黃化病檳榔園中8種植物植原體分子檢測及其遺傳變異分析

朱安娜　于少帥　蘇莉惠　劉麗　宋薇薇　閻偉

關鍵詞：植原體；檳榔黃化病；自然寄主；分子檢測；遺傳多樣性

中圖分類號：S763.7 文獻標識碼：A

植原體（phytoplasma）是一類無細胞壁、寄生于植物韌皮部、難分離培養的原核致病菌[1]，該致病菌于1967 年由日本學者DOI 等首次發現[2]。由植原體引起的植物病害是一種毀滅性病害，其引起的植物病害典型癥狀包括花變葉、黃化、叢枝、皺縮、小葉等[3-4]。海南植原體病害種類較為豐富，約占我國植原體病害的1/4，給海南當地農林產業和生態環境造成嚴重影響。植原體在海南危害的植物包括檳榔、橡膠、花生等，其中由植原體引起的檳榔黃化病（areca palm yellow leafdisease， AYL）在海南發生范圍廣且危害嚴重[5]。

檳榔（Areca cathecu L.）是一種極具觀賞、藥用價值的棕櫚植物，其特點是高大挺拔、容易栽植，具有綠化、美化、凈化、優化環境的作用[6]。由植原體引起的檳榔黃化病是一種傳染性極強，導致產量降低的植物病害。我國檳榔黃化病首次發現于海南屯昌，目前已經蔓延至瓊海、萬寧、定安等眾多市（縣），該病擴散速度快，發病范圍逐年擴大[5]。早期金開璇等[7]通過電鏡和DAPI染色方法在感病組織中觀察到植原體。此后，其他學者相繼通過PCR 擴增、四環素注射等方法證實了植原體為引起檳榔黃化病的病原[8-9]。

植原體病害以防為主，明確植原體自然寄主、傳播媒介等病害循環途徑和病原傳播載體，找出其病害循環的薄弱環節，對于精準制定該類病害的防控措施具有重要意義。目前海南檳榔黃化植原體及其病害傳播媒介和擴散途徑不清，嚴重制約該病害的防控管理，也給園林景觀帶來了嚴重影響。因此，本研究開展檳榔黃化植原體自然寄主的分子檢測及其遺傳變異規律與系統發育關系分析。根據植原體病害典型癥狀特征，對海南黃化病檳榔園中疑似植原體自然寄主進行調查、采樣，明確不同植物攜帶植原體情況及植原體遺傳變異規律，確定發病檳榔園中檳榔黃化植原體的自然寄主情況，為制訂切實可行、精準有效的檳榔黃化病防控管理策略提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 根據植原體病害典型的癥狀特征，對海南定安（110°8′59.57″E， 19°34′33.56″N）、瓊海（110°23′3.06″E， 19°7′56.29″N）黃化病檳榔園中疑似植原體病害植物進行調查、采樣，調查采樣時間為2021—2022 年，采樣部位為植物葉片組織，同時采集健康植株樣品作為陰性對照，所有樣品保存于–20 ℃，備用。

1.1.2 主要試劑和儀器 植物基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型）、2×PCR Master Mix 預混液購于天根生化科技公司（北京）有限公司，PCR擴增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其他試劑均為國產分析純。KZ-III-F 高速低溫組織研磨儀購自武漢賽維爾生物科技有限公司，Biometra 070-851 型PCR 儀購自德國耶拿公司，DYY-6C 型電泳儀購自北京六一儀器廠，Universal320R 型高速冷凍離心機購自廣州深華公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取 稱取0.1 g 植物樣品，利用CTAB法提取樣品總DNA，方法參照天根植物基因組DNA 提取試劑盒說明書，并保存于–20 ℃備用[10]。

