淡紫灰鏈霉菌gCLA4對獼猴桃潰瘍病預防效果及抑菌活性成分分離鑒定

劉 巍,王 華,楊若蘭,劉 露,張梓涵,秦虎強,黃麗麗

(1.西北農林科技大學,旱區作物逆境生物學國家重點實驗室,陜西楊凌 712100;2.西北農林科技大學 植物保護學院,陜西楊凌 712100;3.西北農林科技大學 生命科學學院,陜西楊凌 712100)

獼猴桃(Actinidiachinensis)營養豐富、經濟價值高,已發展為陜西、四川、貴州等省區域經濟發展和鄉村振興的重要支柱產業[1]。然而,由丁香假單胞菌獼猴桃致病變種(Pseudomonassyringaepv.actinidiae,Psa)引致的細菌性潰瘍病(Kiwifruit Bacterial Canker)是產業上的毀滅性病害,可導致葉斑、花腐、枝干流膿,死樹毀園嚴重。目前,該病害的防治主要依賴化學藥劑,致使病原菌對銅制劑抗藥性增加[2]。生防菌具有低毒、低殘留、環境友好和不易產生抗藥性等特點,對保護果品安全和生態環境安全具有重要作用,而用于防治獼猴桃潰瘍病且市場化的生物藥劑種類較少,亟待尋找或開發高效、安全的生物藥劑。

淡紫灰鏈霉菌StreptomyceslavendulaegCLA4菌株是西北農林科技大學植物保護學院果樹病害病原生物學和綜合防治研究團隊從黃瓜葉片中分離得到的一株內生菌,其對真菌、卵菌和細菌等多種病原微生物具有廣譜的抑菌作用[3]。gCLA4菌株發酵濾液對獼猴桃潰瘍病菌抑菌效果明顯,抑菌圈直徑可達到25.5 mm[4],田間對潰瘍病的治療效果達64.9%,明顯優于化學藥劑施納寧。但是,gCLA4菌株對潰瘍病的田間預防效果、抑菌活性成分及其在田間防治獼猴桃潰瘍病的效果尚不明確。為此,本研究采用離體室內藥效測定及田間藥效試驗對該生防菌對獼猴桃潰瘍病的預防效果進行評價;同時以“生物活性追蹤”[5]為指導,采用離子交換樹脂吸附、凝膠柱層析等色譜手段對其拮抗Psa的成分進行分離純化,經ESI-MS/MS多級質譜及核磁共振波譜對其化學結構進行鑒定,以期明確鏈霉菌gCLA4發酵液對獼猴桃潰瘍病的預防效果及具有主要抑菌作用的化學成分,為進一步篩選獼猴桃細菌性潰瘍病的生物藥劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

供試菌株:淡紫灰鏈霉菌S.lavendulaegCLA4(gCLA4),獼猴桃潰瘍病菌Pseudomonassyringaepv.actinidiae(Psa)均由西北農林科技大學植物保護學院果樹病害病原生物學及綜合防治實驗室分離和保存。

供試培養基:gCLA4 發酵培養基(大豆粉15 g,蔗糖5 g,可溶性淀粉5 g,NaCl 5 g,K2HPO40.5 g,CaCO32 g,蒸餾水1 L),LB培養基(胰蛋白胨10 g,酵母浸粉5 g,NaCl 5 g,蒸餾水1 L,固體培養基加瓊脂粉18 g),高氏一號培養基(可溶性淀粉20 g,KNO30.1 g,K2HPO40.05 g, MgSO4·7H2O 0.05 g,瓊脂粉18 g)。

對照生防菌劑:解淀粉芽孢桿菌Ba168 WP(Bacillusamyloliquefaciens)(有效活菌數>100億/g),楊凌綠都生物科技有限公司;枯草芽孢桿菌WP(Bacillussubtilis)(有效活菌數>100 億/g),美國拜沃股份有限公司。

對照生物農藥:3%中生菌素WP,東莞市瑞德豐生物科技有限公司;中生菌素原藥,陜西麥可羅生物科技有限公司。

試劑:724型大孔弱酸性陽離子交換樹脂,CM-Sephadex-C25凝膠,Sephadex LH-20凝膠。

儀器:Finnegan LCQ Advantage MAX高效液相色譜—質譜聯用儀,配有ESI電離源和離子阱質量分析器(HPLC-ESI-MS/MS),美國熱電公司;Bruker RPX 500 MHz 核磁共振波譜儀。

