高山桑黃揮發油超臨界CO2萃取工藝優化及其生物活性研究

魯 斌，陳勇杏，吳博宇，王 赟，申開澤，于富強，華 燕*

高山桑黃揮發油超臨界CO2萃取工藝優化及其生物活性研究

魯 斌1, 2，陳勇杏1，吳博宇1，王 赟3，申開澤1，于富強2*，華 燕1*

1. 西南林業大學林學院，西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室，云南 昆明 650224 2. 中國科學院昆明植物研究所，中國西南野生生物種質資源庫，云南省真菌多樣性與綠色發展重點實驗室，云南 昆明 650201 3. 西南林業大學生命科學學院，云南 昆明 650224

優化高山桑黃揮發油的提取工藝，對其化學成分進行分析，并評價其生物活性。采用單因素試驗和響應面法（RSM）優化超臨界CO2萃取高山桑黃揮發油的工藝條件；使用GC-MS、MTS和微量稀釋方法鑒定揮發油的化學成分，并評估其體外抗炎、抗腫瘤和抗菌活性。超臨界CO2萃取高山桑黃揮發油的最佳工藝條件為萃取溫度47 ℃、萃取壓力31 MPa、萃取時間1.5 h，在此條件下揮發油提取得率為（0.326±0.005）%。高山桑黃揮發油主要化學成分為四氯藜蘆醚、1,2,4,5-四氯-3,6-二甲氧基苯、1,2,3,4-四氯-5-甲氧基-6-硝基苯、亞油酸乙酯、二十五烷。揮發油表現出顯著的體外抗炎和抗腫瘤作用，但其抑菌活性不顯著。成功優化了高山桑黃揮發油的提取工藝，在最適條件下獲得了較高的得率；結合體外模型與生物活性評價，可為高山桑黃的藥物開發和資源利用提供價值參考。

高山桑黃；揮發油；響應面法；提取工藝；生物活性

廣義桑黃是銹革孔菌科（Hymenochaetaceae）下桑黃孔菌屬Sheng H. Wu, L. W. Zhou & Y. C. Dai、木層孔菌屬和纖孔菌屬屬下多個物種的統稱[1]，狹義桑黃是指(Sheng H. Wu, T. Hatt. & Y. C. Dai) Sheng H. Wu, L. W. Zhou & Y. C. Dai[2-3]，通常情況下桑黃指桑黃孔菌屬下的物種。桑黃又名桑耳、桑臣、桑黃菇、猢猻眼、桑上寄生、樹雞等，在中國已有兩千多年的藥用記載歷史，被譽為“森林黃金”[4]；其藥用功效最早見于《神農本草經》《本草綱目》和《藥性論》，常用于治療血崩、血淋、脫肛泄血、帶下、閉經、脾虛泄瀉、癥瘕積聚、癖飲等疾病[5]。

目前，已從桑黃中分離得到多種類型的化合物，包括甾體類、萜類、黃酮類、多糖類、多酚類、生物堿類、脂肪酸類、香豆素類等多種有效成分[6-10]。多年來，國內外學者對桑黃的藥理作用進行了深入的研究，明確桑黃具有廣泛的藥理作用，主要表現在抗腫瘤、免疫調節、肝臟保護和抗肝纖維化、自由基清除和抗脂質過氧化、抑菌、消炎、降血糖等活性方面[11-20]；因其顯著的抗腫瘤效果，被認為是目前生物抗癌領域中藥理活性最高的藥用真菌[21-22]。近年來，中藥揮發油成分及其生物活性受到廣泛關注，然而大型藥用真菌在此方面的相關研究卻較少，僅在靈芝(Curtis) P. Karst.、銀耳Berk.、香栓菌(L.) Fr.等部分真菌開展了揮發油的化學成分以及抗菌、抗氧化、細胞毒活性等藥理活性方面的研究工作[23-26]。

揮發油作為一種揮發性的芳香物質被廣泛應用，常用的提取方法主要有水蒸氣蒸餾法、有機溶劑萃取法、壓榨法、超聲波輔助萃取、分子蒸餾法、超臨界流體萃取法和亞臨界流體萃取等[27]。超臨界CO2流體萃取技術是利用CO2在高壓下處于超臨界狀態而萃取分離各種有機物的一種先進技術，近年來廣泛應用于揮發油物質的分離應用方面以及醫藥、食品、化妝品等領域[28]。超臨界流體萃取法相比于其他方法具有提取率高和保護有效成分等明顯優勢[29-30]，且采用CO2為萃取溶劑，具有無毒無污染、廉價及來源豐富等特點[31]，適用于天然藥物的萃取分離。本實驗以桑黃孔菌屬中的高山桑黃(Y. C. Dai & X. M. Tian) L. W. Zhou & Y. C. Dai（在真菌分類學研究上，經桑黃孔菌屬系統發育分析，確定高山桑黃隸屬于桑黃孔菌屬中的一種）子實體為原料，采用Box-Behnken設計-響應面法（Box Behnken design- response surface methodology，BBD-RSM）對其揮發油進行提取工藝優化、化學成分分析及相關生物活性探討，以期為桑黃資源的進一步開發利用提供數據參考和理論基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器設備

Speed SFE型超臨界萃取儀，美國ASI公司；7890B-5977B型氣相色譜-質譜聯用儀，美國Agilent公司；Sartorius BAS2245型萬分之一電子天平，德國賽多利斯公司；SPX-100B-Z型生化培養箱，上海博遠實業有限公司醫療設備廠；YB-200型高速多功能粉碎機，上海力箭機械有限公司；美國Thermo Scientific Multiskan FC多功能酶標儀，賽默飛世爾（上海）儀器有限公司。

