不同微生物菌劑對辣椒疫病防控效果及土壤細菌群落結構的影響

杜公福　黃永　黃大野　倪征平　李曉亮　彭家麗　劉維俠　戚志強

關鍵詞：微生物菌劑；辣椒疫病；防控效果；土壤細菌群落

中圖分類號：S436.418.1 文獻標識碼：A

辣 椒 疫 病 是由辣椒疫霉菌（ Phytophthoracapsici）引起的一種毀滅性的土傳病害[1]，自該病在我國被發現以來，在有辣椒種植的省份均有發生與危害，可為害辣椒莖稈、果實、葉片等部位，常造成全株萎蔫死亡，一般可造成20%～30%的產量損失，嚴重時甚至絕收，辣椒疫病的防控已成為辣椒生產中亟需解決的重大難題[2-3]。辣椒是海南主要冬季瓜菜之一，種植面積約4×10⁴hm²，占冬季瓜菜種植面積的20%[4]，其產品主要在“兩節”期間銷往國內各大城市，因此，在農產品質量安全方面實行最嚴格的規定，為了杜絕農藥殘留超標，在2021 年海南省印發的《海南省化學農藥化肥減量實施總體方案》中指出，到2025 年化學農藥使用量較2020 年減少15%，在此背景下，尋找能夠減少化學農藥施用的高效防控辣椒疫病的手段成為辣椒產業可持續健康發展的關鍵。

目前，化學農藥、輪作、嫁接等常規措施均能在辣椒疫病防控中起到一定的效果，但受到抗藥性、農藥殘留與環境污染、土地因素、生產成本等問題的影響，在實際生產中均存在一定的限制[5-6]，而有益微生物的應用將不受這些因素的限制，是一種高效、綠色、環境友好的防控技術，符合產業發展的需求。因此，有效微生物菌劑的篩選和應用是辣椒疫病綠色防治的重要工作。近年來，許多研究表明，多種有益微生物對辣椒疫病具有生物防治作用，包括芽孢桿菌、木霉菌及放線菌等[7-10]。芽孢桿菌和木霉菌繁殖速度快、生命力強，在與棲居微生物競爭時，因有較強的定殖能力而具有明顯的優勢，并能產生有機酸、酶以及抗菌肽等豐富的代謝物，從而有效抑制病原菌生長[11-14]。韓永琴等[15]利用109 CFU/g 多黏類芽胞桿菌可濕性粉劑、25%嘧菌酯懸浮劑和68%精甲霜·錳鋅水分散粒劑對辣椒疫病進行防效試驗，防效分別為74.35%、71.54%和76.30%；胡建坤等[16]利用50%烯酰嗎啉可濕性粉劑、687.5 g/L 氟菌·霜霉威懸浮劑和15%木霉可濕性粉劑對辣椒疫病進行田間防效試驗，防效分別為65.08%、68.99%和67.04%，這些研究結果說明多黏類芽胞桿菌、木霉菌已經達到與化學農藥同等的防治效果。

目前用于防治辣椒疫病的微生物菌劑較多，但防治效果的穩定性存在不確定性[17]，導致種植戶選擇困難；另外，已有的研究大多關注防病效果、地上部性狀和基于傳統方法可培養微生物群落分析[18]。而運用高通量測序技術可對辣椒根際中的細菌群落進行全面地鑒定分析，可更精準地挖掘出影響辣椒疫病防控效果的關鍵土壤微生物群落。基于本課題組前期收集、篩選獲得對辣椒疫霉菌有較好抑制作用的枯草芽孢桿菌、哈茨木霉菌等6 種微生物菌劑，為了探究其對辣椒疫病的防控效果及其對土壤細菌群落結構的變化，本研究擬通過盆栽試驗開展6 種微生物菌劑對辣椒疫病的防控效果研究，通過高通量測序技術分析辣椒根際土壤細菌群落結構的變化，以期明確不同微生物菌劑的防治效果及其對辣椒根際土壤微生物種群的影響，為應用微生物菌劑綠色防治辣椒疫病提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試微生物菌劑和化學藥劑共7 種（表1）。供試菌株辣椒疫霉菌分離保存于中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所冬季瓜菜研究中心。供試辣椒品種為海椒309，購于海南瓊研瓜菜良種開發有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計試驗于 2021 年11—12 月在中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所五隊科研基地大棚內進行。試驗設9 個處理（表1），設3 次重復，每次重復4 株。將苗齡一致，4～5葉期健壯的辣椒幼苗移栽至裝有土的栽培盆（14.8 cm×13.5 cm）中，移栽當天進行藥劑灌根，A₁～A₆處理的藥劑均稀釋300 倍液，A₇處理的藥劑稀釋500 倍液，進行均勻灌根，每次每株灌根300 mL 藥水，A₈、CK 處理等量清水，每隔5 d灌根1 次，連續2 次。待第2 次灌根后3 d 采用傷根法接種辣椒疫霉菌，A₁～A₈處理接種辣椒疫霉菌游動孢子懸浮液10 mL/株（濃度10⁶個/mL），等量清水不接菌為對照（CK）。