1.2.2 PCR 擴增 利用植原體通用引物P1/P7 和R16mF2/R16mR1 進行植原體16S rRNA 基因PCR擴增，利用SecAFor1/SecARev3 進行植原體secA基因擴增，引物擴增信息如表1 所示。PCR 擴增模板為樣品總DNA。16S rRNA 基因第1 輪PCR擴增條件：94.0 ℃預變性5 min；94.0 ℃變性30 s，50.0 ℃ 退火40 s ， 72.0 ℃ 延伸2 min ， 72 ℃10 min，共35 個循環。第1 輪PCR 擴增產物稀釋50 倍后用作第2 輪PCR 擴模板，16S rRNA 基因第2 輪擴增條件：94.0 ℃預變性5 min；94.0 ℃變性30 s，50.0 ℃退火40 s，72.0 ℃延伸1 min30 s，72 ℃ 10 min，共35 個循環。secA 基因的PCR 擴增反應條件為：94.0 ℃預變性5 min；94.0 ℃變性30 s，53.0 ℃退火40 s，72.0 ℃延伸1 min，72 ℃ 10 min，共35 個循環。PCR 反應體系均為50 μL，所得PCR 擴增產物經過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測確定目的條帶，將PCR 擴增產物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.3 16S rRNA 與secA 基因序列比對 將測序所獲得的核苷酸序列用DNAMAN 6.0 軟件校正編輯，進行多重序列比對分析，通過BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov//Blast.cgi）進行比對析，與GenBank 數據庫中已知的植原體核苷酸序列進行比對分析。通過多重序列比對與BLAST比對明確不同植原體植株之間的相似性，以山杜英衰退植原體（登錄號：OL689207）為參考序列進行變異位點分析，該序列長度為1503 bp。

1.2.4 系統發育分析 利用MEGA 7.0 軟件基于N-J 法（neighbor-joining）構建不同植原體株系的系統進化樹。將自展值設為1000，揭示所獲得的植原體與GenBank 數據庫中已收錄植原體株系間的系統發育關系。將洋蔥黃化植原體（ onionyellows phytoplasma， OY-M， AP006628）、翠菊黃化植原體（aster yellow phytoplasma， CP000061）、蘋果簇生植原體（apple proliferation phytoplasma，CU469464）、葡萄黃化植原體（Ca. phytoplasmaaustraliense， AM422018）、草莓致死性黃化植原體（strawberry lethal yellows phytoplasma， CP002548）等植原體株系作為系統發育樹的外類群，其他植原體株系相關序列信息見表2。

2 結果與分析

2.1 疑似植原體病害植物調查

對海南定安、瓊海的黃化病檳榔園中疑似植原體病害植物進行調查、采樣，共采集8 種植物45 份疑似植原體病害植物樣品，樣品包括苦楝、龍葵、山黃麻、藿香薊、野茼蒿、黃皮、白背葉、鬼針草；樣品表現的疑似植原體病害典型癥狀包括叢枝、黃化、小葉及葉片皺縮等。采集的疑似植物植原體病害樣品信息見表3，疑似植物植原體病害癥狀如圖1 所示。

2.2 PCR 擴增及病原檢測

利用通用引物P1/P7、SecAFor1/SecARev3 分別進行PCR 擴增，在6 個山黃麻樣品中分別擴增到約1.8、0.6 kb 的目的條帶，其他樣品中未擴增到。利用通用引物R16mF2/R16mR1 進行巢氏PCR擴增，在1 個苦楝樣品檢測到約1.4 kb 的目的條帶，其余樣品均未擴增到。通過目的條帶測序，在6 個山黃麻叢枝樣品中均獲得植原體16S rDNA 序列和secA 基因序列。6 個山黃麻植原體株系的16SrDNA 序列一致， 經測序所得序列長度均為1425 bp；secA 基因序列也一致，測序所得序列長度均為595 bp。基于16S rDNA 序列多重比對分析表明：所得山黃麻植原體與已報道的山黃麻叢枝植原體株系（MW138004）序列相似性為100%。這6 個山黃麻叢枝植原體株系分別為TtWBDA18、TtWB-DA19、TtWB-DA20、TtWB-DA21、TtWB-DA22 和TtWB-DA23。在1 個苦楝叢枝樣品中擴增到植原體16S rDNA 序列，測序所得序列長度為1122 bp。基于該序列比對分析表明：所得苦楝植原體與海南三亞已報道苦楝叢枝植原體（KP662119；KP662120）序列相似性為100%，該苦楝叢枝植原體株系為CWB-DA55。