1.2 方 法

1.2.1 gCLA4發酵液的制備 將gCLA4菌株在高氏一號培養基培養6 d后,用直徑為5 mm的打孔器制成菌餅,將菌餅接入裝有80 mL發酵培養基的250 mL錐形瓶中,28 ℃,150 r/min培養3 d制成種子液。將種子液按照5%的接種量(體積比)接入裝有95 mL發酵培養基的250 mL錐形瓶中,28 ℃,150 r/min培養7 d,即獲得發酵液。然后于4 ℃ 4 000 r/min離心5 min取上清液用于后續試驗。

1.2.2 離體枝條藥效試驗 設置5個處理。處理1:gCLA4發酵液稀釋10倍液;處理2:對照商品生防菌1“解淀粉芽孢桿菌Ba168 WP 50倍液”;處理3:對照商品生防菌2“枯草芽孢桿菌WP 50倍液”;處理4:商品生物農藥“3%中生菌素WP 100倍液”,處理5:清水對照。每個處理設置10個枝條,試驗重復3次。

枝條處理方法:選用‘紅陽’品種健康植株的1～2 a生枝條,剪成20 cm左右的小段,用自來水清洗后,用0.5%的次氯酸鈉水溶液進行表面消毒,用無菌水沖洗后晾干。用熔融的石蠟將晾干的枝條的兩端密封,用小刀橫向切破韌皮部形成傷口,備用。用藥劑先噴淋枝條,置16 ℃培養箱,黑暗放置24 h后接種,將培養好的15 μL菌液(OD600 nm=0.1)滴在枝條傷口處,放入盛有少量無菌水的托盤中,置于培養箱(16 ℃,黑暗培養),20 d后統計枝條上的病斑長度,按照下面公式計算預防效果,并進行差異顯著性分析。

預防效果=(對照組病斑平均長度-處理組病斑平均長度)/對照組病斑平均長度×100%

1.2.3 田間藥效試驗 藥劑處理同“1.2.2”。選取4個樹齡5～8 a生‘紅陽’獼猴桃園,在每個果園隨機劃分5個小區即5個處理,每個處理50株,4個重復,即每個處理調查200株。在秋季采果后至落葉前的關鍵時期,以每個處理對應的藥劑及濃度進行淋干2次,兩次施藥間隔為10 d,在春季枝干潰瘍高發期(3月-4月)統計各處理枝干潰瘍發病株樹占處理總株數的百分比,并以此為枝干潰瘍發病率即病株率,按照下式計算不同藥劑的田間預防效果。

預防效果=(對照組發病率-處理組發病率)/對照組發病率×100%

1.2.4 抑菌活性化學物質的分離與純化 用去離子水漂洗724弱酸型離子交換樹脂,將浮在水面上的樹脂去除;樹脂裝柱后用4～5倍柱體積的HCl溶液(1 mol/L)緩慢沖洗,并用去離子水沖洗至中性。將沖洗至中性的樹脂用4～5倍體積的NaOH溶液(1 mol/L)緩慢沖洗,然后再用去離子水沖洗至中性。

在發酵液中加入NaOH使其pH為8左右,之后將發酵液緩慢加入處理后的樹脂中動態吸附,調整流速為5 mL/min,實時檢測通過液的pH,當通過液為堿性時停止上樣,然后用去離子水沖洗樹脂柱至通過液為無色。用4倍柱體積質量分數為3%的HCl緩慢解析,每0.5個柱體積為1個餾分,按照解析順序標記8個餾分,標號 1～8,解析液用NaOH調至中性,將標號為1、3、5、7和8的餾分,采用濾紙片擴散法,以Psa為靶標進行生物活性測定。在直徑為6 mm的濾紙片上滴加5 μL待測餾分,將濾紙片晾干后放置在涂布好Psa的培養基中于28 ℃培養12 h,檢查抑菌圈直徑[6],獲得活性最好的餾分。

采用濕法上樣,梯度洗脫的方法進行C-25型凝膠柱層析。將離子交換柱解析液中活性最好的餾分濃縮之后上樣,上樣體積為柱體積的1/10,待樣品完全進入凝膠之后分別用0.1、0.4、0.7、1.0、1.3、1.6 mol/L的NaCl溶液進行洗脫,得到不同餾分。將各餾分濃縮后用LH-20凝膠等度洗脫脫鹽并進一步純化后進行生物活性測定。

1.2.5 抑菌活性化學物質的結構鑒定與抑菌活性測試 采用ESI-MS/MS多級質譜以及13C NMR對活性餾分進行結構鑒定。

采用濾紙片擴散法[6]測定活性物質的抑菌活性。在直徑為6 mm的濾紙片上滴加待測物,其中鏈霉菌gCLA4發酵液為離心后的上清液,活性物質濃度為1 mg/mL,中生菌素原藥按照有效成分配為1 mg/mL,以硫酸鏈霉素為陽性對照,蒸餾水為陰性對照。濾紙片載藥量為5 μL,將濾紙片晾干后放置在涂布好Psa的培養基中于 28 ℃培養12 h,采用十字交叉法測量抑菌圈直徑并進行記錄。

