xl 測序儀購自美國應用生物系統公司；DNA 提取試劑盒，凝膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；SASH1基因（NM_015278.5）的cDNA 序列由美國OriGene Technologies 公司合成；野生型pEGFP-C3 質粒購自美國Addgene公司；KOD-Plus定點突變試劑盒購自東洋紡（上海）生物科技有限公司；過表達野生型SASH1基因腺病毒（HAWT-SASH1-ADV）和過表達突變型SASH1基因腺病毒（HAT525R-SASH1-ADV）、聚凝胺由漢恒生物科技（上海）有限公司合成和提供；RPMI 1640 培養基、Dulbecco 改良Eagle 培養基、青霉素、鏈霉素和胰酶購自美國Invitrogen公司；胎牛血清購自維森特生物技術（南京）有限公司；RIPA 蛋白裂解液、Lipo8000?轉染試劑、SignalUp?Western一抗稀釋液、4%多聚甲醛固定液、免疫染色通透液（Triton X-100）、山羊血清購自上海碧云天生物技術有限公司；PVDF膜購自美國Promega公司；鼠抗人綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）、血凝素（hemagglutinin，HA）、微管蛋白（β-tubulin）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）鼠抗人一抗購自艾比瑪特醫藥科技（上海）有限公司；MITF一抗、Tyrosinase一抗購自英國Abcam公司；山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor?594）、DAPI 和HRP 偶聯的羊抗兔/鼠二抗購自英國Abcam 公司；兔抗人SASH1多克隆抗體購自美國Novus 公司；細胞黑色素含量比色法定量檢測試劑盒購自上海杰美基因醫藥科技有限公司；限制性內切酶EcoRⅠ和BamHⅠ、T4 DNA連接酶購自美國NEB公司；大腸埃希菌Top 10 感受態細胞購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA提取

采集先證者及其父母外周抗凝全血，使用DNA提取試劑盒提取3人DNA。Nano drop 超微量分光光度計測定DNA 樣本濃度，DNA樣本-20 ℃保存。

1.3.2 全外顯子組測序及Sanger測序驗證

將提取的3 人DNA 樣本委托北京智因東方轉化醫學研究中心有限公司進行全外顯子組測序。外顯子組測序檢出的SASH1c.1574C＞G（p.T525R）突變位點，應用Premier 5.0軟件設計該變異位點PCR引物：上游5'-AGCGGTCAAAGAGTG AGCAC-3' ，下游5'-CATGGAGCTCTGCCCACT-3' 。 ABI 3730xl測序儀進行Sanger測序，SeqMan軟件對測序結果與標準序列進行比對。

1.3.3 生物信息學分析

應用PolyPhen-2（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/index.shtml）軟件預測SASH1-T525R 氨基酸替換對蛋白質結構和功能的影響。軟件基于HumDiv 和HumVar 兩個數據集的結果，給出一個分值，該分值范圍為0～1，越接近1，說明氨基酸突變后對蛋白質結構和功能造成影響的概率越大。MEGA7軟件對變異位點進行不同物種之間保守位點分析。

1.3.4 基因克隆、定點突變和病毒包裝

Premier 5.0 軟件設計SASH1基因全長引物，序列：上游5'-CCGGAATTCCGGATGGAGGACGCGGGAGCAGCTGGCCC GGGGCCGGAGC-3'，下游5'-CGGGATCCCGCTACATGGCCT CAGGGCCTGGCGGCAGTTT-3'。以SASH1基因cDNA 為模板，利用全長引物和DNA 聚合酶進行PCR。PCR 擴增條件：95 ℃2 min；95 ℃30 s，65 ℃30 s，72 ℃1 min，共30 個循環；72 ℃5 min；4 ℃恒溫。EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切pEGFP-C3質粒和SASH1全長基因，酶切產物經連接、轉化后獲得pEGFP-SASH1-C3 重組質粒。挑取單個菌落于96 孔板中培養2 h，菌液PCR篩選陽性克隆。抽提陽性菌液質粒，用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定，并送測序驗證插入序列的正確性。將已驗證正確性的pEGFP-SASH1-C3質粒使用KOD-Plus誘變試劑盒將SASH1基因第1574位核苷酸C定點突變為G，構建pGFP-T525R-SASH1-C3 質粒，測序以驗證該質粒的正確性。委托漢恒生物上海有限公司將野生型SASH1和突變型SASH1序列克隆到adeasy014-pAdEasy-EF1-MCS-CMVEGFP腺病毒載體中。