1.2.2 病情調查與樣品采集接種后 15 d 進行病情指數調查，辣椒疫病調查分級[19]。0 級：無病；1 級：幼苗根莖部輕微水漬狀變褐，葉片不萎蔫或可恢復性萎蔫；2 級：幼苗根莖部變水漬狀褐色，發病部位長度1～2 cm，葉片不可恢復性萎蔫，下部葉片偶有脫落；3 級：幼苗根莖部變水漬狀褐色，發病部位長度超過2 cm，葉片明顯萎蔫或落葉明顯；4 級：幼苗根莖部變水漬狀褐色，并且莖稈有縊縮現象，除生長點外全部落葉或植株萎蔫；5 級：植株枯死。

辣椒幼苗移栽30 d 后采集土樣。采集9 個處理辣椒根際土壤，每個重復取3 株混合土樣為1個樣本，每個處理取3 個樣本，共27 個樣本，分別用無菌袋封裝，做好標記帶回實驗室，置于–40 ℃保存備用。將采集的27 個土樣送至上海美吉生物醫藥科技有限公司，并采用高通量測序技術完成細菌群落的結構分析。

1.3 數據處理

1.3.1 計算發病率及病情指數

采用 Excel 2003軟件對試驗數據進行基本處理，計算發病率和病情指數。

1.3.2 土壤細菌群落數據分析 采用DPS軟件進行方差分析。利用上海美吉生物醫藥科技有限公司提供的云數據分析平臺I-sanger 進行辣椒根際土壤細菌多樣性分析，構建物種組成群落圖。細菌多樣性指數選用Ace 指數、Chao 1 指數、Shannon 指數及Simpson 指數。Ace 指數和Chao 1指數是衡量物種豐富度的指數，數值的大小表示物種豐富度的高低，指數越大，說明物種的豐富度越高；Shannon 指數用于衡量物種多樣性，而Simpson 指數表示在群落中隨機抽樣的個體屬于同一物種的概率， 也用來衡量物種多樣性，Shannon 指數越大，Simpson 指數越小，說明樣品的物種多樣性越高[20-23]。

2 結果與分析

2.1 不同微生物菌劑對辣椒疫病的防控效果

在接種后第15 天進行發病情況調查（表2），A1 處理的辣椒植株病情指數為13.33，防治效果為85.58%；A2 處理的病情指數為16.67，防治效果為81.97%；A3 處理的病情指數為48.33，防治效果為47.17%；A4 處理病情指數46.67，防治效果為49.12%；A5 處理病情指數為63.33，防治效果為30.60%；A6 處理病情指數為55.00，防治效果為39.86%；A7 處理的病情指數為68.33，防治效果為25.83%。結果表明，A1 和A2 處理具有較好的防治效果，防效均達80%以上。

2.2 不同微生物菌劑對根際土壤細菌群落結構的影響

2.2.1 根際土壤細菌多樣性 A₁～A₆ 處理的辣椒根際土壤的細菌Ace 指數、Chao 1 指數和Shannon指數顯著高于A₇ 處理（多菌靈），而Simpson 指數顯著低于A₇ 處理，并且其他微生物菌劑處理之間無顯著差異（表3）。本次測序各樣本文庫的覆蓋率（coverage）均大于97%，因此，研究結果可以代表樣本中微生物的真實情況，表明利用微生物菌劑對辣椒疫病進行防控不僅有助于顯著提高辣椒根際土壤細菌的多樣性，而且也有利于顯著提高土壤細菌的豐富度。

