芪參益氣滴丸調(diào)控Sirt1與eNOS互作促進(jìn)糖尿病心肌缺血損傷修復(fù)再生

劉 鑫，劉甜甜*，姚魁武，張彥麗，鞏 穎，顧媛媛，曹俊嶺, 3*

芪參益氣滴丸調(diào)控Sirt1與eNOS互作促進(jìn)糖尿病心肌缺血損傷修復(fù)再生

劉 鑫1，劉甜甜1*，姚魁武2，張彥麗1，鞏 穎1，顧媛媛1，曹俊嶺1, 3*

1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078 2. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院，北京 100040 3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700

探討芪參益氣滴丸對(duì)糖尿病心肌缺血損傷小鼠血管內(nèi)皮功能及血管新生的作用機(jī)制。102只雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、尼可地爾片（4.55 mg/kg）組及芪參益氣滴丸低、高劑量（227.5、455.0 mg/kg）組和芪參益氣滴丸（227.5 mg/kg）＋EX-527（10 mg/kg）組。第2周開始對(duì)照組以正常飼料飼養(yǎng)，其余各組以高脂飼料飼養(yǎng)，然后持續(xù)7 d ip鏈脲霉素（50 mg/kg），建立2型糖尿病模型，對(duì)照組ip等體積生理鹽水。第4周模型組和各給藥組小鼠連續(xù)5 d頸背部sc異丙腎上腺素鹽酸鹽（100 mg/kg），對(duì)照組sc等體積生理鹽水。第5周開始給予藥物干預(yù)14 d，取血清測(cè)定心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTn I）、肌酸激酶MB同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）和血管性血友病因子（von willebrand factor，vWF）含量；病理染色檢測(cè)心臟形態(tài)結(jié)構(gòu)、膠原纖維比值、心肌凋亡數(shù)量和血管新生情況；Western blotting檢測(cè)心臟組織沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silence information regulator 1，Sirt1）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）、磷酸化蘇氨酸495位點(diǎn)eNOS（phosphorylation of Thr495-eNOS，pT495-eNOS）、磷酸化絲氨酸1177位點(diǎn)eNOS（phosphorylation of Ser1177-eNOS，pS1177-eNOS）蛋白表達(dá)。免疫熒光雙標(biāo)染色檢測(cè)心臟Sirt1與eNOS共定位。與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清cTnI水平及CK-MB活性均明顯增加（＜0.01），ET-1、vWF和NO水平均顯著減少（＜0.01）；心肌細(xì)胞排列紊亂，肌纖維缺失，肌間隙增大，心肌纖維化面積和心肌凋亡數(shù)目顯著增加（＜0.01），血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，CD31）標(biāo)記的新生血管數(shù)量明顯減少（＜0.01），心臟Sirt1、eNOS表達(dá)降低（＜0.01），pT495-eNOS水平升高（＜0.01），Sirt1和eNOS共定位減少。芪參益氣滴丸干預(yù)后均有顯著的保護(hù)效應(yīng)，加入EX-527能部分逆轉(zhuǎn)芪參益氣滴丸的作用。芪參益氣滴丸可通過上調(diào)Sirt1和eNOS水平，增加Sirt1與eNOS相互作用，提高NO生物利用度，保護(hù)內(nèi)皮功能，改善血管新生，抑制心肌纖維化和心肌凋亡，從而促進(jìn)糖尿病心肌缺血損傷修復(fù)。

芪參益氣滴丸；糖尿病；心肌缺血；血管新生；內(nèi)皮功能；沉默信息調(diào)節(jié)因子1；內(nèi)皮型一氧化氮合酶

預(yù)計(jì)到2045年，全球糖尿病人數(shù)將達(dá)7.84億[1]，龐大的糖尿病人口加劇經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，另外，糖尿病遷延不愈易導(dǎo)致各種心腦血管并發(fā)癥。研究表明，糖尿病患者的動(dòng)脈粥樣硬化血管病變發(fā)生率增加，心肌梗死和腦梗死發(fā)病率是非糖尿病患者的4～5倍，且預(yù)后較差[2]。關(guān)于糖尿病心肌梗死的病理機(jī)制并不明確，研究認(rèn)為高血糖可能通過其代謝途徑增加炎癥和活性氧產(chǎn)生，導(dǎo)致血管結(jié)構(gòu)和功能改變，造成心肌受損及心功能障礙[3]。近年來對(duì)糖尿病心肌梗死有效治療途徑的需求日益增加，臨床治療既要控制血糖水平，改善心絞痛癥狀，還需預(yù)防心腦血管病進(jìn)展引起的致死致殘，改善生活質(zhì)量。為此，探尋糖尿病心肌梗死的潛在靶標(biāo)及治療藥物具有重要意義和潛在應(yīng)用價(jià)值。

沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silence information regulator 1，Sirt1）調(diào)控哺乳動(dòng)物細(xì)胞多個(gè)重要病理生理過程[4-5]。研究表明，敲除基因?qū)е滦∈笮募∪毖?再灌注損傷加重，高表達(dá)Sirt1則下調(diào)凋亡蛋白和上調(diào)抗氧化分子改善心肌缺血[6-8]。Sirt1能活化內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS），提高內(nèi)皮源性一氧化氮（nitric oxide，NO）水平，抑制血管老化，抗動(dòng)脈粥樣硬化，改善腦動(dòng)脈和胸主動(dòng)脈舒張功能，介導(dǎo)缺血區(qū)域血運(yùn)重建[9]。此外，研究發(fā)現(xiàn)抑制eNOS活性及NO水平顯著降低Sirt1的表達(dá)，引起血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，說明eNOS也正向調(diào)控Sirt1表達(dá)[10]。可見，增加Sirt1與eNOS相互作用對(duì)維持血管內(nèi)皮功能、促進(jìn)缺血區(qū)域血管再生發(fā)揮一定的作用。

糖尿病心肌梗死屬中醫(yī)消渴并發(fā)胸痹、心痛等范疇[11]。患者臨床癥狀及中醫(yī)證候，多以心氣不足、心血失于推動(dòng)，血脈滯澀為發(fā)病原因。基本病機(jī)主要是本虛標(biāo)實(shí)、氣虛血瘀，故益氣活血化瘀、標(biāo)本同治為其重要治則。芪參益氣滴丸是益氣活血法的代表方藥，研究顯示，芪參益氣滴丸增加2型糖尿病合并冠心病老年患者的左室射血分?jǐn)?shù)和舒張功能[12-13]，減輕高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化損傷、抑制心肌細(xì)胞凋亡[14]，但具體作用機(jī)制不詳。本研究采用高脂飲食聯(lián)合鏈脲霉素及頸背部sc異丙腎上腺素構(gòu)建糖尿病心肌缺血模型，探討芪參益氣滴丸對(duì)糖尿病心肌缺血損傷小鼠血管內(nèi)皮功能和心肌修復(fù)再生的機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠102只，6～8周齡，體質(zhì)量17～20 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2021-0006，質(zhì)量合格證號(hào)110011221108055625，使用許可證號(hào)SYXK（京）2019-0013。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)DFYY202225M）。

1.2 藥品與試劑

60%脂肪供能高脂飼料（H10060，批號(hào)20220801）購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司；NO試劑盒（批號(hào)20221014）、肌酸激酶MB同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）試劑盒（批號(hào)20221014）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；鏈脲霉素（批號(hào)WXBD1402V）、異丙腎上腺素鹽酸鹽（批號(hào)WXBD0774V）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；芪參益氣滴丸（批號(hào)220313）購(gòu)自天士力制藥集團(tuán)股份有限公司；尼可地爾片（批號(hào)220209249）購(gòu)自天方藥業(yè)有限公司；選擇性SIRT1抑制劑EX-527（批號(hào)A1527018）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，CD31）抗體（批號(hào)C76821022003）購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司；GAPDH（批號(hào)20210615）購(gòu)自天德悅（北京）生物科技有限責(zé)任公司；山羊抗兔二抗（批號(hào)158319）、山羊抗小鼠二抗（批號(hào)139283）購(gòu)自美國(guó)Jackson公司；磷酸化絲氨酸1177位點(diǎn)-eNOS（phosphorylation of Ser1177-eNOS，pS1177-eNOS）抗體（批號(hào)ab215717）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；Sirt1抗體（批號(hào)sc74465）、eNOS抗體（批號(hào)sc376751）、磷酸化蘇氨酸495位點(diǎn)-eNOS（phosphorylation of Thr495-eNOS，pT495-eNOS）抗體（批號(hào)sc136519）購(gòu)自美國(guó)Santa公司；小鼠心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTn I）ELISA試劑盒（批號(hào)W17025589）、小鼠內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）ELISA試劑盒（批號(hào)W18025590）、小鼠血管性血友病因子（von willebrand factor，vWF）ELISA試劑盒（批號(hào)W19025591）均購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司；血糖試紙（批號(hào)26054442）購(gòu)自德國(guó)Roche公司。

1.3 儀器

活力型血糖儀（德國(guó)Roche公司）；Synergy H1型多功能微孔板檢測(cè)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）；Forma? 900系列?80 ℃超低溫冰箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；5424R型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；BX51型正置顯微鏡（日本Olympus公司）；P250 FLASH型全載玻片數(shù)字病理掃描儀和Caseviewer切片掃描分析軟件（匈牙利3DHISTECH有限公司）。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥

C57BL/6J小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，采用隨機(jī)數(shù)字表法選取12只為對(duì)照組，其余分為模型組、尼可地爾片（4.55 mg/kg，相當(dāng)于臨床等效劑量）組及芪參益氣滴丸低、高劑量（227.5、455.0 mg/kg，分別為1、2倍臨床劑量）組和芪參益氣滴丸（227.5 mg/kg）＋EX-527（10 mg/kg）組，每組18只。第2周開始除對(duì)照組繼續(xù)喂養(yǎng)正常飼料外，其余小鼠均喂養(yǎng)高脂飼料至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，然后ip鏈脲霉素（50 mg/kg），連續(xù)注射7 d，對(duì)照組ip等體積生理鹽水。注射鏈脲霉素后第8、10、11天測(cè)定各組小鼠空腹血糖。第4周開始模型組和各給藥組小鼠連續(xù)5 d頸背部sc異丙腎上腺素鹽酸鹽（100 mg/kg），建立心肌缺血模型，對(duì)照組頸背部sc等體積生理鹽水。第5周開始各給藥組分別ig尼可地爾片、芪參益氣滴丸或ip EX-527。對(duì)照組和模型組ig等體積純水，給藥干預(yù)2周后取材。

2.2 血清cTnI、CK-MB、ET-1、vWF、NO檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后摘眼球取血，收集血液靜置后，4 ℃、3500 r/min離心15 min，取上清，按照試劑盒說明書測(cè)定各組小鼠血清中cTn-I、CK-MB、ET-1、vWF、NO含量。

2.3 心臟病理染色

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，迅速摘取心臟，將心臟置于4%中性多聚甲醛溶液中固定48 h。然后進(jìn)行組織脫水、石蠟包埋、切片。每組小鼠心臟進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色、Masson染色，切片掃描儀觀察各組心臟病理變化及膠原纖維沉積情況。采用Image-Pro Plus軟件半定量分析心臟纖維化面積比值。

2.4 心臟TUNEL染色

每組選取6個(gè)小鼠心臟組織進(jìn)行TUNEL染色，觀察各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡情況。將制備好的石蠟切片脫蠟、水化后，與蛋白酶K孵育20 min，PBS清洗3次。將切片與熒光標(biāo)記液和TdT酶置于37 ℃避光孵育1 h，PBS清洗3次，蘇木素復(fù)染核。于切片掃描儀下隨機(jī)選取8個(gè)視野，采用Image-Pro Plus軟件統(tǒng)計(jì)綠色熒光細(xì)胞核的面積比。

2.5 心臟免疫組化染色

每組選取6個(gè)小鼠切片進(jìn)行CD31免疫組化染色，觀察心臟血管表達(dá)變化。于切片掃描儀下隨機(jī)選取8個(gè)視野，采用Image-Pro Plus軟件統(tǒng)計(jì)棕褐色陽性血管面積占比。

2.6 Western blotting檢測(cè)心臟eNOS、pT495-eNOS、pS1177-eNOS和Sirt1蛋白表達(dá)

提取心臟組織蛋白，BCA測(cè)試盒定量蛋白濃度。蛋白樣品在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）上分離并轉(zhuǎn)膜。采用5%脫脂牛奶或5%牛血清白蛋白溶液室溫封閉1 h，4 ℃孵育eNOS、pS1177-eNOS、pT495-eNOS、Sirt1、GAPDH抗體過夜，次日TBST洗膜，室溫孵育二抗1 h。化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶，采用Quantity One軟件統(tǒng)計(jì)相對(duì)蛋白灰度值。

2.7 心臟免疫熒光共染

每組選取3個(gè)小鼠心臟切片進(jìn)行Sirt1和eNOS免疫熒光共染，觀察心臟Sirt1和eNOS的定位和相互作用。在切片掃描儀下隨機(jī)選取10個(gè)視野，采用Image-Pro Plus軟件統(tǒng)計(jì)Sirt1和eNOS互作的橙黃色面積占比。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 芪參益氣滴丸對(duì)糖尿病心肌缺血損傷小鼠心功能的影響

如圖1所示，小鼠注射鏈脲霉素后第8、10、11天檢測(cè)的空腹血糖值均顯著大于對(duì)照組（＜0.01），并且第10、11天小鼠空腹血糖均＞11.1 mmol/L，同時(shí)觀察到注射鏈脲霉素后小鼠出現(xiàn)多飲、多尿、多食、體質(zhì)量減輕的“三多一少”典型癥狀，說明2型糖尿病模型成功。

與對(duì)照組比較：**P＜0.01，下圖同

如圖2所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清cTnI水平和CK-MB活性均明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，尼可地爾片組和芪參益氣滴丸低、高劑量組cTnI水平和CK-MB活性顯著降低（＜0.01）；與芪參益氣滴丸低劑量組比較，芪參益氣滴丸＋EX-527組血清中cTnI水平明顯升高（＜0.01），CK-MB活性無顯著差異。結(jié)果表明，芪參益氣滴丸能抑制糖尿病心肌缺血小鼠心功能損傷。