1.3.5 激光共聚焦顯微鏡明確SASH1在PIG1細胞的定位

將PIG1細胞以30%密度平鋪在6孔板中，細胞培養24 h取出6 孔板，依次進行4%多聚甲醛室溫固定30 min，0.2%Triton X-100冰上通透5 min，5%山羊血清封閉1 h，加兔一抗SASH1（1∶100）4 ℃過夜，次日用山羊抗兔IgG H&L 二抗避光1 h，漂洗后加DAPI 進行細胞核染色1 h，避光封片。染色后的片子用激光共聚焦顯微鏡掃描（蔡司LSM710），明確SASH1在PIG1 細胞的定位情況。其中對照組一抗用PBS 處理PIG1細胞，陽性組用SASH1單克隆抗體處理PIG1細胞。

1.3.6 細胞培養、轉染、感染

B16 細胞培養在含有100 U/mL 青霉素和100 mg/L 鏈霉素、10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中；SK-MEL-1細胞培養在SK-MEL-1專用培養基中；PIG1細胞培養在含10%胎牛血清的Dulbecco 改良Eagle 培養基中。所有細胞均在37 ℃、5%CO2培養箱中培養，每24 h 更換1 次培養基。將pEGFPSASH1-C3 和pGFP-T525R-SASH1-C3 質粒按照Lipo8000?轉染試劑說明書轉染B16 細胞48～72 h，不做任何處理的B16 細胞作為空白對照。利用聚凝胺將對照組、HA-WTSASH1組、HA-T525R-SASH1組腺病毒感染B16 細胞、SKMEL-1 細胞，按照制造商提供的程序進行，用免疫熒光顯微鏡觀察感染效果。

1.3.7 Western blot 檢測黑色素瘤細胞中SASH1、MITF、Tyrosinase蛋白表達

收集各組細胞，提取蛋白，4 ℃離心收集蛋白。每孔上樣蛋白量為25μg，經12%SDS-PAGE，電泳后轉至PVDF 膜，脫脂奶粉封閉。加一抗MITF（1∶400）、GFP（1∶400）、Tyrosinase（1∶500）、HA（1∶800）、GAPDH（1∶1 000）、β-tubulin（1∶1 000），4 ℃冰箱孵育過夜，次日二抗室溫搖床孵育2 h后，采用化學發光儀進行顯影。

1.3.8 體外黑色素定量T525R-SASH1是否影響黑色素合成

按照細胞黑色素含量比色法定量檢測試劑盒的操作步驟將HA-WT-SASH1-ADV 和HA-T525R-SASH1-ADV 的B16 細胞和SK-MEL-1 細胞中的黑色素提取出來，通過光譜儀在405 nm 波長處測量吸光度（A），換算出黑色素含量，每組重復3次實驗。

1.4 統計學方法

實驗數據采用SPSS 16.0 軟件進行數據分析，GraphPad Prism 5 進行繪圖，計量數據采用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 全外顯子組測序結果

先證者存在SASH1c.1574C＞G（p.Thr525Arg）的雜合變異位點，該變異位點位于人6號染色148 853 942 位置，美國醫學遺傳學與基因組學學會致病等級為致病性變異，千人基因組數據庫、MAF 數據庫目前未收錄該變異位點；先證者父母該變異位點為野生型。測序結果提示先證者存在的該變異并非來自父母，而是新生突變，SASH1基因變異與先證者表型存在相關性。先證者SASH1基因染色體位于chr6:1488 53942，核酸改變c.1574（exon 14）C＞G，氨基酸改變p.Thr525Arg（NM_015278），ACMG 致病等級為致病（PS2+PM1+PM2+PM），次要等位基因頻率、單核苷酸多態性數據庫、千人基因組和外顯子組整合數據庫均未收錄。先證者父母該SASH1基因位點為野生型c.1574（exon 14）C。

2.2 Sanger測序驗證

先證者存在SASH1基因c.1574C＞G 雜合變異位點，其父親和母親未攜帶該雜合變異位點，見圖2。

Fig.2 Sanger sequencing of SASH1 c.1574C＞G of the proband and his parents圖2 先證者及其父母SASH1 c.1574C＞G變異位點的Sanger測序