2.2.2 基于門分類水平的優勢菌群分析 基于門分類水平分析發現，A₁～A₆（微生物菌劑）、A₇（多菌靈）、A₈（辣椒疫霉菌）、CK 處理的辣椒根際土壤中共有的優勢細菌門有12 個（圖1）。其中，變形菌門（Proteobacteria）細菌占比最高，幅度在31.72%～37.73%之間；其他優勢細菌中放線細菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、藍藻菌門（Cyanobacteria）在各處理間的占比差異不大。但不同微生物菌劑處理均提高了變形菌門、擬桿菌門（Bacteroidota）的占比，尤其是A₁ 和A₂處理顯著提高了變形菌門、擬桿菌門的豐富度；同時A₇處理改變了髕骨細菌門（Patescibacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門、芽單胞菌門（Gemmatimonadota）、粘細菌門（Myxococcota）的占比，其中髕骨細菌門的豐度顯著升高，而綠彎菌門（Chloreflexi）、厚壁菌門、擬桿菌門、芽單胞菌門、粘細菌門的豐度明顯降低。

2.2.3 基于科分類水平的優勢菌群分析 基于科分類水平分析發現（圖2），A₁～A₆（微生物菌劑）、A₇（多菌靈）、A₈（辣椒疫霉菌）、CK 處理的辣椒根際土壤中組成占比大于1%的優勢細菌科有16 個，還有占比小于1%的未知菌科（以others表示）。其中黃色桿菌科（Xan thobacteraceae）占比最高，幅度在5.36%～7.80%之間。而且黃色桿菌科、高溫單孢菌科（Thermo monosporaceae）、微單孢菌科（ Micromonosporace ae ） 、Rhizobiales_Incertae_Sedis 、芽單胞菌科（ Gemmatimonadaceae）、Devosiaceae、熱微菌科（Thermomicrobiaceae）、羅丹諾桿菌科（Rhodanobacteraceae）、生絲微菌科（Hyphomicrobiaceae）、鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae）、類諾卡氏菌科（Nocardioidaceae）在A₁～A₆、A₈、CK 處理之間的占比差異不大。

A₁～A₆與A₇、A₈、CK 處理相比，在噬幾丁質菌科（Chitinophagaceae）、類固醇桿菌科（Steroidobacteraceae）和微球菌科（Micrococcaceae）的豐富度均有提高，尤其是A₁和A₂處理，顯著提高微球菌科、噬幾丁質菌科和類固醇桿菌科的豐富度；A₁～A₆與A₈、CK 處理相比，降低了諾卡氏菌科（Nocardiaceae）和類諾卡氏菌科的豐富度。A₇處理改變了類諾卡氏菌科的占比，與其他處理相比，提高了類諾卡氏菌科的豐富度，而黃色桿菌科、諾卡氏菌科、高溫單孢菌科、噬幾丁質菌科、微單孢菌科、Rhizobiales_Incertae_Sedis、芽單胞菌科、熱微菌科、羅丹諾桿菌科、生絲微菌科、鞘脂單胞菌科、類固醇桿菌科的豐度均明顯降低。

2.2.4 基于OTU 水平的Venn 圖分析 Venn 圖主要用于統計多個樣本中所共有和獨有的可操作性分類單元（operational taxonanic units， OTU）數量。由圖3 可知，A₁（枯草芽孢桿菌）、A₂（哈茨木霉菌）、A₇（多菌靈）、A₈（辣椒疫霉菌）和CK 處理的辣椒根際土壤中細菌總OTU 數量分別為3366、3379、2994、3406 和3365 個。其中，共有的OTU 有2032 個，A₁、A₂、A₇、A8 和CK處理的辣椒根際土壤中特有的細菌OTU 數分別為112、128、70、118 和100 個。由此結果表明，經過A₁、A₂處理增加了辣椒根際土壤中特有的優勢細菌數量，特有優勢細菌豐富度和多樣性的提高可能是辣椒抗性提高的主要機制。A₇處理降低了土壤細菌豐富度和多樣性，長期使用可能會造成土壤細菌的豐富度和多樣性持續降低，土壤微生態失衡，進而可能引起土壤向易感病土壤發展的趨勢。A₈處理也增加了特有的細菌數量，這些增加的菌群可能是引起細菌菌群穩態失調，與辣椒疫霉菌協同引起辣椒疫病持續發病的原因。