1.2 材料

高山桑黃(Y. C. Dai & X. M. Tian) L. W. Zhou & Y. C. Dai子實體購于昆明市官渡區福盛堂中藥材經營部，由中國科學院昆明植物研究所劉建偉鑒定，ITS序列上傳至GenBank數據庫（ITS OP881498和LSU OP881500），樣品保存于西南林業大學林學院非木質資源培育與利用教研室。經自然晾干、粉碎過60目篩備用。

人類腫瘤細胞系：白血病HL-60細胞、肺癌A549細胞、肝癌SMMC-7721細胞、乳腺癌MDA-MB-231細胞、結腸癌SW480細胞，均購自美國ATCC細胞庫。菌種：大腸埃希氏菌（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌金黃亞種subsp.（ATCC29213）、腸沙門氏菌腸亞種subsp.（ATCC14028）、銅綠假單胞菌（ATCC27853），購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.3 試劑

小鼠單核巨噬細胞RAW264.7，中國科學院上海細胞庫；DMEM培養基和胎牛血清，BI公司；Griess Reagent、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）及對照藥物-NMMA［總一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，NOS）抑制劑，即G- monomethyl--arginine, monoacetate salt，也稱ω- Me--Arg，或NG-Me--Arg, AcOH，是NOS廣普性抑制劑］、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），美國Sigma公司；頭孢他啶，上海源葉生物科技有限公司；青霉素G鈉，Biosharp公司；MH肉湯、LB肉湯，廣東環凱微生物科技有限公司；瓊脂粉，Scientific Research Special公司；正己烷，分析純，廣東光華科技股份有限公司；二氯甲烷，分析純，天津市致遠化學試劑有限公司；無水硫酸鈉，分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司。

2 方法與結果

2.1 高山桑黃揮發油超臨界CO2萃取工藝

將粉碎的高山桑黃干燥粉末過60目藥篩后裝入萃取釜，通入CO2，設定萃取釜溫度，當溫度達到設定值后開始增壓至設定壓力，計時靜態萃取，然后調節CO2流量進行連續動態萃取，用裝有溶劑的樣品瓶收集得到有特殊香味的黃色油狀物。稱定質量后通過公式計算揮發油得率。

揮發油得率＝萃取揮發油量/原料質量

2.2 單因素試驗優化高山桑黃揮發油的提取條件

通常情況下，萃取所用壓力、溫度和時間等因素會影響揮發油的得率，因此，在本試驗中選擇萃取溫度、萃取壓力、萃取時間為單因素試驗條件。

2.2.1 萃取溫度對高山桑黃揮發油提取的影響 固定稱取30 g樣品干燥粉末（已過60目篩）裝入超臨界CO2萃取儀萃取釜內，在萃取壓力為30 MPa，靜態萃取0.5 h后，在CO2流量10 L/h條件下連續動態萃取1.5 h，用二氯甲烷富集得到有特殊香味的黃色油狀物并使用無水硫酸鈉干燥處理，考察不同萃取溫度（35、40、45、50、55 ℃）對揮發油得率的影響。在萃取壓力為30 MPa，靜態萃取0.5 h后，設定CO2流量10 L/h，連續動態萃取1.5 h的條件下，不同萃取溫度提取揮發油的得率見表1。結果表明，在45 ℃下萃取揮發油的得率最大，且揮發油得率在一定溫度條件下隨溫度的升高而增加，因為在超臨界萃取中，升高溫度有助于分子間的相互作用，增加分子擴散系數，提高萃取效率；但溫度升高到一定程度得率反而出現下降趨勢，這可能是由于溫度過高時，分子間密度降低不利于傳質作用，不利于組分的溶出導致揮發油得率降低[29]。

表1 萃取溫度對高山桑黃揮發油得率的影響(, n = 3)

2.2.2 萃取壓力對高山桑黃揮發油提取的影響 固定稱取30 g樣品干燥粉末（過60目篩）裝入超臨界CO2萃取儀萃取釜內，在萃取溫度45 ℃，靜態萃取0.5 h后在CO2流量10 L/h條件下連續動態萃取1.5 h，用二氯甲烷富集得到有特殊香味的黃色油狀物并使用無水硫酸鈉干燥處理，考察不同萃取壓力（20、25、30、35、40 MPa）對揮發油得率的影響。在萃取溫度40 ℃，靜態萃取0.5 h后在CO2流量10 L/h條件下連續動態萃取1.5 h，不同萃取壓力對揮發油得率的影響見表2。可見，在一定范圍內隨著萃取壓力的增大揮發油的得率有明顯增大，當超過最適壓力后，萃取效率變低。在超臨界CO2萃取過程中，當溫度一定時，壓力越大，超臨界流體的密度越大，溶解能力也越大；但壓力超過一定變化量時，傳質效率降低，溶解度也受影響，易產生溝流現象使樣品物料結塊，不利于組分的溶出，從而導致揮發油得率降低[28]。

表2 萃取壓力對高山桑黃揮發油得率的影響(, n = 3)