2 結果與分析

2.1 鏈霉菌gCLA4對獼猴桃潰瘍病的預防效果

離體枝條試驗結果表明,鏈霉菌gCLA4對獼猴桃潰瘍病的預防效果顯著。gCLA4發酵液稀釋10倍涂抹枝條,在施藥48 h后接種Psa的預防效果為83.43%,顯著優于解淀粉芽孢桿菌Ba168 WP 50倍液(對照生防菌劑A)的75.28%和枯草芽孢桿菌WP 50倍液(對照生防菌劑B)的70.20%;略低于3%中生菌素WP 100倍液(對照生物農藥)的84.43%,但鏈霉菌gCLA4發酵液的預防效果與3%中生菌素無顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1 鏈霉菌gCLA4對獼猴桃潰瘍病的預防效果

3月下旬對秋季施藥后獼猴桃潰瘍病發病情況調查結果表明,施用鏈霉菌gCLA4發酵液的10倍稀釋液對獼猴桃潰瘍病的預防效果為 71.07%,優于生防藥劑解淀粉芽孢桿菌Ba168 WP 50倍液(對照生防菌劑A)的61.64%和枯草芽孢桿菌WP 50倍液(對照生防菌劑B)的 68.24%;低于對照藥劑3%中生菌素WP 100倍液(生物農藥)的76.73%,田間預防效果顯著(表1)。

2.2 鏈霉菌gCLA4活性成分的分離與鑒定

2.2.1 724弱酸型離子交換樹脂解析液的各餾分活性測試 以Psa菌株為靶標,活性測定結果表明(表2和圖1),發酵液中的活性成分主要集中在餾分3和餾分5,其中餾分5的活性最強,其抑菌圈直徑可達20 mm?？梢?發酵液中的活性成分可以被724型離子交換樹脂吸附并解析,由此可以推測活性成分為水溶性弱堿性化合物。

A.陽離子交換柱解析液抑菌效果(餾分5);B.CK;C.凝膠柱解析液抑菌效果(NaCl為1 mol/L);D.CK

表2 離子交換樹脂解析液對Psa的抑制作用

2.2.2 凝膠柱層析的各餾分活性測試 將經過凝膠柱層析的各餾分以Psa菌株為靶標做生物活性測定結果表明(表3,圖1),在洗脫液中NaCl的濃度為0.7 mol/L時可以將活性成分少量洗脫,當洗脫液中NaCl的濃度為1 mol/L時可以將大部分活性成分洗脫。其中在洗脫液濃度為1 mol/L時,其對Psa的抑菌活性最強,抑菌圈直徑為26 mm。

表3 C-25型凝膠柱解析液各餾分對Psa的抑制作用

2.2.3 抑菌物質的結構鑒定 經多次層析后,發現“2.2.2”中活性最強的餾分(解析液中NaCl濃度為1 mol/L)為純化后的化合物。經ESI-MS/MS多級質譜分析得到[M+H]+m/z: 503.257 0,對其進行二級質譜分析,得到m/z:333.176 0、316.148 5、254.149 2、171.087 2等準分子離子(圖2-A)。將該餾份進行濃縮后凍干,用D2H溶解后進行13C NMR分析,碳譜數據為:13C NMR(126 MHz,D2O)δ171.95、169.80、162.56、157.76、78.68、73.42、69.92、66.40、60.79、60.22、54.31、49.18、48.85、48.25、38.93、36.17、28.98、22.85(圖2-B)。經數據比對,和文獻[7]報道一致,故鑒定該化合物為鏈絲菌素F,化學結構如圖3所示。

A.鏈絲菌素F的質譜圖;B.鏈絲菌素F的13C NMR 圖(125 MHz,D2O)

圖3 鏈絲菌素F的結構式

2.2.4 活性物質皿內抑菌活性測試 鏈霉菌gCLA4的活性物質鏈絲菌素F、菌株的發酵濾液及中生菌素藥劑的皿內抑菌試驗表明(圖4),三者的抑菌效果明顯。其中,鏈霉菌gCLA4發酵濾液的抑菌圈直徑達16.0 mm±0.1 mm,鏈絲菌素F及中生菌素原藥的抑菌效果更好,抑菌圈直徑分別為20.0 mm±0.2 mm和22.0 mm± 0.2 mm。