3 討論

微生物菌劑藥效的穩定性一直是研發者和使用者重點關注的問題，生防菌的活菌數、制劑加工、使用方法以及田間環境因素等都可能影響農用微生物菌劑的作用效果[24-27]。肖小露[28]利用枯草芽孢桿菌BS193 防治辣椒疫病，BS193 發酵液灌根后間隔0、24、48、72 h 后接種病原菌，9 d后各處理的防治效果分別為23.43%、41.25%、49.41%、51.44%，間隔48、72 h 后接種的防病效果均顯著高于灌根后立即接種病原菌的處理。結果表明微生物菌劑需要一定時間進行定殖、繁殖或誘導作物產生抗性，才能更高效地防治靶標病菌。本研究采用灌根2 次后間隔72 h 接種病原菌，使供試的6 種微生物菌劑有充分的時間進行定殖和繁殖。但是，供試的6 種微生物菌劑對辣椒疫病的防治效果仍有較大差異，A₁（1×10⁸CFU/g枯草芽孢桿菌微囊粒劑）和A₂（1×10⁸CFU/g 哈茨木霉菌水分散粒劑）處理的防效較好，防治效果分別為85.58%和81.97%；A₃（5×10⁸CFU/g 熒光假單胞桿菌顆粒劑）、A₄（淡紫褐鏈霉菌NBF715粉劑）、A₅（1×10¹⁰CFU/g 枯草芽孢桿菌可濕性粉劑）、A₆（3×10⁸CFU/g 哈茨木霉菌可濕性粉劑）的防治效果分別為47.17%、49.12%、30.60%、39.86%。這些微生物菌劑對辣椒疫病防效的差異性可能與其生防遺傳特性和藥劑劑型有關。席亞東等[17]收集了30 株木霉菌并對辣椒疫霉菌進行防控研究，其中17 株菌為同一菌種（鉤狀木霉菌），平板對峙3 d 后抑菌率為0.09%～68.99%，施用木霉菌后30 d 盆栽防控效果為17.90%～71.70%，該研究結果表明，相同菌種不同菌株的生防效果存在差異，這可能與其生防遺傳特性等有關。并且劑型對于生防菌的活性至關重要，起著保護、稀釋或緩釋有效成分，優化使用效果以及擴大使用范圍等作用，雖然生防菌具有生防效果，但其不溶于水將會使其喪失生防效力，因此，生防菌需輔以助劑以保持其在分散或儲藏過程中的活性狀態[29]。相關研究表明，枯草芽孢桿菌在水劑和可濕性粉劑中，芽孢會隨著儲存期的延長，其存活率也逐漸降低，導致田間防效不穩定[30]。MA 等[31]研究表明，微膠囊劑型的枯草芽孢桿菌在室溫條件下貯藏540 d 后，其存活率為87.53%，顯著高于其可濕性粉劑的存活率（47.06%）。微膠囊劑是當前農藥新劑型中技術含量最高的一種，具有抑制因多種環境因素（如光、熱、空氣、雨水、土壤）和其他化學物質等造成的分解和流失，提高藥劑的穩定性和控制藥效釋放等功能，從而提高藥劑的利用率，延長其持效期[32-33]。裴文亮等[34]開展了木霉菌水分散粒劑熱儲穩定試驗，以可濕性粉劑木霉菌作為對照，經過熱貯處理后（54 ℃、14 d），木霉菌可濕性粉劑的存活率僅為50%，而木霉菌水分散粒劑的存活率高達90%，由此可見，水分散粒劑對木霉菌孢子有很好的保護作用，增加了藥效的穩定性。水分散粒劑是一種可在水中迅速分散的劑型，工藝技術含量也比可濕性粉劑高，其藥劑粒徑更小，在施用到作物或者是防治靶標上時，水分散粒劑更容易進入作物體內或抑制防治靶標[29]。筆者就我國已登記的枯草芽孢桿菌和木霉菌的劑型種類（截至2022 年9 月有效的單劑）[35]進行統計分析，可濕性粉劑占比為79.8%，水分散粒劑占7.1%，懸浮劑占6.1%，顆粒劑占2.0%，其他占5.0%（微囊粒劑、水劑、水乳劑等），與有益微生物的其他研究領域（如生防機理、生防菌篩選、生防菌培養等）相比，國內有關劑型的研究相對較薄弱，微生物菌劑殺菌劑劑型比較單一，主要為可濕性粉劑。因此，建議加強農用微生物殺菌劑劑型的相關基礎研究，并通過新劑型的研發和原有劑型技術的優化，提高微生物殺菌劑的防治效果，降低其生產成本。本研究中，A₁（1×10⁸CFU/g 枯草芽孢桿菌微囊粒劑）和A₂（1×10⁸CFU/g 哈茨木霉菌水分散粒劑）處理相對于其他4 種微生物菌劑處理的藥效穩定性更好，這跟生防菌較好的生防特性和藥劑劑型有一定的相關性。A₁和A₂處理具有較好的防治效果，防效均達80%以上，A₁處理與黃大野等[36]利用1×10¹²CFU/g 枯草芽孢桿菌水分散粒劑通過盆栽試驗對辣椒疫病進行防治，防效為86.67%的結果相當。A₂ 處理的防效與張量[37]利用5.43×10¹⁰CFU/g 木霉菌可濕性粉劑對辣椒疫病的防治效果為83.89%的結果相當。