2.2.3 萃取時間對高山桑黃揮發油提取的影響 固定稱取30 g樣品干燥粉末（過60目篩）裝入超臨界CO2萃取儀萃取釜內，在萃取壓力為30 MPa，靜態萃取0.5 h后在CO2流量10 L/h條件下連續動態萃取，用二氯甲烷富集得到有特殊香味的黃色油狀物并使用無水硫酸鈉干燥處理，考察不同萃取時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）對揮發油得率的影響。在萃取壓力為25 MPa下，靜態萃取0.5 h后設定CO2流量為10 L/h連續動態萃取，萃取溫度40 ℃，獲得不同萃取時間下揮發油的得率見表3。隨著時間的增加，使物料與CO2得到充分接觸，揮發油的萃取效率也隨之增加，當達到1.5 h時，萃取過程達到最后的萃取階段，物料中的大部分精油幾乎完全被萃取出，獲得最大得率；再往后延長萃取時間，得率出現降低的現象，這說明延長時間對萃取效率幾乎無影響，反而導致一些極易揮發的物質隨CO2氣流擴散到環境中，使揮發油萃取得率降低，同時也增加了時間成本和CO2的消耗量[32]。

表3 萃取時間對高山桑黃揮發油得率的影響(, n = 3)

2.3 BBD-RSM優化揮發油的提取工藝

2.3.1 BBD-RSM結果分析 在單因素試驗的基礎上，根據Design Expert 13軟件中的BBD-RSM試驗設計原理，以萃取溫度（1）、萃取壓力（2）、萃取時間（3）為影響因素，以高山桑黃揮發油的得率（）為響應值，進行3因素3水平組合設計優化并確定超臨界CO2萃取法提取揮發油的最佳工藝條件。BBD-RSM試驗設計因素水平及結果見表4。

通過響應面軟件對表4中的數據進行多元二次回歸分析，得到揮發油萃取得率的回歸方程為＝0.331 2＋0.009 81＋0.008 62－0.003 43＋0.008 512＋0.005 013＋0.001 723－0.019 512－0.020 222－0.019 232。

表4 BBD-RSM試驗設計及結果

Table 4 Response surface experiment design and results

試驗號X1/℃X2/MPaX3/hY/% 150 (+1)30 (0)2.0 (+1)0.303±0.004 250 (+1)25 (?1)1.5 (0)0.284±0.001 340 (?1)35 (+1)1.5 (0)0.282±0.002 445 (0)30 (0)1.5 (0)0.332±0.004 545 (0)35 (+1)2.0 (+1)0.296±0.004 645 (0)35 (+1)1.0 (?1)0.301±0.003 745 (0)30 (0)1.5 (0)0.335±0.001 850 (+1)30 (0)1.0 (?1)0.298±0.002 945 (0)25 (?1)1.0 (?1)0.291±0.001 1040 (?1)25 (?1)1.5 (0)0.278±0.001 1140 (?1)30 (0)2.0 (+1)0.277±0.003 1245 (0)30 (0)1.5 (0)0.330±0.004 1345 (0)30 (0)1.5 (0)0.328±0.002 1445 (0)30 (0)1.5 (0)0.331±0.003 1545 (0)25 (?1)2.0 (+1)0.279±0.002 1650 (+1)35 (+1)1.5 (0)0.322±0.002 1740 (?1)30 (0)1.0 (?1)0.292±0.003

2.3.2 響應面回歸方程方差分析與試驗驗證 根據表5方差分析可知，模型中值＜0.01且失擬項不顯著＝0.163 5＞0.05，說明模型擬合良好且顯著，方法可靠二次模型選擇合適。模型中2＝0.988 4，2adj＝0.973 5，表明回歸方程適合對本實驗中揮發油得率的分析和預測。其中單因素1、2之間對揮發油得率的影響有極顯著差異（＜0.01），而單因素3對揮發油得率的影響差異顯著（＜0.05），在萃取溫度與萃取壓力交互項（12）中對揮發油得率的相互作用影響有極顯著差異（＜0.01），萃取溫度與萃取時間交互項（13）對揮發油得率的相互作用影響具有顯著性（＜0.05）。在各單因素水平范圍內，根據值判斷出各因素間對結果的影響程度大小為1（萃取溫度）＞2（萃取壓力）＞3（萃取時間）。

表5 響應面回歸方差分析

Table 5 Response surface statistical results of regression variance analysis

方差來源平方和自由度均方F值P值顯著性方差來源平方和自由度均方F值P值顯著性 模型7.30×10?398.11×10?466.34＜0.000 1極顯著X121.60×10?311.60×10?3130.67＜0.000 1極顯著 X18.00×10?418.00×10?462.23＜0.000 1極顯著X221.70×10?311.70×10?3140.93＜0.000 1極顯著 X26.00×10?416.00×10?448.702.00×10?4極顯著X321.60×10?311.60×10?3127.33＜0.000 1極顯著 X31.00×10?411.00×10?47.460.029 3顯著殘差1.00×10?471.43×10?5 X1X23.00×10?413.00×10?423.651.80×10?3極顯著失擬項1.00×10?433.33×10?52.920.163 5 X1X31.00×10?411.00×10?48.180.024 3顯著誤差2.68×10?546.70×10?6 X2X31.22×10?511.22×10?51.000.350 1 合計7.40×10?316

綜上所述，由響應面回歸方差分析及二元回歸方程繪制各因素之間交互影響的等高線圖和相互作用的曲面圖，如圖1所示。通過響應面模型擬合方程分析得到優化后的最佳工藝參數條件為萃取溫度46.53 ℃，萃取壓力31.37 MPa，萃取時間1.48 h，揮發油得率的預測值為0.334%。結合實際情況進行參數調整后得到最優工藝條件為萃取溫度47 ℃，萃取壓力31 MPa，萃取時間1.5 h。在此工藝參數下，試驗平行3次進行驗證，揮發油得率分別為0.322%、0.326%、0.331%，計算高山桑黃揮發油的最終平均提取得率為（0.326±0.005）%，與模型理論值基本一致，說明此實驗模型可以很好反映出各相互作用因素與揮發油得率之間的影響關系，對工藝條件優化具有指導作用。