2.3 序列變異分析

基于16S rDNA序列比對分析表明，本研究中苦楝叢枝植原體與16SrⅠ組的苦楝叢枝植原體hnsy1 （ KP662119 ）、苦楝叢枝植原體hnsy2（KP662120）、馬松子綠變植原體（KX150461）等序列相似性均為100%，與其他組植原體株系的序列相似性均低于99.8%（表4）。基于secA 基因序列比對分析表明，本研究中山黃麻叢枝植原體與16SrⅩⅩⅩⅡ組的山黃麻叢枝植原體（MW139904）、山杜英衰退植原體（OL689202）序列相似性分別為100%、99.1%，與其他組植原體株系的相似性均低于86%（表5）。基于SecA 氨基酸序列比對分析表明，本研究中山黃麻叢枝植原體與16SrⅩⅩⅩⅡ組的山黃麻叢枝植原體（MW139904）、山杜英衰退植原體（OL689202）序列相似性分別為100%、98.5%（表6）。由此可知，不同植原體株系間氨基酸序列的變異水平較高。基于16S rDNA 序列的遺傳變異分析表明，本研究中山黃麻叢枝植原體與山杜英衰退植原體（OL689207）共存在5 個變異位點，分別在67位、102 位、1088 位、1277 位、1446 位（表7）。

2.4 系統發育分析

基于16S rRNA 基因的系統發育分析表明（圖2），山黃麻叢枝植原體與馬來西亞長春花綠變（EU371934）、山杜英衰退植原體（OL689207）等16SrⅩⅩⅩⅡ組植原體聚于同一個進化分支，支持率為90%。苦楝叢枝植原體與海南長春花綠變植原體株系（GU113146）、蛇婆子綠變植原體株系（ MW353909 ）、馬松子綠變植原體（KX150461）、刺芫荽叢枝植原體（GU113156）等16SrI 組植原體聚于同一個進化分支，支持率為95%。基于secA 基因序列系統發育分析表明（圖3），本研究所得山黃麻叢枝植原體與已報道的山黃麻叢枝植原體（MW139904）、山杜英衰退植原體（OL689202）等16SrⅩⅩⅩⅡ組植原體聚于同一個進化分支，支持率為100%。基于SecA 氨基酸系統發育分析表明（圖4），山黃麻叢枝植原體與已報道的山黃麻叢枝植原體（MW139904）、山杜英黃化植原體（LC257973）等16SrⅩⅩⅩⅡ組植原體聚于同一個進化分支，支持率為100%。

3 討論

本研究在表現黃化病的檳榔園中檢測到16SrⅩⅩⅩⅡ組山黃麻叢枝植原體和16SrⅠ組苦楝叢枝植原體。因植原體難分離培養，導致其檢測較為困難。隨著分子生物學技術的不斷發展，植原體病害的診斷與檢測也在不斷進步。在植原體的檢測中，16S rDNA 序列分析可以很好地說明植原體間的遺傳變異規律和系統發育關系。目前，學者將植原體分為49 個組[14]。經比較發現本研究中苦楝叢枝植原體與陳健鑫等[15]報道的滇樸叢芽植原體云南株系、車海彥等[16]報道的海南長春花綠變植原體株系均屬于16SrI 組植原體，且變異程度較小。進一步深入研究苦楝叢枝植原體和滇樸叢芽植原體、長春花綠變植原體之間的遺傳變異規律還需從多個基因進行探究。本研究中的山黃麻叢枝植原體與墨西哥長春花綠變植原體、前期研究[10]報道的海南山黃麻海南株系同屬于16SrⅩⅩⅩⅡ組植原體，變異程度不大。萬瓊蓮等[17]報道的云南羽脈山黃麻叢枝植原體屬于16SrⅠ-Ⅹ亞組。本研究與前期研究[10]報道采用的引物不同，本研究擴增出來的序列片段除了16S rDNA，還包括16S-23S rDNA 基因間區序列，揭示了本組植原體相對更多的序列信息，為后續研究這類植原體提供參考。