NT-尼可地爾片 QSYQ-芪參益氣滴丸 與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與芪參益氣滴丸低劑量組比較：&&P＜0.01，下圖同

3.2 芪參益氣滴丸對(duì)糖尿病心肌缺血損傷小鼠心臟病理變化的影響

各組小鼠心臟形態(tài)拍照和HE、Masson染色結(jié)果見圖3，對(duì)照組小鼠心臟形態(tài)飽滿，充血發(fā)紅，心肌纖維結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，藍(lán)色膠原纖維沉積極少。模型組小鼠心臟表面可見明顯凹陷，心肌缺血發(fā)白，心肌纖維排列紊亂，肌纖維缺失明顯，肌間隙增大，存在大量藍(lán)色膠原纖維積聚。與模型組比較，尼可地爾片組和芪參益氣滴丸低、高劑量組小鼠心臟均有不同程度的改善。與芪參益氣滴丸低劑量組比較，芪參益氣滴丸＋EX-527組心臟缺血發(fā)白，肌纖維排列稍顯紊亂，肌間隙加大，心肌纖維部分缺失，膠原纖維含量有所提升。表明芪參益氣滴丸可以有效逆轉(zhuǎn)糖尿病小鼠缺血心臟病變。

圖3 芪參益氣滴丸對(duì)糖尿病心肌缺血損傷小鼠心臟結(jié)構(gòu)的影響 (×400)

3.3 芪參益氣滴丸對(duì)糖尿病心肌缺血損傷小鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL熒光染色結(jié)果見圖4，綠色熒光細(xì)胞核為凋亡的心肌細(xì)胞。與對(duì)照組比較，模型組小鼠心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增加（＜0.01）；與模型組比較，尼可地爾片組和芪參益氣滴丸低、高劑量組小鼠心肌凋亡數(shù)量明顯減少（＜0.01）；與芪參益氣滴丸低劑量組比較，芪參益氣滴丸＋EX-527組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著增加（＜0.01）。說明芪參益氣滴丸具有抑制糖尿病心肌缺血損傷小鼠心肌凋亡的作用。

3.4 芪參益氣滴丸對(duì)糖尿病心肌缺血損傷小鼠血管新生和內(nèi)皮功能的影響

免疫組化染色和內(nèi)皮功能相關(guān)因子ELISA測(cè)定結(jié)果見圖5，與對(duì)照組比較，模型組心臟CD31及血清ET-1、vWF、NO水平均顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，尼可地爾片組和芪參益氣滴丸低、高劑量組心臟CD31及血清ET-1、NO水平均明顯增加（＜0.01），芪參益氣滴丸低劑量組vWF水平明顯增加（＜0.01），芪參益氣滴丸高劑量組vWF水平明顯降低（＜0.05）；與芪參益氣滴丸低劑量組比較，芪參益氣滴丸＋EX-527組相關(guān)因子水平均顯著下調(diào)（＜0.01）。

圖4 芪參益氣滴丸對(duì)糖尿病心肌缺血損傷小鼠心肌凋亡的影響(×400;, n = 6)

圖5 芪參益氣滴丸對(duì)糖尿病心肌缺血損傷小鼠心臟血管新生(A) 和內(nèi)皮功能(B) 的影響(×400;, n = 6)

3.5 芪參益氣滴丸對(duì)糖尿病心肌缺血損傷小鼠心臟Sirt1和eNOS蛋白表達(dá)的影響

如圖6所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠心臟Sirt1、eNOS表達(dá)明顯降低（＜0.01），pT495-eNOS水平明顯升高（＜0.01），pS1177-eNOS水平無顯著性差異。與模型組比較，尼可地爾片組心臟Sirt1表達(dá)顯著增加（＜0.01），pT495-eNOS和eNOS表達(dá)明顯降低（＜0.01）；芪參益氣滴丸低、高劑量組心臟Sirt1、eNOS表達(dá)均顯著升高（＜0.01），pT495-eNOS水平顯著降低（＜0.01）；芪參益氣滴丸高劑量組心臟pS1177-eNOS水平顯著降低（＜0.01）；與芪參益氣滴丸低劑量組比較，芪參益氣滴丸＋EX-527組小鼠心臟的Sirt1和eNOS表達(dá)均顯著降低（＜0.01）。

圖6 芪參益氣滴丸對(duì)糖尿病心肌缺血損傷小鼠心臟Sirt1和eNOS蛋白表達(dá)的影響(, n = 6)