圖1 各因素間的交互作用對高山桑黃揮發油得率的影響

2.4 高山桑黃揮發油GC-MS分析

將萃取得到的揮發油溶于正己烷進行無水硫酸鈉干燥處理后，過0.45 μm膜，備用。

GC條件：HP-5 MS毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣為高純氦氣；恒定流量1.0 mL/min；采用程序升溫，初始溫度50 ℃，保持1 min，以速率10 ℃/min升至160 ℃，保持5 min，以3 ℃/min的速率升至200 ℃，保持5 min；再以10 ℃/min的速率升至250 ℃，保持2 min。進樣口溫度250 ℃；進樣量1 μL；分流比25∶1。

MS條件：EI離子源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；接口溫度250 ℃；四級桿溫度150 ℃；溶劑延遲4 min；全掃描質量范圍/30～550。

通過檢索NIST 14.L化學工作站標準質譜圖庫鑒定分析總離子流圖內各峰的質譜圖結果（圖2），采用峰面積歸一化法確定組分的相對含量。

對采用CO2超臨界萃取法提取得到的揮發油進行分析，通過色譜圖解卷積方式進行譜庫檢索鑒定其化學成分及相對含量，結果見表6。根據結果顯示，使用CO2超臨界萃取法得到的揮發油化學成分較多，共鑒定了37種化合物，這些組分包括酮類、醛類、酯類、烷烴類、烯烴類以及其他類等，其中相對質量分數較高的主要化學成分為四氯藜蘆醚（19.97%）、1,2,3,4-四氯-5-甲氧基-6-硝基苯（14.24%）、二十五烷（9.97%）、亞油酸乙酯（8.38%）、1,2,4,5-四氯-3,6-二甲氧基苯（6.76%）、2(3)-呋喃酮二氫-5,5-二甲基-4-(3-氧代丁基)（5.98%）、十二烷（4.78%）、2,4-癸二烯醛（3.92%）、花側柏烯（2.67%）、十三烷（2.57%）、(+)-γ-古蕓烯（2.29%）、α-布藜烯（2.28%）、十七烷（2.08%）、十六烷（1.67%）、馬芐烯酮（1.42%）、5-羥基-2,4-二叔丁基苯基戊酸酯（1.21%）。

圖2 高山桑黃揮發油GC-MS分析總離子流圖

表6 高山桑黃揮發油成分分析

Table 6 Components analysis of volatile oil from S. alpinus

峰號化合物名稱分子式CAS號相對含量/% 11,3-二氯-2-丙醇（1,3-dichloro-2-propanol）C3H6Cl2O96-23-10.44 23-羥基-2-丁酮（acetoin）C4H8O2513-86-00.05 33,3-二甲基已烷（3,3-dimethyl-hexane）C8H18563-16-60.11 4十一烷（undecane）C11H241120-21-40.92 5壬醛（nonanal）C9H18O124-19-60.36 6(?)-4-萜品醇［(R)-4-methyl-1-(1-methylethyl)-3-cyclohexen-1-ol］C10H18O20126-76-50.93 72-(4-甲基苯基)丙-2-醇（α,α,4-trimethyl-benzenemethanol）C10H14O1197-01-90.42 8(S)-(+)-5-甲基-1-己醇［(S)-(+)-5-methyl-1-heptanol］C8H18O57803-73-30.13 9十二烷（dodecane）C12H26112-40-34.78 10馬芐烯酮（4,6,6-trimethyl-bicyclo[3.1.1]hept-3-en-2-one）C10H14O80-57-91.42 111-庚烯-3-酮（1-hepten-3-one）C7H12O2918-13-00.12 122,4-癸二烯醛［(E,Z)-2,4-decadienal］C10H16O25152-83-43.92 13十三烷（tridecane）C13H28629-50-52.57 144,5-二甲基壬烷（4,5-dimethyl-nonane）C11H2417302-23-70.26 15鯨蠟烯（cetene）C16H32629-73-20.60 162,7-二甲基十一烷（2,7-dimethyl-undecane）C13H2817301-24-50.54 17香葉基丙酮［(E)-6,10-dimethyl-5,9-undecadien-2-one］C13H22O3796-70-10.92 183,5-二甲基十一烷（3,5-dimethyl-undecane）C13H2817312-81-10.72 196-乙基-2-甲基癸烷（6-ethyl-2-methyl-decane）C13H2862108-21-80.66 20α-布藜烯{[1S-(1α,7α,8aβ)]-1,2,3,5,6,7,8,8a-octahydro-1,4-dimethyl-7-(1-methylethenyl)-azulene}C15H243691-11-02.28 21(+)-γ-古蕓烯{[1R-(1α,3aβ,4α,7β)]-1,2,3,3a,4,5,6,7-octahydro-1,4-dimethyl-7-(1-methylethenyl)-azulene}C15H2422567-17-52.29 225-羥基-2,4-二叔丁基苯基戊酸酯（5-hydroxy-pentanoic acid, 2,4-di-t-butylphenylesters）C19H30O3166273-38-71.21 23花側柏烯［(R)-1-methyl-4-(1,2,2-trimethylcyclopentyl)-benzene］C15H2216982-00-62.67 242(3H)-呋喃酮二氫-5,5-二甲基-4-(3-氧代丁基)［dihydro-5,5-dimethyl-4-(3-oxobutyl)-2(3H)-furanone］C10H16O34436-81-15.98 25十六烷（hexadecane）C16H34544-76-31.67 26(1-乙基丙基)環己烷［(1-ethylpropyl)-cyclohexane］C11H2226321-98-20.63 27十七烷（heptadecane）C17H36629-78-72.08 28四氯藜蘆醚（1,2,3,4-tetrachloro-5,6-dimethoxy-benzene）C8H6Cl4O2944-61-619.97 291,2,4,5-四氯-3,6-二甲氧基苯（1,2,4,5-tetrachloro-3,6-dimethoxy-benzene）C8H6Cl4O2944-78-56.76 30四氫糠醇丙酸酯（n-butyric acid tetrahydrofurfuryl ester）C8H14O3637-65-00.31 311,2,3,4-四氯-5-甲氧基-6-硝基苯（1,2,3,4-tetrachloro-5-methoxy-6-nitro-benzene）C7H3Cl4NO369576-80-314.24 32大根香葉烷［1,7-dimethyl-4-(1-methylethyl)cyclodecane］C15H30645-10-30.73 333,3-二甲基已烷（3,3-dimethyl-hexane）C8H18563-16-60.75 341,3-苯二酚單苯甲酸酯（1,3-benzenediol,monobenzoate）C13H10O3136-36-70.15 35丙烯醛（2-propenal）C3H4O107-02-80.07 36亞油酸乙酯（linoleic acid ethyl ester）C20H36O2544-35-48.38 37二十五烷（pentacosane）C25H52629-99-29.97