優良的微生物菌劑不僅具有良好的藥效穩定性，應還具有影響土壤微生物多樣性的能力，其作為外源功能微生物可以通過改變土壤原有微生物群落的組成和優勢種群的數量繼而達到防控病害的效果[38-39]。葉旻碩等[18]、涂璇等[40]在盆栽條件下，發現施用微生物菌劑和拮抗放線菌能影響辣椒根系微生物數量并控制辣椒疫霉菌的生長繁殖，從而降低辣椒疫霉菌對根系的侵染。這些研究均與本研究結果一致，經微生物菌劑處理的發病率均低于接種處理，同時本研究分析了A₁（枯草芽孢桿菌）、A₂（哈茨木霉菌）、A₇（多菌靈）和CK 處理的辣椒根際土壤中細菌門、科水平的豐富度，土壤細菌總OTU 和特有的細菌OTU，發現經A₁ 和A₂處理后，在門水平明顯提高了變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidota）的豐富度，ZHANG 等[41]發現植物根系吸收了較高比例的變形菌（ Proteobacteria ） 和擬桿菌（Bacteroidota），它們在抑制病原菌和對環境脅迫的耐受性中發揮關鍵作用；在科水平顯著提高微球菌科（Micrococcaceae）、噬幾丁質菌科（Chitinophagaceae） 和類固醇桿菌科（ Steroidobacteraceae）的豐富度；與CK 處理相比，降低諾卡氏菌科（Nocardiaceae）和類諾卡氏菌科（Nocardioidaceae）的豐富度；土壤細菌總OTU 數量和特有的OTU 數量均高于A₇、CK 處理，結合這2 個處理的防治效果，細菌總OTU 和特有的OTU 豐富度和多樣性的提高，增強了辣椒抵抗辣椒疫霉菌侵染的能力。此外，A₇處理，明顯降低了土壤細菌總OTU 和特有的OTU 豐富度和多樣性，這與ANDREOTE 等[42]的研究結果相似，農業系統中，化學農藥的使用使農田中土壤微生物的生物多樣性降低，對植物產生不利影響，微生物多樣性降低后，病原菌能夠更加快速地入侵植物根系。

4 結論

1 × 10⁸CFU/g 枯草芽孢桿菌微囊粒劑和1×10⁸CFU/g 哈茨木霉菌水分散粒劑對辣椒疫病有較好的防治效果，防治效果分別為85.58%和81.97%，使用后增加了辣椒根際土壤中特有的優勢細菌數量，特有優勢細菌豐富度和多樣性的提高可能是辣椒抗性提高的主要機制。使用化學藥劑多菌靈后降低了土壤細菌的豐富度和多樣性，長期使用可能會造成土壤細菌豐富度和多樣性持續降低，土壤微生態失衡，進而可能引起土壤向易感病土壤發展的趨勢。本研究僅在盆栽條件下開展，今后將開展枯草芽孢桿菌和哈茨木霉菌微生物菌劑在田間復雜土壤生態環境中的應用研究，以進一步提升病害防控效果和明確相關防控機理。