2.3 預測T525R-SASH1 變異位點有害性和保守性

PolyPhen-2 軟件預測，當SASH1基因第525 位蘇氨酸（Thr）突變為精氨酸（Arg）時，Hum Div、Hum Var 數據集預測該突變對蛋白質結構可能有害（Probably damaging），預測分值分別為1 和0.99，預測結果提示該變異對蛋白質結構和功能造成影響的概率較大，見圖3。MEGA7 軟件對SASH1基因525位Thr 進行保守位點分析，結果顯示Thr525 在不同物種間高度保守，見圖4。

Fig. 3 PolyPhen-2 predicted the effect of T525R-SASH1 mutation on the structure and function of the protein圖3 PolyPhen-2預測T525R-SASH1變異位點對該蛋白結構和功能的影響

Fig. 4 MEGA7 predicted that the conserved nature of Thr525 locus in different species圖4 MEGA7預測Thr525位點在不同物種之間的保守性

2.4 激光共聚焦顯微鏡明確SASH1 在PIG1 細胞的定位

通過細胞免疫熒光染色發現，正常人皮膚黑色素細胞PIG1表達SASH1蛋白，激光共聚焦顯微鏡觀察到SASH1定位于PIG1細胞質中，見圖5。

Fig.5 Confocal microscopy showed the localization of SASH1 in PIG1 cells(Immunofluorescence staining×200)圖5 共聚焦顯微鏡顯示SASH1在PIG1細胞中的定位（免疫熒光染色×200）

2.5 T525R-SASH1上調B16細胞MITF和Tyrosinase表達

與空白組相比，過表達GFP-WT-SASH1和GFP-T525R-SASH1的 B16 細 胞 中 MITF 和Tyrosinase 的蛋白表達量增加（P＜0.05），與過表達GFP-WT-SASH1的B16 細胞相比，過表達GFPT525R-SASH1細胞中MITF和Tyrosinase表達量增加（P＜0.05），見圖6、表1。

Tab. 1 Comparison of expression levels of MITF and Tyrosinase proteins between the three groups表1 3組MITF、Tyrosinase蛋白表達水平比較（n=3，±s）

Tab. 1 Comparison of expression levels of MITF and Tyrosinase proteins between the three groups表1 3組MITF、Tyrosinase蛋白表達水平比較（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與空白對照組比較，b與WT-SASH1組比較，P＜0.05。

組別空白對照組WT-SASH1組T525R-SASH1組F MITF 0.97±0.02 1.22±0.08a 1.76±0.04ab 107.884＊＊Tyrosinase 0.16±0.02 0.48±0.03a 1.12±0.1ab 179.575＊＊

Fig.6 T525R-SASH1 overexpression increased MITF and Tyrosinase expression in B16 cells圖6 T525R-SASH1上調B16細胞MITF和Tyrosinase蛋白表達

2.6 T525R-SASH1促進黑色素瘤細胞產生黑色素

Western blot 驗證對照腺病毒組（NC ADV）、野生型SASH1腺病毒組（HA-WT-SASH1-ADV）、突變型T525R-SASH1腺病毒組（HA-MT-SASH1-ADV）成功過表達于B16 細胞（圖7A）和SK-MEL-1 細胞（圖7B）。提取成功過表達腺病毒的各組細胞的黑色素，與對照腺病毒組相比，過表達野生型SASH1腺病毒組和突變型SASH1腺病毒組的B16細胞產生的黑色素增加（P＜0.05）；過表達突變型SASH1腺病毒組的B16 細胞相比較野生型SASH1腺病毒組的B16細胞中產生的黑色素更多（P＜0.05，圖7C）。重復實驗在SK-MEL-1細胞中得到一致的結果（圖7D）。

Fig.7 T525R-SASH1 over expression increased melanin synthesis in melanoma cells圖7 過表達T525R-SASH1促進黑色素瘤細胞產生黑色素