2.5 生物活性

2.5.1 揮發油對RAW264.7細胞NO釋放水平的影響 將RAW264.7細胞接種至96孔板，用1 μg/mL LPS進行誘導刺激，同時加入待測樣品（終質量濃度50 μg/mL）處理初篩，確定初篩結果活性良好后再以終質量濃度為50 μg/mL進行2倍系列質量濃度稀釋復篩，設置對照（不含藥物）組和陽性對照（-NMMA）組。細胞過夜培養后，吸取培養基通過Griess法檢測NO生成，在570 nm處測定吸光度（）值。在剩余培養基中加入MTS進行細胞存活率檢測，排除樣品對細胞的毒性影響。

NO生成抑制率＝(對照組570－樣品或陽性對照組570)/對照組570

取對數生長期的RAW 264.7細胞，采用Griess法測定細胞培養上清液中NO的濃度，并計算待測樣品抑制RAW264.7細胞釋放NO的半數抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）。通過待測樣品的活性初篩結果，進一步設置系列質量濃度梯度，以待測樣品終質量濃度為50 μg/mL按照2倍稀釋關系進行活性復篩并最終計算IC50。根據表7結果顯示，以陽性對照藥物-NMMA作為參考，揮發油能夠很好地抑制LPS誘導RAW264.7細胞釋放NO，具有較高的抑制活性，說明該揮發油提取物在炎癥治療方面具有一定療效。

2.5.2 揮發油的細胞毒活性評價 使用MTS法測定揮發油的細胞毒活性。接種細胞：用含10%胎牛血清的培養液（DMEM或者RMPI 1640）配成單個細胞懸液，以每孔3000～15 000個細胞接種到96孔板，每孔體積100 μL，細胞提前12～24 h接種培養。加入待測樣品溶液：供試樣品用DMSO溶解，以100 μg/mL質量濃度進行初篩，在初篩結果有活性前提下以100、20、4、0.8、0.16 μg/mL質量濃度復篩，每孔終體積200 μL，每種處理均設3個復孔。顯色：在37 ℃條件下培養48 h后，貼壁細胞棄孔內培養液，每孔加MTS溶液20 μL和培養液100 μL；設3個空白復孔（MTS溶液20 μL和培養液100 μL的混合液），繼續孵育2～4 h，使反應充分進行后測定值。比色：選擇492 nm波長，多功能酶標儀讀取各孔值，記錄結果。

表7 高山桑黃揮發油對LPS誘導RAW 264.7巨噬細胞釋放NO的影響(, n = 3)

細胞抑制率＝(對照－樣品)/(對照－空白)

對照為含有MTS溶液、培養液、細胞的值，樣品為含有MTS溶液、培養液、細胞和藥物（揮發油/順鉑/紫杉醇）的值，空白為含有MTS溶液、培養液的值

每次實驗均設順鉑（DDP）和紫杉醇（Taxol）2個陽性化合物，以質量濃度為橫坐標，細胞存活率為縱坐標繪制細胞生長曲線，應用兩點法（Reed and Muench法）計算化合物的IC50值。

lgIC50＝高于或等于50%細胞存活率的稀釋度的對數＋距離比例×稀釋系數的對數

距離比例＝(高于或等于50%細胞存活率的百分數－50%)/(高于或等于50%細胞存活率的百分數－低于50%細胞存活率的百分數)

根據MTS原理方法考察揮發油對5株腫瘤細胞（白血病HL-60、肺癌A549、肝癌SMMC-7721、乳腺癌MDA-MB-231、結腸癌SW480）的抑制活性，在揮發油樣品質量濃度為100 μg/mL時初篩對體外腫瘤細胞生長有抑制活性，進一步設置系列質量濃度復篩的測定結果見表8，表明揮發油對5株體外腫瘤細胞生長均有較高的抑制活性。

2.5.3 揮發油抑菌活性的測定 將待測樣品用DMSO溶解并加入96孔培養板，以128 μg/mL質量濃度進行初篩，向各孔加入菌液（5×105cfu/mL）；在37 ℃條件下培養24 h，使用酶標儀測定625 nm波長下的值。實驗同時設置培養基空白對照、細菌對照以及頭孢他啶、青霉素G鈉陽性藥物對照。