3.6 芪參益氣滴丸對(duì)糖尿病心肌缺血損傷小鼠心臟Sirt1與eNOS共定位的影響

免疫熒光共染結(jié)果見圖7，紅色熒光標(biāo)記Sirt1，綠色熒光標(biāo)記eNOS，藍(lán)色熒光標(biāo)記細(xì)胞核。對(duì)照組小鼠心臟組織中可見Sirt1大量表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，eNOS大部分表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)的血管內(nèi)皮中，胞質(zhì)中存在大量橙色熒光，說明Sirt1與eNOS共定位增多。與對(duì)照組比較，模型組小鼠心臟組織中Sirt1和eNOS共定位減少。與模型組比較，芪參益氣滴丸低劑量組心臟組織中Sirt1和eNOS共定位增加，而EX-527能夠逆轉(zhuǎn)芪參益氣滴丸對(duì)Sirt1和eNOS的共定位。

箭頭表示Sirt1和eNOS共定位

4 討論

糖尿病是心血管病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，由血糖升高所致血管病變引起的冠心病、心絞痛、心肌梗死、缺血性腦血管病是糖尿病致殘致死的首要病因[15-16]。芪參益氣滴丸是治療氣虛血瘀型冠心病心絞痛的中成藥[17]，由黃芪、丹參、三七、降香油制成，具有益氣通脈、活血止痛之功[18]。研究發(fā)現(xiàn)，激活Sirt1信號(hào)能通過抗炎抗氧化、抑制心肌凋亡，改善大鼠心肌缺血損傷[19]。eNOS是血管內(nèi)皮特異蛋白，對(duì)維持血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，目前有關(guān)Sirt1與eNOS表達(dá)改變及二者互作對(duì)糖尿病合并心肌梗死的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究證實(shí)芪參益氣滴丸抑制糖尿病缺血心臟病變、減少心肌凋亡、促進(jìn)血管再生，保護(hù)血管內(nèi)皮功能，改善缺血心功能，而芪參益氣滴丸介導(dǎo)的治療作用可能與促進(jìn)內(nèi)皮功能因子及NO釋放，增加Sirt1與eNOS相互作用有關(guān)。

cTn-I和CK-MB是評(píng)估心肌受損的標(biāo)記物，二者活性變化常提示心臟功能異常[20]。cTn-I主要表達(dá)在心肌組織，抑制肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白結(jié)合，在心肌收縮和舒張過程中發(fā)揮重要作用，當(dāng)心肌細(xì)胞受損時(shí)血清中cTn-I含量顯著升高，是診斷心肌受損的高靈敏性和特異性指標(biāo)[21]。CK-MB是心肌特有的肌酸激酶，參與細(xì)胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)運(yùn)、肌肉收縮、提供心肌產(chǎn)生三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）[22]，當(dāng)血液CK-MB活性劇烈上升，預(yù)示有發(fā)生心肌梗死、心肌損傷、心包炎等疾病的風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果提示糖尿病心肌缺血小鼠血清中cTn-I水平和CK-MB活性顯著提升，說明心肌細(xì)胞受損嚴(yán)重，給予芪參益氣滴丸明顯降低糖尿病心肌缺血模型小鼠血清中cTn-I水平和CK-MB活力，表明芪參益氣滴丸能有效改善心肌缺血損傷。

ET-1是長(zhǎng)效血管收縮調(diào)節(jié)因子，對(duì)維持血管張力與心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)起重要作用，ET-1已成為冠狀動(dòng)脈疾病、心肌梗死和心力衰竭的預(yù)測(cè)因子和預(yù)后標(biāo)志物[23]。vWF是一種糖蛋白，在血管損傷期間介導(dǎo)血小板黏附到內(nèi)皮下層，穩(wěn)定凝血因子發(fā)揮止血作用，vWF在血管系統(tǒng)中還介導(dǎo)血管炎癥、滲透和血管新生作用[24]。因此，ET-1、vWF變化是反映血管內(nèi)皮功能的關(guān)鍵指標(biāo)。本研究結(jié)果說明，糖尿病心肌缺血損傷小鼠血液中ET-1和vWF水平均顯著減少，芪參益氣滴丸能提升ET-1、vWF水平，保護(hù)血管內(nèi)皮功能。此外，EX-527逆轉(zhuǎn)芪參益氣滴丸的作用，說明芪參益氣滴丸保護(hù)糖尿病血管內(nèi)皮損傷可能與Sirt1有關(guān)。

