定向敲除SD1基因提高水稻的抗倒性和稻瘟病抗性

李剛 高清松 李偉 張雯霞 王健 程保山 王迪 高浩 徐衛軍 陳紅旗 紀劍輝, *

定向敲除基因提高水稻的抗倒性和稻瘟病抗性

李剛1, #高清松2, #李偉2張雯霞2王健1程保山1王迪1高浩1徐衛軍1陳紅旗3, *紀劍輝2, *

(1江蘇徐淮地區淮陰農業科學研究所/淮安市農業生物技術重點實驗室，江蘇 淮安 223301;2淮陰師范學院/江蘇省環洪澤湖生態農業與生物技術重點實驗室, 江蘇 淮安 223300;3中國水稻研究所水稻生物育種全國重點實驗室, 杭州 311401;*通信聯系人, email: chqhzfy@126.com, jijianhui@hytc.edu.cn)

【目的】為改良高產粳稻品種淮119株高偏高及易感稻瘟病等不利性狀，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術對淮119中基因進行定向敲除，為淮119后代品種改良奠定基礎。【方法】利用CRISPR/Cas9系統，以基因為靶基因，構建基因敲除載體，以農桿菌介導轉化淮119，獲得無轉基因插入的純合突變株，進一步對純合突變株株高、農藝性狀、稻瘟病抗性及氮素吸收利用能力等進行綜合分析。【結果】利用農桿菌轉化淮119，鑒定獲得1株無轉基因載體序列插入的純合突變株。大田種植發現，野生型淮119出現60%面積以上的倒伏，而純合突變株群體由于株高變矮，從而有效避免了生育后期的倒伏。此外，用不同濃度的GA（0.01～1.00 μmol/L）處理，野生型苗高均顯著高于突變株，表明突變導致對外源GA敏感性降低。稻瘟病抗性鑒定結果表明，基因突變不僅有效降低株高，同時增強了對稻瘟病的抗性水平。不利因素是，基因的敲除降低了淮119的氮素吸收利用效率。【結論】淮119中基因定向敲除獲得的無轉基因插入純合突變株，不僅株高顯著下降，且稻瘟病抗性得到增強。

CRISPR/Cas9；基因編輯；；稻瘟病；抗倒性；水稻

發展現代農業，提高作物的產量和品質，離不開優良作物品種的鑒定和選育[1]。相比傳統雜交的長周期和誘變育種的隨機性，基因組定向編輯技術對特定靶基因進行精確修飾，在作物基因功能研究和品種改良過程中具有廣闊的應用潛力。CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9) 基因組編輯技術，具有操作簡便、成本低、效率高等優點。該技術只需表達Cas9核酸酶和一個經過設計的單導向RNA(sgRNA)，就可以完成對基因組特定位點的切割，其序列特異性通過改變sgRNA中20個核苷酸的引導序列而實現[2-5]。隨后，切割造成的DNA雙鏈斷裂可通過非同源末端連接和同源重組兩種方式進行修復。目前，該技術已在各種植物的基因編輯中廣泛應用，并為作物育種帶來了一場技術革命[6-8]。

水稻“綠色革命”基因()編碼赤霉素(GA)合成途徑的關鍵酶GA20氧化酶，參與GA合成的最后步驟[9, 10]。該基因的突變降低了水稻GA水平，導致株高適度下降而防止倒伏，顯著增加了水稻產量[10-12]。在基因的利用方面，李錚友先生曾歷時5年將-383突變回交至云南品種毫木西和毫秕等軟米中，育成滇屯及滇瑞優質軟米品種[13]。近年來，研究人員利用CRISPR/Cas9技術對優良水稻品種中的基因進行定向編輯，創制出多個新的等位基因，大大豐富了該座位的遺傳多樣性[14-16]。等[14]采用相同的靶點，對3個優良水稻品種中的基因進行編輯，獲得了株高顯著下降但產量增加的育種材料。Hu等[15]對Kasalath和特特普中的基因進行編輯，發現突變株株高顯著下降，且其稻瘟病抗性提高。胡雪嬌等[16]在基因第1外顯子設計靶點，對恢復系申繁17和申繁24進行編輯，發現突變株株高下降了25%，且其他農藝性狀無顯著變化。