本實驗選取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌金黃亞種、腸沙門氏菌腸亞種、銅綠假單胞菌4株細菌進行揮發油的體外抗細菌活性篩選。其抑制作用篩選結果見表9，結果顯示，當質量濃度為128 μg/mL時，揮發油對4株細菌均無明顯抑制作用。

3 結論

炎癥是許多疾病發生的必經過程，不僅誘導腫瘤的發生，而且促進腫瘤的轉移擴散，腫瘤是目前威脅人類健康的重大疾病，也是全球主要的公共健康問題[33]。當機體受到感染刺激時體內巨噬細胞會產生大量的炎癥因子[34]，其中NO是一種十分重要的炎癥因子，在炎癥發生過程中，具有調節內皮細胞、平滑肌細胞，參與組織炎癥的重要作用[33]。抗炎活性研究中測試方法較多，表征抗炎作用的主要方法之一是通過藥物或藥材對LPS誘導炎癥評價其抑制效果。

表8 高山桑黃揮發油對5種癌細胞的IC50

Table 8 IC50 of S. alpinus volatile oil on five types of cancer cells

組別IC50/(μg?mL?1) HL-60A549SMMC-7721MDA-MB-231SW480 揮發油30.22±2.2726.60±1.7719.90±1.8440.25±0.9344.55±0.81 順鉑13.32±0.1915.87±0.266.59±0.1815.77±0.4524.26±1.11 紫杉醇＜0.008＜0.0080.12±0.01＜0.008＜0.008

表9 高山桑黃揮發油抑菌結果

Table 9 Antibacterial results of volatile oil of S. alpinus

分組質量濃度/(μg?mL?1)抑制率/% 大腸埃希菌金黃色葡萄球菌腸沙門氏菌銅綠假單胞菌 青霉素G鈉5 97.72±0.00 10 99.19±0.11 頭孢他啶2100.16±0.08 99.43±0.16 揮發油12810.38±2.98?63.10±0.36?10.67±1.5415.93±0.79

近年來，國內外學者發現不少天然藥物不僅來源廣泛，還具有毒副作用小的優點，深受青睞。MTS法是一種簡便、快速測定抗癌藥物敏感性的方法，常用于抗癌活性藥物研究的篩選工作中[35]。超臨界流體CO2萃取技術近年來發展迅猛，廣泛應用在萃取中藥材有效成分研究領域。此萃取技術效率高、速度快，溶劑無毒無害，活性成分不易破壞，相對水蒸氣蒸餾法來說優勢明顯，對中藥有效成分提取的衛生及品質符合國家要求，也更有利于中藥現代化產業的發展及人類對環境的保護。

本研究利用超臨界流體CO2萃取技術，對高山桑黃揮發油的萃取工藝進行優化，在此基礎上通過GC-MS分析測定其揮發油的主要成分和含量，并評價了其對炎癥因子NO釋放的影響以及體外細胞毒活性。在單因素試驗基礎上，通過響應面法優化設計，發現超臨界流體CO2的萃取溫度和壓力等因素對揮發油的得率有極顯著影響（＜0.01），而萃取時間對揮發油得率影響顯著（＜0.05）。最終經模型優化獲得超臨界流體CO2萃取揮發油的最佳工藝條件為萃取溫度47 ℃，萃取壓力31 MPa，萃取時間1.5 h，以此參數條件進行試驗驗證，實際測得揮發油的平均得率為（0.326±0.005）%，與二元回歸模型分析所得的揮發油提取得率預測值基本一致，說明此模型可靠。

利用GC-MS對提取得到的高山桑黃揮發油進行成分分析，共鑒定出37種化合物，其中相對質量分數較高的化學成分主要包括四氯藜蘆醚（19.97%）、1,2,3,4-四氯-5-甲氧基-6-硝基苯（14.24%）、二十五烷（9.97%）、亞油酸乙酯（8.38%）、1,2,4,5-四氯-3,6-二甲氧基苯（6.76%）、2(3)-呋喃酮二氫-5,5-二甲基-4-(3-氧代丁基)（5.98%）、十二烷（4.78%）、2,4-癸二烯醛（3.92%）、花側柏烯（2.67%）、十三烷（2.57%）、(+)-γ-古蕓烯（2.29%）、α-布藜烯（2.28%）、十七烷（2.08%）、十六烷（1.67%）、馬芐烯酮（1.42%）、5-羥基-2,4-二叔丁基苯基戊酸酯（1.21%）等。在實驗開展初期查閱大量資料對比發現，水蒸氣蒸餾法，溫度過高容易造成物質結構破壞，產生更多的裂解產物；但超臨界流體CO2萃取法與其相比，可以有效避免對成分的破壞，更好保護活性成分的結構和功能，且萃取溶劑CO2具有無毒、廉價等特點，因此選擇超臨界流體CO2萃取法作為本項研究工作的技術方法。

本實驗采用MTS法，對超臨界流體CO2萃取法得到的高山桑黃揮發油提取物進行體外抗炎和抗腫瘤活性評價，均表現出顯著的抑制效果。然而，當揮發油提取物質量濃度為128 μg/mL時進行體外抗菌活性初篩，發現其對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、腸沙門氏菌、銅綠假單胞菌均無明顯的抑制作用。

綜上，結合本實驗分析測試的物質基礎，在實際應用中，由于該技術提取的化學成分除揮發油外，還可能含有大量的脂溶性成分，推測其體外抗炎和抗腫瘤活性顯著的原因是揮發油成分以及其他脂溶性成分之間存在協同作用，從而發揮出更好的抑制活性。同時，揮發油的體外抗菌活性也與其特定的化學組成和含量有關[36-39]，根據實驗初篩結果不顯著推測原因可能是與提取物成分種類之間的拮抗作用致使抑菌活性降低或不明顯有關，還有可能是因為細菌的細胞壁阻止了抗菌活性成分的進入。本研究為高山桑黃揮發油超臨界CO2萃取工藝優化及其生物活性的研究，提供了初步的理論依據，其機制仍有待進一步的研究考證，可為其資源開發利用提供指導。

志謝：何新華教授、張鳳明博士對文章修改提出建議，西南林業大學林學院林產品分析檢測中心提供實驗平臺、中國科學院昆明植物研究所活性篩選平臺對活性測試提供幫助。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 吳聲華, 戴玉成. 藥用真菌桑黃的種類解析 [J]. 菌物學報, 2020, 39(5): 781-794.