內(nèi)源性NO是調(diào)節(jié)血管功能的重要因子，由eNOS催化-精氨酸和多種輔因子產(chǎn)生[25]。在血管壁，內(nèi)皮細(xì)胞的eNOS合成NO調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）舒張，介導(dǎo)血管新生，抑制VSMC增殖，NO擴(kuò)散至血管腔能抑制血小板聚集及血栓形成。NO生物利用度降低會(huì)引起內(nèi)皮功能障礙，觸發(fā)一系列心血管事件，如腦卒中、心肌梗死、冠狀動(dòng)脈血運(yùn)重建和不穩(wěn)定型心絞痛[26]。eNOS是鈣調(diào)蛋白依賴性二聚體酶，eNOS的絲氨酸1177（Ser1177）、Ser116、Ser635和Ser613位點(diǎn)磷酸化調(diào)控eNOS激活，而蘇氨酸495（Thr495）和酪氨酸657（Tyr657）位點(diǎn)磷酸化則抑制eNOS功能[27]。生理?xiàng)l件下，eNOS可預(yù)防病理性血管重塑、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化和心臟并發(fā)癥[28]。糖尿病和缺血性心臟病患者中發(fā)現(xiàn)eNOS活性和NO含量降低，引發(fā)內(nèi)皮功能、外周和冠狀動(dòng)脈血管新生障礙[29]。本研究結(jié)果顯示糖尿病心肌缺血小鼠中eNOS和NO水平降低，eNOS的Thr495磷酸化位點(diǎn)提升，缺血心臟血管新生功能降低，反映糖尿病血管內(nèi)皮功能障礙，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[30-31]。

研究發(fā)現(xiàn)，Sirt1可促進(jìn)NO產(chǎn)生，減輕炎癥，降低氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)自噬，延緩衰老，抑制血管老化和動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程。內(nèi)皮細(xì)胞的Sirt1通過去乙酰化在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)eNOS，產(chǎn)生NO以保護(hù)血管，而NO反過來也能正向調(diào)控Sirt1[32]。說明Sirt1與eNOS之間存在動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)，這對(duì)維持內(nèi)皮功能和血管重塑十分重要。另外，Sirt1抑制內(nèi)皮Notch信號(hào)和調(diào)節(jié)FoxO1活性，激活eNOS誘導(dǎo)內(nèi)皮依賴性舒張，促進(jìn)血管生成和缺血后新生血管形成。糖尿病心肌缺血損傷減弱eNOS活性和NO生成，而上調(diào)Sirt1能提高eNOS活性和NO生物利用度，降低糖尿病心肌損傷[33-34]。因此，通過促進(jìn)Sirt1與eNOS相互作用，激活eNOS磷酸化及NO釋放，保護(hù)血管內(nèi)皮功能是糖尿病缺血性心臟病的重要治療策略。本研究證實(shí)，芪參益氣滴丸提高Sirt1和eNOS表達(dá)，增加Sirt1與eNOS共定位，提示芪參益氣滴丸可能通過調(diào)控Sirt1與eNOS互作，促進(jìn)糖尿病心肌缺血損傷修復(fù)再生。

本文初步探究了芪參益氣滴丸對(duì)糖尿病心肌缺血小鼠心臟中Sirt1與eNOS相互作用關(guān)系，eNOS活性和NO生成，以及血管內(nèi)皮、心臟功能的影響。結(jié)果證實(shí)，芪參益氣滴丸可能通過上調(diào)Sirt1、eNOS水平，增加Sirt1與eNOS互作，提高NO生物利用度，從而穩(wěn)定內(nèi)皮功能，促進(jìn)血管新生，抑制心肌纖維化和凋亡，改善心臟功能，使氣虛自復(fù)、瘀祛絡(luò)通，揭示芪參益氣滴丸改善糖尿病心肌缺血損傷、血管內(nèi)皮功能障礙及血管新生的機(jī)制，為中藥復(fù)方干預(yù)治療糖尿病心病氣虛血瘀證提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Cho N H, Shaw J E, Karuranga S,. IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045 [J]., 2018, 138: 271-281.

[2] Kuusisto J, Laakso M. Update on type 2 diabetes as a cardiovascular disease risk equivalent [J]., 2013, 15(2): 331.

[3] Varga Z V, Giricz Z, Liaudet L,. Interplay of oxidative, nitrosative/nitrative stress, inflammation, cell death and autophagy in diabetic cardiomyopathy [J]., 2015, 1852(2): 232-242.

[4] Du L, Chen L, Luo B,. Silent information regulator 1 mediates H2S-inhibited chronic restraint stress-induced depressive-like behaviors by regulating hippocampal autophagy [J]., 2023, 34(3): 128-136.

[5] Lu C X, Zhao H D, Liu Y Q,. Novel role of the SIRT1 in endocrine and metabolic diseases [J]., 2023, 19(2): 484-501.

[6] Qiu Z, Ming H, Zhang Y,. The protective role of Bmal1-regulated autophagy mediated by HDAC3/SIRT1 pathway in myocardial ischemia/reperfusion injury of diabetic rats [J]., 2022, 36(2): 229-243.

[7] Yang Y, Duan W X, Li Y,. Novel role of silent information regulator 1 in myocardial ischemia [J]., 2013, 128(20): 2232-2240.