學者們研究發現，GA與水稻稻瘟病抗性密切相關。黎起秦等[17]發現赤霉素對水稻抗瘟性的影響與表皮結構和生理生化特性有關。稻株在噴灑赤霉素后，由于稻稈節間伸長，且表皮硅化細胞數目減少，角質層和表皮層的厚度變薄，使稻瘟病菌易于入侵。赤霉素20-氧化酶（GA20ox）在GA生物合成途徑中，催化后期的一系列氧化反應。水稻中有4個相關基因對進行干擾后獲得的株系，表現為對稻瘟病菌和白黃單胞桿菌（葉枯病）抗性增強，且防御相關基因的表達上調，而-過表達株系對這些病原體更敏感[18]。水稻基因編碼1個GA信號受體，在的突變體中，赤霉素合成酶基因表達下調，而植物抗毒素合成酶基因和的表達卻上調，提示與水稻耐受冷脅迫和抗稻瘟病有關[19]。基因編碼細胞色素P450單加氧酶。基因的突變降低了水稻對白葉枯病和稻瘟病的抗性，而基因的過表達則增強抗病性，表明GA對水稻的抗病性起負調控作用[20]。胡興明等[15]在特特普中敲除基因后獲得的半矮稈株系稻瘟病廣譜抗性不僅沒減弱，反而有一定程度增強。目前為止，赤霉素與稻瘟病抗性相關的分子機制還需要進一步深入研究。

淮119是由江蘇徐淮地區淮陰農業科學研究所育成的高產型粳稻品種，因其具有產量高、米質好、種植區域廣等優點，在江蘇蘇中稻區受到廣大種植戶的歡迎。但淮119株高偏高(平均達到109 cm)，導致在高產栽培時容易倒伏，且易感稻瘟病，影響了該品種在生產上大面積推廣應用。本研究對淮119中基因進行定向基因編輯，并對純合突變株株高、農藝性狀、稻瘟病抗性和氮素吸收利用能力等進行系統分析，旨在為后期育種材料的培育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 靶點設計、基因敲除載體構建和水稻遺傳轉化

利用CRISPR-P 2.0網站的在線分析功能(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)，在基因第一外顯子區域設計基因敲除靶標位點[21]。合成基于CRISPR/Cas9系統的靶序列引物SD1-P1和SD1-P2(表1)，退火后連入BGK032雙元載體，得到靶向靶標位點的重組表達載體。經生工生物工程(上海)股份有限公司測序驗證正確后，利用農桿菌介導法轉化水稻淮119，獲得轉基因再生植株。

1.2 靶位點突變的檢測

采用CTAB法提取轉基因植株DNA，利用基因組引物(SD1-F/R)進行PCR擴增覆蓋靶標位點的DNA片段，擴增后測序。利用在線基因編輯分析程序(http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/)[22]對轉基因植株后代進行鑒定，獲得純合突變株。引物序列見表1。

1.3 轉基因的分離

利用、和等3個基因的引物對T1純合轉基因植株的DNA進行擴增，以基因作為參照，獲得無轉基因插入的純合突變株。引物序列見表1。

1.4 外源GA處理

水稻種子萌發后挑選生長一致的幼苗，接種于水培盒中，分別加入0、0.01、0.1、1、10、100 μmol/ L GA溶液，于14 h光照/10 h黑暗光周期、30℃/25℃溫度周期光照培養箱中生長，分別在第7天和第10天測量幼苗苗高。

1.5 稻瘟病自然誘發和人工接種鑒定

稻瘟病自然誘發鑒定點位于江蘇省連云港市贛榆區塔山鎮，為稻瘟病重發區。供試材料于5月中旬播種，6月中旬移栽，每份材料種植6行36株，設置3次重復。于10月中旬依據農業農村部發布的行業標準NY/T 2646–2014《水稻品種試驗稻瘟病抗性鑒定與評價技術規程》進行病情調查和病級評價[23]。稻瘟病鑒定綜合指數采用以下公式計算：