[2] Wu S H, Dai Y C, Hattori T,. Species clarification for the medicinally valuable ‘sanghuang’ mushroom [J]., 2012, 53(1): 135-149.

[3] Zhou L W, Vlasák J, Decock C,. Global diversity and taxonomy of thecomplex (Hymenochaetales, Basidiomycota):gen. nov.,andgen. et spp. nov., and 17 new combinations [J], 2016, 77(1): 335-347.

[4] 呂英華, 王建芳, 李玉平, 等. 藥用真菌桑黃的研究進展 [J]. 蠶業科學, 2009, 35(1): 204-210.

[5] 孫培龍, 徐雙陽, 楊開, 等. 珍稀藥用真菌桑黃的國內外研究進展 [J]. 微生物學通報, 2006, 33(2): 119-123.

[6] 莫順燕, 楊永春, 石建功. 桑黃化學成分研究 [J]. 中國中藥雜志, 2003, 28(4): 339-341.

[7] Kang H S, Choi J H, Cho W K,. A sphingolipid and tyrosinase inhibitors from the fruiting body of[J]., 2004, 27(7): 742-750.

[8] Lee Y S, Kang Y H, Jung J Y,. Inhibitory constituents of aldose reductase in the fruiting body of[J]., 2008, 31(4): 765-768.

[9] Wu X L, Lin S, Zhu C G,.- and heptanor- sterols and tremulane sesquiterpenes from cultures of[J]., 2010, 73(7): 1294- 1300.

[10] Yin R H, Zhao Z Z, Chen H P,. Tremulane sesquiterpenes from cultures of the fungusand their vascular-relaxing activities [J]., 2014, 10: 300-303.

[11] Kim G Y, Park H S, Nam B H,. Purification and characterization of acidic proteo-heteroglycan from the fruiting body of(Berk. & M. A. Curtis) Teng [J]., 2003, 89(1): 81-87.

[12] Kim B C, Choi J W, Hong H Y,. Heme oxygenase-1 mediates the anti-inflammatory effect of mushroomin LPS-stimulated RAW264.7 macrophages [J]., 2006, 106(3): 364-371.

[13] Lee Y S, Kim Y H, Shin E K,. Anti-angiogenic activity of methanol extract ofand its fractions [J]., 2010, 131(1): 56-62.

[14] Huang H Y, Chieh S Y, Tso T K,. Orally administered mycelial culture ofexhibits antitumor effects in hepatoma cell-bearing mice [J]., 2011, 133(2): 460-466.

[15] 昝立峰, 包海鷹, 李丹花. “桑黃”類真菌中多酚物質及其生物活性研究進展 [J]. 天然產物研究與開發, 2016, 28(1): 147-155.

[16] 朱琳, 崔寶凱. 藥用真菌桑黃的研究進展 [J]. 菌物研究, 2016, 14(4): 201-209.

[17] Shan L, Liu Z N, Ci L L,. Research progress on the anti-hepatic fibrosis action and mechanism of natural products [J]., 2019, 75: 105765.

[18] Wu M D, Cheng M J, Chen Y L,. Secondary metabolites from the fermented whole broth of fungal strain[J]., 2019, 55(1): 36-40.

[19] Wang X T, Sun T T, Sun J,. Molecular cloning, characterisation, and heterologous expression of farnesyl diphosphate synthase from[J]., 2020, 62(2): 132-141.

[20] 石河, 梅景晨, 李榮雪, 等. 桑黃多糖的提取分離及藥理作用研究進展 [J]. 藥物評價研究, 2023, 46(6): 1360-1368.

[21] Ikekawa T, Nakanishi M, Uehara N,. Antitumor action of some Basidiomycetes, especially[J]., 1968, 59(2): 155-157.

[22] 曾鵬, 黃世榮, 劉明明, 等. 應用響應面法優化超聲波輔助熱水提取桑黃多糖的工藝條件 [J]. 蠶業科學, 2015, 41(5): 928-933.

[23] Al-Fatimi M, Wurster M, Lindequist U. Chemical composition, antimicrobial and antioxidant activities of the volatile oil ofBres [J]., 2016, 3(2): 10.

[24] Ohiri R C, Bassey E E. Gas chromatography-mass spectrometry analysis of constituent oil from Lingzhi or Reishi medicinal mushroom,(Agaricomycetes), from[J]., 2016, 18(4): 365-369.

[25] Liu W, Tang Q T, Wei Y T,. Chemical compounds and antioxidant activity of volatile oil from the white jelly mushroom,(Tremellomycetes) [J]., 2019, 21(3): 207-214.

[26] Ma L, Han Y, Bao H Y,. GC-MS analysis and cytotoxicity detection of volatile oil from the fragrant bracket mushroom,(Agaricomycetes) [J]., 2020, 22(4): 397-406.