植原體不同DNA 序列的擴增效率存在差異。本研究從苦楝叢枝植原體中擴增獲得1122 bp 的16S rDNA 基因片段，但secA 基因未擴增出，可能是植原體總DNA 濃度低，擴增效率較低導致。鄭文虎[18]報道了海南長春花小葉病植原體secA和secY 基因，蘇帆等[19]報道了云南芝麻叢枝和花變葉植原體16S rRNA 和rp 基因，楊靜宇[20]報道了海南竹柏扁枝植原體16S rRNA、tuf 基因。相同植物寄主植原體種類也存在多樣性。國外研究的苦楝植原體也有相關報道，如GALDEANO 等[21]和ARNEODO等[22]通過研究阿根廷的苦楝叢枝植原體株系，發現二者均屬于16SrⅧ組，癥狀類型表現為黃化和衰退，與本研究檢測的苦楝叢枝癥狀有相同之處，但16Sr 組存在差異。本研究發現白背葉、藿香薊、野茼蒿等樣品也表現典型植原體病害癥狀，PCR 反應也擴增到特異性條帶，但測序后經過BLAST 發現并不是植原體而是植物的葉綠體。由此可見，植原體的檢測受多種因素影響。為更方便快捷開展此類難培養微生物的檢測診斷工作，需要專研出一種高效、快速、靈敏度高的檢測技術以滿足不同寄主的需求，目前已有檳榔黃化植原體等相關快速可視化檢測技術的報道[23]。

植原體自然寄主的多樣性有助于其相關病害的傳播擴散。海南地處熱帶，自然資源豐富，由于夏冬季節溫度較高，一些介體昆蟲也會傳播植原體病害[24]。近年來，人們對植原體的研究廣泛，其種類也日益增加，不同的寄主也有利于傳播植原體，同組的變異水平不高，由此推測植原體可能是通過同一種昆蟲或者是同一中間寄主在不同環境下進行傳播。如萵苣退綠植原體可被葉蟬傳播[25]，泡桐叢枝植原體可通過牛筋草、辣椒、花生等7 種自然寄主傳播[26]。由于自然寄主引起的相關植物黃化、小葉、叢枝等癥狀，噴灑農藥、施肥、采取建造水肥調節一體化等措施及時清理植原體傳染的源頭，有利于減少中間寄主[27]。由于目前檳榔黃化病病害傳播媒介昆蟲和擴散途徑尚不明確，對園林景觀也造成了一定的影響。海南檳榔黃化植原體屬于16SrⅠ組，本研究的苦楝叢枝植原體也為16SrⅠ組，進一步明確了檳榔園中植原體的自然寄主范圍。由此可知，及時清理苦楝等寄主植物，可有效清除病源，切斷病原傳播途徑。海南作為我國檳榔主產地，更需要有效防控該類病害，減少中間寄主，清除傳染源頭，從而有效地減少或防止相關植原體傳播。本研究利用分子生物學檢測方法對該病害的帶病自然寄主及其病原多樣性進行檢測分析，基于檢測結果，及時清理檳榔病園內病樹病草，對于防止檳榔黃化病的大面積擴散起到重要作用。研究結果對于制訂切實可行的海南檳榔黃化病防控管理策略具有重要意義。