綜合指數=葉瘟病級×25%+穗瘟發病率病級×25%+穗瘟損失指數病級×50%。

人工接種鑒定菌液引自江蘇省農業科學院植保所植物病理學實驗室。2021年正季從江蘇省各稻區采集和分離稻瘟菌株，并經過24個近等單基因系鑒定，選用其中5個具有代表性的菌株作為鑒定用菌株。在產孢培養基上25℃下黑暗培養7 d、黑光燈照射72 h，刮取5個菌株的孢子等比例混合，配制成終濃度為1×105個/mL的孢子懸浮液[24]。待水稻生長至劍葉葉枕距為2～3 cm時，用注射器將1 mL懸浮液注射進穗苞，待成熟期觀察發病病癥。

1.6 氮素吸收利用率鑒定

1.6.1 種子萌發期氯酸鉀溶液處理

將露白的野生型和突變體種子放置于鋪有濾紙的培養皿中，加入0.02%的氯酸鉀溶液，于14 h光照/10 h黑暗光周期、30℃/25℃溫度周期下萌發，溶液每兩天更換1次，7 d后測量幼苗的苗高，以蒸餾水處理的種子為對照。

1.6.2 幼苗期氯酸鉀溶液處理

將野生型和突變體幼苗在木村B營養液中生長10 d，加入0.5 mmol/L的氯酸鉀溶液，每兩天更換營養液，以木村B營養液培養的幼苗為對照。培養7 d后拍照觀察，并參照Arnon法測定幼苗葉片的總葉綠素和類胡蘿卜素含量[25]。

1.7 田間試驗與統計分析

在2021年夏季的田間試驗中，對無轉基因插入的T3代突變體與野生型淮119進行小區測產和表型分析，每個小區10 m2，設置3個小區重復。

利用Excel 2016進行統計分析，采用t檢驗檢測野生型與突變體間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 淮119中SD1基因敲除純合突變株的獲得

基因()含有3個外顯子，編碼區包含1170個核苷酸，編碼1個由389個氨基酸組成的蛋白質。已有研究表明，的自發突變主要發生在第1和第2外顯子區域[10]。我們在基因的第1外顯子區設計了1個特異靶標位點進行CRISPR/Cas9基因敲除(圖1-A)。該靶標位點在水稻基因組中共含有12個潛在的脫靶位點，除脫靶位點7含有3個錯配以外，其余脫靶位點均含有4個錯配(圖1-B)。合成基于靶標序列的引物，退火后插入BGK032雙元載體。該載體的T-DNA區段結構如圖1-C所示。測序驗證正確后，利用農桿菌介導法轉化淮119，共獲得5株轉基因T0植株。

利用一對覆蓋靶標位點的引物對轉基因植株進行PCR擴增和序列測定，發現5株轉基因植株中有1株帶有雜合突變，其余4株均無突變。通過利用、sgRNA和三個基因的引物擴增，結合靶位點的測序鑒定，在雜合突變體的后代中獲得了1株無轉基因插入的純合突變株。該突變株在第1外顯子帶有4 bp的缺失，從而導致后續氨基酸編碼序列移碼，我們將其命名為(圖1-D)。

表1 本研究中使用的引物序列

2.2 淮119中SD1基因突變導致株高顯著下降

田間試驗測產和表型分析發現，突變體平均株高為77.0 cm，相比淮119顯著下降了29.1%(圖2-A、圖3-A)；突變體每株穗數(圖2-B)和每穗粒數(圖2-C)與對照無顯著差異。測產發現突變株群體小區產量與淮119相當，無顯著差異(表2)。突變株無倒伏發生(圖3-C)，而淮119出現了大面積倒伏，倒伏比例為60%～90%(表2、圖3-B)。

***P<0.001.

表2 野生型淮119及sd1突變體群體產量及其倒伏比例

圖3 淮119中sd1突變株表型及抗倒伏性分析

為研究突變體對外源GA的應答，我們在水培條件下，對野生型和突變體進行了不同濃度的GA處理，7 d和10 d后測量苗高。結果發現(圖4-A)，處理7 d后，在0.01μmol/L GA處理下，野生型淮119苗高與空白對照出現顯著差異，而突變體在GA濃度大于0.1 μmol/L后與空白對照出現顯著差異。隨著GA處理濃度的升高，野生型與突變株的苗高差異進一步顯著，但在10 μmol/LGA濃度下，兩者的差異縮小。處理10 d后，野生型和突變株的株高變化趨勢與7 d處理后保持一致。這些結果表明，GA對野生型淮119及純合突變株的生長均有促進作用，但兩個材料對GA處理的反應差異顯著，突變體對外源GA處理較野生型敏感性降低。