3 討論

3.1 SASH1 基因變異在DUH 發生中扮演著重要的角色

SASH1基因是2003 年德國學者Zeller 等［2］研究人類染色體6q23～25 的雜合性缺失時發現的，該基因位于染色體6q24.3，包含22個外顯子和21個內含子，共279 746個堿基對，編碼了1 230個氨基酸的蛋白，包含1 個SLY 結構域、1 個SH3 結構域和2 個SAM結構域。2003年Xing等［3］對2個漢族常染色體顯性DUH 家系進行全基因組連鎖定位，結果2 個家系的致病基因定位于染色體6q24.2～q25.2 區域，但未找到致病基因。2013年Zhou等［4］在研究2個中國的和1個美國的DUH家系時，首次在染色體6q24.2～6q25.2 區域發現SASH1基因SLY 結構域的3 個錯義突變c. 2126T＞G（p. Tyr551Asp），c. 2019T＞C（p.Leu515Pro），c.2000G＞A（p.Glu509Lys）與DUH 的表型發生相關。并先后證實這3個雜合性變異能夠通過調節Gαs-SASH1-IQGAP1-E-cadherin［4］、p53-POMC-SASH1［5］和SASH1-MAP2K2-CREB-ERK［6］信號通路來調節患者皮膚色素過度沉著表型的發生。SASH1 的變異位點c.1553A ＞C p.Gln518Pro［7］、c. 1651T ＞ C p. Tyr551His［8］、c. 1529G ＞ A p.Ser510Asn［9］、c.1553A ＞C p.Gln518Pro［10］、c.1547G ＞A p.Ser516Asn［11］等被報道與DUH 發生相關，迄今為止文獻共報道了12 個SASH1基因變異與DUH 發病相關。

3.2 SASH1 c.1574C＞G（p.T525R）變異導致DUH 臨床表型發生

全外顯子組測序和Sanger測序檢測發現先證者父母該變異位點均為野生型，先證者攜帶SASH1基因c.1574C＞G（p.T525R）雜合變異是一個新發的變異位點。既往日本報道1例患者攜帶與本研究先證者相同的SASH1基因c.1574C＞G（p.T525R）變異位點，但確診為泛發性雀斑樣痣［12］，與本例患者的臨床診斷和臨床表現有較大差異，可見同一基因的同一變異位點可能會引起兩種不同的疾病出現。

3.3 SASH1 c.1574C＞G（p.T525R）雜合變異可促進黑色素合成增加

研究發現，以往報道與DUH相關的12個SASH1基因的變異位點中，有9 個變異位點均位于SASH1基因的SLY 結構域，該結構域高度保守，被視為DUH 的熱點突變區域。本研究所報道SASH1c.1574C＞G（p.T525R）變異位點正是位于高度保守的SLY結構域。PolyPhen-2軟件預測SASH1基因第525位蘇氨基酸突變為精氨酸后對蛋白質結構和功能造成影響的概率極高，野生型SASH1基因第525位蘇氨酸在不同物種之間的保守性也高，所以推測SASH1c.1574C＞G（p.T525R）變異可能導致了SLY結構域發生改變，從而影響SASH1蛋白的正常功能。本研究進一步通過體外功能驗證該變異位點的致病性。黑色素合成的過程極其復雜，主要涉及酪氨酸酶基因家族中的3 種酶，即酪氨酸酶（Tyrosinase，TYR）、酪氨酸酶相關蛋白（Tyrosinase-related protein，TRP）1、TRP-2，其中TYR是黑色素合成的過程中的關鍵酶［13］。MITF 是一種堿性螺旋-環-螺旋亮氨酸拉鏈轉錄因子，可以同啟動子區域的M-box基序結合之后調節TYR、TRP-1、TRP-2 的表達，從而調控黑色素合成［14］。人的皮膚顏色依賴于黑色素的合成，黑色素過量累積會導致色素沉著［15］。本研究利用B16 和SK-MEL-1 細胞構建過表達T525RSASH1的細胞系，發現T525R-SASH1可以上調在黑色素合成過程中最關鍵的TYR 以及MITF 的蛋白表達量，并且T525R-SASH1可以促進黑色素瘤細胞合成黑色素增加，體外功能實驗結果推測T525RSASH1變異可能是先證者出現色素沉著斑的原因。

綜上所述，本研究為SASH1基因變異相關聯的DUH 患者出現色素沉著斑的臨床表型提供了理論參考，并且豐富了與DUH相關的SASH1基因突變位點。體外功能實驗進一步說明SASH1基因變異與黑色素合成有關，為DUH的基因診斷和治療提供了有益信息。但SASH1c.1574C＞G（p.T525R）變異位點如何調控黑色素生成的具體機制尚未闡述，因此課題組下一步將會擴大該患者家系，從信號通路和基因調控等方面進一步研究SASH1基因變異對黑色素生成的調節機制。