[8] Hsu C P, Zhai P Y, Yamamoto T,. Silent information regulator 1 protects the heart from ischemia/reperfusion [J]., 2010, 122(21): 2170-2182.

[9] D'Onofrio N, Vitiello M, Casale R,. Sirtuins in vascular diseases: Emerging roles and therapeutic potential [J]., 2015, 1852(7): 1311-1322.

[10] Ota H, Eto M, Kano M R,. Induction of endothelial nitric oxide synthase, SIRT1, and catalase by statins inhibits endothelial senescence through the Akt pathway [J]., 2010, 30(11): 2205-2211.

[11] Kibel A, Selthofer-Relatic K, Drenjancevic I,. Coronary microvascular dysfunction in diabetes mellitus [J]., 2017, 45(6): 1901-1929.

[12] 包秋紅, 張勇, 賈海玉, 等. 芪參益氣滴丸聯(lián)合利拉魯肽對(duì)老年2型糖尿病合并冠心病患者血糖、心功能及T細(xì)胞亞群的影響 [J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2020, 20(20): 3897-3901.

[13] 王慧, 曹月娟, 趙振營(yíng). 芪參益氣滴丸治療慢性心力衰竭及其作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床, 2023, 38(5): 1254-1259.

[14] Zhang S Y, Wang H, Li L X,. Qishen Yiqi Drop Pill, a novel compound Chinese traditional medicine protects against high glucose-induced injury in cardiomyocytes [J]., 2019, 23(9): 6393-6402.

[15] Yin J M, Kong A P S, Chan J C N. Prevention and care programs addressing the growing prevalence of diabetes in China [J]., 2016, 16(12): 130.

[16] Skyler J S, Bakris G L, Bonifacio E,. Differentiation of diabetes by pathophysiology, natural history, and prognosis [J]., 2017, 66(2): 241-255.

[17] 李曉強(qiáng), 徐硯通, 胡翠敏, 等. 芪參益氣滴丸和復(fù)方丹參滴丸治療冠心病應(yīng)用及作用機(jī)制異同的研究進(jìn)展 [J]. 中草藥, 2021, 52(23): 7373-7378.

[18] 馬莉, 劉志超, 高晟瑋, 等. 芪參益氣滴丸治療心血管疾病藥理作用與臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 藥物評(píng)價(jià)研究, 2022, 45(4): 780-787.

[19] 劉甜甜, 王擎擎, 姚魁武. 活血溫通方對(duì)心肌缺血模型大鼠心肌組織Sirt1信號(hào)通路的影響 [J]. 中醫(yī)雜志, 2020, 61(9): 804-809.

[20] Zhang Z Y, Yan B F, Li Y G,. Propofol inhibits oxidative stress injury through the glycogen synthase kinase 3 beta/nuclear factor erythroid 2-related factor 2/heme oxygenase-1 signaling pathway [J]., 2022, 13(1): 1612-1625.

[21] Yuan Z P, Wang L, Chen J,. Electrochemical strategies for the detection of cTnI [J]., 2021, 146(18): 5474-5495.

[22] Ben-Yehuda O, Ozan M O, Chen S,. TCT-788 relationship between total CK, CK-MB, SCAI, and universal definition in determining peri-PCI myocardial infarction: Analysis from the randomized BIONICS trial [J]., 2018, 72(13): 314.

[23] Jankowich M, Choudhary G. Endothelin-1 levels and cardiovascular events [J]., 2020, 30(1): 1-8.

[24] Randi A M, Smith K E, Castaman G. Von willebrand factor regulation of blood vessel formation [J]., 2018, 132(2): 132-140.

[25] Liao F F, Lin G, Chen X Y,. Endothelial nitric oxide synthase-deficient mice: A model of spontaneous cerebral small-vessel disease [J]., 2021, 191(11): 1932-1945.

[26] Sarmah N, Nauli A M, Ally A,. Interactions among endothelial nitric oxide synthase, cardiovascular system, and nociception during physiological and pathophysiological states [J]., 2022, 27(9): 2835.

[27] Zemankova L, Varejckova M, Dolezalova E,. Atorvastatin-induced endothelial nitric oxide synthase expression in endothelial cells is mediated by endoglin [J]., 2015, 66(3): 403-413.

[28] Kolluru G K, Siamwala J H, Chatterjee S. eNOS phosphorylation in health and disease [J]., 2010, 92(9): 1186-1198.

[29] Viigimaa M, Sachinidis A, Toumpourleka M,. Macrovascular complications of type 2 diabetes mellitus [J]., 2020, 18(2): 110-116.

[30] Shi Y, Vanhoutte P M. Macro-and microvascular endothelial dysfunction in diabetes [J].. 2017, 9(5): 434-449.

[31] Knapp M, Tu X, Wu R. Vascular endothelial dysfunction, a major mediator in diabetic cardiomyopathy [J].. 2019, 40(1): 1-8.