A—GA處理7 d; B—GA處理10 d. *表示突變體與野生型間的差異達0.05顯著水平(n=4)。

圖5 sd1突變體與野生型穗頸瘟的抗性比較

2.3 SD1基因突變提高了淮119對穗頸瘟的抗性

GA不僅調控植物的生長發育，在植物對逆境脅迫的響應中也發揮了重要作用。外源施用GA易加重稻瘟病的發生，而降低內源GA含量有助于提高水稻對稻瘟病的抗性[10]。為研究基因突變是否影響水稻稻瘟病的抗性，在稻瘟病重發區進行自然誘發鑒定及孕穗期混合菌液人工接種鑒定。結果表明，自然誘發點突變株穗發病率為23%，最高病級5級，穗損失指數僅6%，根據公式測算突變株稻瘟病綜合指數為3.00，病級3級，屬中抗(MR)等級；而野生型淮119穗發病率為82%，最高病級9級，穗損失率為33%，根據公式測算突變體稻瘟病綜合指數為6.25，病級7級，屬感病(S)等級(表3)。人工接種后的突變體穗頸節間和枝梗仍呈綠色，結實未受顯著影響，而野生型植株穗頸節間和枝梗均呈褐色，結實受到了嚴重影響，穗上多數籽粒為秕粒(圖5)。這些結果表明，基因的突變不僅有效降低了株高，同時增強了淮119對稻瘟病的抗性。

2.4 淮119中SD1基因突變引起氮素吸收利用能力下降

植物對硝酸鹽和氯酸鹽的吸收具有相似性。硝酸鉀是植物的氮源之一，而氯酸鉀對植物有毒害作用。基于這一原理，分別在種子萌發期和幼苗生長期進行氯酸鉀溶液培養實驗，利用氯酸鉀對幼苗發育和生長的影響，間接反映供試材料對硝酸鹽的吸收能力差異[26]。為研究基因突變是否影響水稻的氮素吸收利用能力，我們對野生型淮119及其突變體進行了氯酸鹽處理下的萌發實驗。結果表明，清水培養條件下野生型淮119與突變體的苗高無顯著差異，但氯酸鉀處理下突變體苗高顯著高于野生型(圖6-A和6-B)。氯酸鉀處理水稻幼苗后期，野生型植株葉片上部枯死，而突變體仍保持著較好的長勢(圖6-C)。葉片色素含量分析表明，清水培養條件下野生型和突變體總葉綠素和類胡蘿卜素含量無顯著差異，但氯酸鉀處理下突變體總葉綠素和類胡蘿卜素含量均顯著高于野生型(圖6-D和6-E)。這些結果表明，基因突變降低了水稻對氯酸鉀的吸收能力，間接證明了突變體的氮素吸收利用能力下降。

表3 sd1及淮119對水稻不同時期稻瘟病的抗性鑒定結果

3 討論

CRISPR/Cas9基因組編輯技術在作物遺傳改良中具有廣闊的應用前景[16, 27]。本研究利用CRISPR/Cas9技術，對水稻品種淮119的基因進行敲除，獲得了無轉基因插入、株高顯著下降且稻瘟病抗性增強，能在后期育種中直接使用的純合突變材料。

長期以來，雖然水稻生產水平有了很大提高，但是倒伏問題始終制約著水稻的高產和優質化發展。一旦發生大面積倒伏，將會導致減產及稻米品質大幅下降，同時增加收割成本[16, 27]。2021年水稻灌漿期溫光條件較好，淮119灌漿充分、結實率高、產量潛力大，但由于株高偏高，收獲前突來的臺風引起了該品種大面積“地毯式”倒伏，機械收割困難，產量損失非常嚴重。因此，亟待增強水稻品種的抗倒伏能力。水稻“綠色革命”基因基因編碼GA20氧化酶，參與GA的合成。自然突變體中活性GA含量下降，引起株高降低，分蘗數和收獲指數增加[10, 28]。Hu等[15]利用CRISPR/Cas9技術敲除Kasalath和特特普中的基因，發現突變體對外源GA的應答與野生型無顯著差異，表明基因編輯突變體株高的下降與自然突變體相似，也是由于GA缺失引起的。本研究突變體對外源GA敏感性比野生型降低，表明其株高下降主要由活性GA含量下降引起。GA含量與水稻的稻瘟病抗性密切相關，干擾GA合成途徑相關基因可能進一步增強水稻對稻瘟病菌抗性[17, 18]。本研究中淮119對稻瘟病為感病表型，而其基因編輯突變體的抗性顯著增強，表明對基因進行基因編輯有望同步降低水稻株高和改良水稻對稻瘟病的抗性。