A.鏈絲菌素F;B.發酵液;C.中生菌素原藥;D.CK

3 討 論

生防菌對病原菌具有競爭抑制作用,誘導植物產生抗性,促進植物生長,調控微生態以及對病原菌的直接拮抗作用[8-9]。特別是植物內生菌作為新的微生物資源,無論是植物病害的生物防治方面還是篩選新型殺菌劑或藥物先導化合物應用于植物病害的化學防治方面,均具有廣闊的開發應用前景。然而,利用生防菌防治獼猴桃潰瘍病的報道較少,特別是植物內生菌對獼猴桃潰瘍病的防治研究更少。目前,王芳等[10]研究了鏈霉菌屬SY-L12菌株,發現菌株培養24 h對Psa的抑制效果為94.0%;燕金宜[11]研究了內生真菌J2對Psa的拮抗作用,發現其抑菌圈可達到15 mm,且具有較好的遺傳穩定性;王忠忠[12]研究表明芽孢桿菌YNP-1發酵液對Psa的抑菌圈直徑可達24 mm。上述研究均為實驗室皿內抑菌試驗,效果較好,尚缺乏獼猴桃潰瘍病田間防效評價。因此,亟需篩選獲得田間防效較好的生防菌株,為進一步開發生物藥劑奠定基礎。

鏈絲菌素(streptothricins)是最早發現的抗生素之一,為一類堿性的水溶性化合物,該類化合物有streptothricin A～F和X共7個組分,它們化學結構極其相似,包含一分子的D-古洛糖胺,一分子鏈里定內酰胺,以及不同數量的β-賴氨酸[13]。本試驗通過ESI-MS/MS多級質譜分析得到[M+H]+m/z:503.257 0,將該離子進行二級質譜分析,得到m/z:333.176 0、316.148 5、254.149 2、171.087 2等準分子離子,這些準分子離子是鏈絲菌素類化合物的特征性離子[14],進而通過13C NMR數據比對確定其主要的活性成分為鏈絲菌素F。據報道,鏈絲菌素F具有較好的抑菌活性,研究人員從秦嶺鏈霉菌中分離純化出鏈絲菌素類化合物,并篩選出鏈絲菌素D和F,兩者對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等抑菌活性最好[15],而對丁香假單胞桿菌特別是Psa的抑菌活性尚未見報道。此外,西北農林科技大學植物保護學院果樹病害病原生物學和綜合防治研究團隊實驗室前期對鏈霉菌gCLA4菌株的基因組進行測序和基因功能預測,發現其具有的NRPS型合成通路與鏈絲菌素的生物合成基因簇高度吻合[16],這也從分子生物學角度印證了鏈霉菌gCLA4的抑菌物質為鏈絲菌素類化合物。

以鏈絲菌素為主要有效成分的中生菌素是由中國農業科學院生物防治研究所從淡紫灰鏈霉菌海南變種Streptomyceslavendulaevar.hainanensis開發出了擁有自主知識產權的農用抗生素。它具有較強的水溶性,可以通過抑制病原細菌蛋白質肽鍵的合成、真菌的菌絲生長和孢子萌發,進而表現廣譜而良好的抑菌效果,可用于防治番茄青枯病、白菜軟腐病、甜瓜細菌性果斑病等細菌病害及草莓灰霉病、蘋果樹輪紋病等真菌病害[17]。鑒于鏈霉菌gCLA4對獼猴桃潰瘍病的預防效果顯著且抑菌物質為鏈絲菌素類化合物,本研究團隊快速尋找到中生菌素作為預防獼猴桃潰瘍病的候選生物藥劑。后續研究表明,3%的中生菌素可濕性粉劑800倍液噴施對獼猴桃潰瘍病的防效為69.0%,是化學藥劑噻菌銅防效的2倍[18]。進而,秦虎強等[1]開發了中生菌素田間施用技術,在明確 “花前花后”和“采果后至落葉前”關鍵施藥時期的基礎上,將中生菌素等抗生素類、芽孢桿菌類生防菌劑和銅制劑交替使用,對潰瘍病平均防效可達75%以上,既降低了化學農藥污染及抗藥菌株出現的風險,又保證了綠色果品安全,還改善了果園生態環境。

4 結 論

黃瓜內生淡紫灰鏈霉菌gCLA4菌株對獼猴桃潰瘍病的防控效果顯著且穩定,室內和田間的防效分別為83.43%和71.07%。采用離子交換樹脂和凝膠層析等手段對鏈霉菌gCLA4中的主要活性物質進行分離,經質譜和核磁共振波譜技術鑒定其結構為鏈絲菌素F。