[27] 張蘇慧, 廖良坤, 魏曉奕, 等. 超臨界CO2萃取斜葉黃檀精油工藝優化及精油成分分析 [J]. 熱帶作物學報, 2018, 39(4): 791-796.

[28] 王靖, 劉東波, 張志旭. 苦瓜揮發油超臨界二氧化碳萃取工藝優化及其抗炎活性研究 [J]. 食品工業科技, 2019, 40(4): 153-158.

[29] 丁仡, 李源棟, 劉秀明, 等. 超臨界CO2萃取印蒿精油工藝優化及成分分析 [J]. 食品研究與開發, 2019, 40(24): 167-172.

[30] 王立英, 王艷珍, 吳麗艷, 等. 響應面法優化超臨界CO2萃取決明子揮發油工藝及其抑菌活性研究 [J]. 藥物分析雜志, 2016, 36(4): 594-601.

[31] 張曉月, 楊曉芳, 肖培云, 等. 超臨界CO2萃取不同產地云南松松針揮發油及其GC-MS分析 [J]. 中國實驗方劑學雜志, 2020, 26(11): 161-169.

[32] 苗笑雨, 谷大海, 王桂瑛, 等. 響應曲面法優化超臨界CO2萃取虎掌菌精油工藝及其揮發性化合物成分分析 [J]. 現代食品科技, 2018, 34(5): 148-157.

[33] 楊超, 閆慶梓, 唐潔, 等. 蒲公英揮發油成分分析及其抗炎抗腫瘤活性研究 [J]. 中華中醫藥雜志, 2018, 33(7): 3106-3111.

[34] Gao Y, Chen X, Fang L,. Rhein exerts pro- and anti-inflammatory actions by targeting IKKβ inhibition in LPS-activated macrophages [J]., 2014, 72: 104-112.

[35] 張海霞, 方蕓, 葛衛紅, 等. 四氮唑鹽法腫瘤藥敏試驗及應用 [J]. 中國醫院藥學雜志, 2005, 25(7): 663-664.

[36] Almadiy A A, Nenaah G E, Al Assiuty B A,. Chemical composition and antibacterial activity of essential oils and major fractions of fourspecies and their nanoemulsions against foodborne bacteria [J]., 2016, 69: 529-537.

[37] Vallverdú-Queralt A, Regueiro J, Martínez-Huélamo M,. A comprehensive study on the phenolic profile of widely used culinary herbs and spices: Rosemary, thyme, oregano, cinnamon, cumin and bay [J]., 2014, 154: 299-307.

[38] 程嘉莉, 馬江, 肖愛華, 等. 不同干燥方式對紅花玉蘭花蕾揮發油成分及抗氧化、抗菌活性的影響 [J]. 食品科學, 2020, 41(19): 132-139.

[39] 田丹丹, 李艷, 梅曉宏. 牛油果中植物甾醇的鑒定及抗氧化、抑菌活性 [J]. 食品科學, 2019, 40(3): 30-35.

Optimization of supercritical CO2extraction process and biological activities ofvolatile oil

LU Bin1, 2, CHEN Yong-xing1, WU Bo-yu1, WANG Yun3, SHEN Kai-ze1, YU Fu-qiang2, HUA Yan1

1. Key Laboratory for Forest Resources Conservation and Utilization in the Southwest Mountains of China, College of Forestry, Southwest Forestry University, Ministry of Education, Kunming 650224, China 2. The Germplasm Bank of Wild Species, Yunnan Key Laboratory for Fungal Diversity and Green Development, Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650201, China 3. College of Life Science, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China

To optimize the extraction of volatile oil from Gaoshan Sanghuang (), analyze its constituents, and evaluate their biological activities.According to the result of the single factor experiment, the supercritical CO2extraction conditions of volatile oil fromwere optimized by the single factor test and response surface method (RSM). The chemical constituents, biological activities of anti-inflammatory, antitumor, and antibacterial of volatile oil were evaluated by GC-MS, MTS, and microdilution methods.The optimal conditions for extracting volatile oil were found to be 47 ℃ and 31 MPa pressure for 1.5 h. The yield obtained was (0.326 ± 0.005)%. The volatile oil ofcontains 1,2,3,4-tetrachloro-5,6-dimethoxy-benzene, 1,2,3,4-tetrachloro-5-methoxy-6-nitro-benzene, linoleic acid ethyl ester, and pentacosane. The volatile oil exhibited significant activitiesanti-inflammatory and antitumor properties. However, it showed no significant antibacterial activity.The study successfully optimized the extraction of volatile oil from, resulting in a significantly high yield under the tested conditions. The integration ofmodels and biological activities evaluation provides valuable insights for pharmaceutical development and resource utilization from.

(Y. C. Dai & X. M. Tian) L. W. Zhou & Y. C. Dai; volatile oil; response surface method; extraction process; biological activities

R283.6

A

0253 - 2670(2023)14 - 4520 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.14.012

2023-02-09

云南省教育廳科學研究基金項目（2022Y584）；云南重大科技專項計劃項目（202202AE090001）；國家現代農業產業技術體系（CARS-21-05B）；西南林業大學科技創新基金項目（KY21029）

魯 斌（1994—），男，碩士研究生，從事天然藥物化學研究。E-mail: 1300255072@qq.com

于富強（1976—），男，正高級工程師，研究方向為大型真菌種質資源收集保藏與開發利用。E-mail: fqyu@mail.kib.ac.cn

華 燕（1968—），女，教授，博士生導師，從事天然藥物化學研究。E-mail: huayan1216@163.com

[責任編輯 鄭禮勝]