含有等位基因的半矮稈水稻品種通常對氮肥不敏感，造成氮素利用率下降[29, 30]。因此，必須使用大量的氮肥才能保證這些品種的產量水平。為研究淮119中基因編輯是否影響該品種的氮素吸收利用能力，我們對野生型淮119和突變體進行了氯酸鹽處理實驗。結果表明，突變體的氮素吸收利用能力顯著低于野生型。由于大量施用氮肥會造成土壤酸化、水體富營養化等嚴重的環境問題，如何在利用基因降低水稻株高、提高收獲指數、保證產量水平的同時，改良半矮稈品種的氮素吸收利用能力，是擺在水稻遺傳育種工作者面前的緊要任務。

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Directed Knockout ofGene Improves Lodging Resistance and Blast Resistance of Rice

LI Gang1, #, GAO Qingsong2, #, LI Wei2, ZHANG Wenxia2, WANG Jian1, CHEN Baoshan1, WANG Di1, GAO Hao1, XU Weijun1, CHEN Hongqi3, *, JI Jianhui2, *

(Huaiyin Institute of Agricultural Science in Xuhuai Region of Jiangsu/Huai'an Key Laboratory of Agricultural Biotechnology, Huai'an 223001, China; Jiangsu Key Laboratory for Eco-Agricultural Biotechnology Around Hongze Lake, Huaiyin Normal University, Huai’an 223300, China; State Key Laboratory of Rice Biological Breeding Biology, China National Rice Research Institute,Hangzhou 311401, China; Corresponding author, email: chqhzfy@126.com; jijianhui@hytc.edu.cn)

【Objective】Huai 119 is a high-yieldingrice variety. To improve its unfavorable traits, especially high plant height and poor resistance to rice blast, we used the CRISPR/Cas9 gene editing technology to knock out its ‘Green Revolution’ gene.【Method】We selected thegene as the target to construct the CRISPR/Cas9 gene knockout vector, which was then transformed intoHuai 119 by-mediated transformation method, and the homozygousknockout line without transgenic insertion was obtained. Subsequently, we compared and analyzed the plant height, rice blast resistance, and nitrogen uptake and utilization efficiency of theand wild-type lines.【Result】We successfully isolated a homozygousknockout line without transgenic insertion in the background of Huai 119. In field paddy, it was found that over 60% of the planting area of wild-type Huai 119 was lodging, while thehomozygous mutant population effectively avoided lodging in the later stages of growth due to its shorter plant height. In addition, after treatment with different concentrations of GA (0.01-1.00 μmol/L), the plant height increase of wild-type plants was significantly greater than that of theline, indicating that the sensitivity ofline to exogenous GA treatment was reduced. The identification of rice blast resistance shows that knocking outalso contributed to the improvement of rice blast resistance of Huai 119. However, the absorption and utilization efficiency of nitrogen decreased due to the knockout of. 【Conclusion】The knockout ofgene in the rice variety Huai 119 not only improves lodging resistance by reducing plant height, but also enhances the resistance to rice blast.

CRISPR/Cas9; gene editing;; rice blast; lodging resistance; rice

10.16819/j.1001-7216.2023.221113

2022-11-24;

2023-02-08。

淮安市自然科學基金項目(HAB202076)；江蘇省重點研發計劃資助項目(BE2021334、BE2021323)；江蘇省農業科技自主創新資金資助項目[CX(22)3157]；國家自然科學基金資助項目(32070345)；江蘇省自然科學優秀青年基金項目(BK20180107)。