[32] Kitada M, Ogura Y, Koya D. The protective role of Sirt1 in vascular tissue: Its relationship to vascular aging and atherosclerosis [J]., 2016, 8(10): 2290-2307.

[33] Fourny N, Lan C, Sérée E,. Protective effect of resveratrol against ischemia-reperfusion injury via enhanced high energy compounds and eNOS-SIRT1 expression in type 2 diabetic female rat heart [J]., 2019, 11(1): 105.

[34] Donnarumma E, Ali M J, Rushing A M,. Zofenopril protects against myocardial ischemia-reperfusion injury by increasing nitric oxide and hydrogen sulfide bioavailability [J]., 2016, 5(7): 1-17.

Qishen Yiqi Droplet promotes repair and regeneration of diabetes myocardial ischemia injury by regulating interaction of Sirt1 and eNOS

LIU Xin1, LIU Tian-tian1, YAO Kui-wu2, ZHANG Yan-li1, GONG Ying1, GU Yuan-yuan1, CAO Jun-ling1, 3

1. Dongfang Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100078, China 2. Eye Hospital, Chinese Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100040, China 3. Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China

To explore the mechanism of Qishen Yiqi Droplet (芪參益氣滴丸) on vascular endothelial function and angiogenesis in diabetes mice with myocardial ischemia injury.A total of 102 male C57BL/6J mice were randomly divided into control group, model group, Nicorandil Tablet (尼可地爾片, 4.55 mg/kg) group, Qishen Yiqi Droplet low-, high-dose (227.5, 455.0 mg/kg) groups and Qishen Yiqi Droplet (227.5 mg/kg) + EX-527 (10 mg/kg) group. In the second week, the control group was fed with normal diet, and the other groups were fed with high-fat diet. In the third week, streptozotocin (50 mg/kg) was intraperitoneally injected for 7 d to establish the model of type 2 diabetes. The control group was injected with equal dose of normal saline. At the fourth week, the model group and each administration group mice were subcutaneously injected with isoproterenol hydrochloride (100 mg/kg) on the nape of the neck for five consecutive days, while the control group mice were subcutaneously injected with the same volume of normal saline. After 14 d of drug intervention in the fifth week, serum was taken to measure cardiac troponin I (cTn I), creatine kinase MB isoenzyme (CK-MB), nitric oxide (NO), endothelin 1 (ET-1) and von willebrand factor (vWF) contents; Cardiac morphology, collagen fiber ratio, myocardial apoptosis and angiogenesis were detected by pathological staining; Western blotting was used to detect the expressions of silence information regulator 1 (Sirt1), endothelial nitric oxide synthase (eNOS), phosphorylation of Thr495-eNOS (pT495-eNOS) and phosphorylation of Ser1177-eNOS (pS1177-eNOS) proteins in cardiac tissue. Immunofluorescence double staining was used to detect the co-localization of Sirt1 and eNOS in the heart.Compared with control group, cTnI level and CK-MB activity in serum of mice in model group were significantly increased (< 0.01), while the levels of ET-1, vWF, and NO were significantly reduced (< 0.01); Myocardial cells were disordered, muscle fibers were missing, muscle space was enlarged, myocardial fibrosis area and myocardial apoptosis number were significantly increased (< 0.01), the number of new blood vessels labeled by platelet endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31) was significantly reduced (< 0.01), the expressions of Sirt1 and eNOS in heart were reduced (< 0.01), level of pT495-eNOS was increased (< 0.01), the co-localization of Sirt1 and eNOS was reduced. After intervention, Qishen Yiqi Droplet showed significant protective effects, and the addition of EX-527 could partially reverse the effect of Qishen Yiqi Dropping Pills.Qishen Yiqi Droplet can promote the repair of myocardial ischemia injury in diabetes by up-regulating the levels of Sirt1 and eNOS, increasing the interaction between Sirt1 and eNOS, improving the bioavailability of NO, protecting endothelial function, improving angiogenesis, inhibiting myocardial fibrosis and myocardial apoptosis.

Qishen Yiqi Droplet; diabetes; myocardial ischemia; angiogenesis; endothelial function; Sirt1; eNOS

R285.5

A

0253 - 2670(2023)14 - 4564 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.14.017

2023-02-28

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（82104627）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（2022-JYB-XJSJJ-065）

劉 鑫，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幏乐涡难懿〉淖饔脵C(jī)制。E-mail: 1428382783@qq.com

劉甜甜（1989—），博士，主管藥師，研究方向?yàn)橹兴幏乐涡难懿〉淖饔脵C(jī)制。E-mail: liutiantian008@126.com

曹俊嶺（1972—），博士生導(dǎo)師，主任藥師，研究方向?yàn)橹兴幇踩约昂侠碛盟帯-mail: caojunling72@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]