常規(guī)粳稻浙粳78 優(yōu)質(zhì)雙抗的分子特征分析

陳佑源 蔣寧飛 尚子帥 巫明明 葉 靖 葉勝海

（1.浙江勿忘農(nóng)種業(yè)股份有限公司 浙江 杭州 311215；2.建德市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心 浙江 建德 311600；3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所 浙江 杭州 310021）

21 世紀(jì)以來(lái)，浙江省水稻播種面積呈下降趨勢(shì)，2001 年全省稻谷種植面積134 萬(wàn)hm2，2021 年約為63 萬(wàn)hm2，僅為前者的47%。 盡管如此，水稻依舊是浙江省第一大糧食作物，年均產(chǎn)量498.78 萬(wàn)t，占糧食總產(chǎn)的83.13%[1]。然而，浙江地處亞熱帶中部，屬季風(fēng)性濕潤(rùn)氣候， 氣溫適中， 光照充足， 雨量豐沛，不僅是適宜水稻種植的重要地區(qū)， 同時(shí)也是水稻病蟲(chóng)害如稻瘟病、 白葉枯病的高發(fā)區(qū)。 因此， 稻瘟病和白葉枯病已成為該地限制水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的兩大重要病害。 其中， 稻瘟病分布遍及世界各稻區(qū)， 流行年份稻谷一般減產(chǎn)10%~20%， 嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)40%~50%，局部田塊甚至顆粒無(wú)收， 每年損失的稻谷足以養(yǎng)活6 000 萬(wàn)人口。 目前我國(guó)稻瘟病的平均發(fā)生強(qiáng)度、 年發(fā)生面積及稻谷損失分別為25.21%、380 萬(wàn)~600 萬(wàn)hm2及15 億~30 億kg[2-4]。 盡管浙江省稻瘟病平均發(fā)生強(qiáng)度全國(guó)最低，僅為4.46%，但近年來(lái)浙江部分地區(qū)存在大范圍發(fā)生趨勢(shì)[5-6]。 而白葉枯病則主要流行于我國(guó)華東、華南和華中稻區(qū)，一般造成稻谷產(chǎn)量損失10%~30%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)50%，甚至絕收。 在20 世紀(jì)80～90 年代，該病在浙江省發(fā)生較重，而后總體趨勢(shì)為輕發(fā)，但2015 年后又趨于加重，甚至在浙東南部分區(qū)域連片暴發(fā)， 嚴(yán)重影響糧食生產(chǎn)安全及農(nóng)藥減量增效工作成效[7-9]。 因此，面對(duì)“老問(wèn)題新暴發(fā)”的水稻白葉枯病，2021 年浙江省將其列入首批二類農(nóng)作物病蟲(chóng)害名錄，同時(shí)自2022 年開(kāi)始，在水稻區(qū)試審定標(biāo)準(zhǔn)中將白葉枯病抗性與稻瘟病抗性列為同等重要位置，同時(shí)實(shí)施“一票否決”制。

在水稻生產(chǎn)上，為了防治上述病害，一般通過(guò)噴施農(nóng)藥或種植抗性水稻品種來(lái)控制， 但農(nóng)藥防治既污染環(huán)境也危害人類身體健康。 目前農(nóng)業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革正推動(dòng)我國(guó)農(nóng)業(yè)向綠色化轉(zhuǎn)型發(fā)展[10]。培育并推廣應(yīng)用多抗水稻品種及品種合理布局， 減少農(nóng)作物化學(xué)農(nóng)藥用量，是實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)綠色生態(tài)生產(chǎn)，保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全、 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全和生態(tài)環(huán)境安全的科學(xué)有效途徑。 為了適應(yīng)新時(shí)代的生產(chǎn)要求，浙江省自2022 年開(kāi)始實(shí)行水稻新品種審定標(biāo)準(zhǔn)，如多個(gè)優(yōu)異性狀累計(jì)標(biāo)準(zhǔn)， 即在優(yōu)質(zhì)與抗性等方面優(yōu)異性狀越多，則對(duì)產(chǎn)量要求相對(duì)放寬。 本研究基于稻米食味關(guān)鍵基因、 稻瘟病和白葉枯病抗性基因功能型或緊密連鎖分子標(biāo)記，對(duì)單季常規(guī)粳稻浙粳78 的優(yōu)質(zhì)雙抗基因進(jìn)行分子分析， 以期為該品種的推廣應(yīng)用及進(jìn)一步遺傳改良奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

水稻品種浙粳78 （浙江勿忘農(nóng)種業(yè)股份有限公司）種子發(fā)芽后，用Yoshida 營(yíng)養(yǎng)液于組織培養(yǎng)室恒溫培養(yǎng)至3 葉1 心， 而后剪取完全展開(kāi)葉用于基因組DNA 提取。

1.2 稻米品質(zhì)、稻瘟病及白葉枯病抗性評(píng)價(jià)

評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)均來(lái)源于國(guó)家水稻數(shù)據(jù)中心（http://www. ricedata.cn/variety/index.htm）。 稻瘟病及白葉枯病的相關(guān)數(shù)據(jù)均為2 年平均值。

1.3 基因組DNA 提取與抗性基因分子檢測(cè)

取0.1 g 水稻葉片， 用水稻基因組DNA 提取試劑盒（易思得生物科技有限公司）提取基因組DNA。

常規(guī)PCR 反應(yīng)總體系20 μL，內(nèi)含1× BlueStarTMPCR Master Mix（北京擎科生物科技有限公司）、上下游引物各1.5 μmol/L 及基因組DNA 50 ng。 PCR 反應(yīng)程序： 95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，退火時(shí)間30 s，72℃延伸30~60 s，共35 個(gè)循環(huán)；72℃再次延伸5 min，最后保持在16℃。 PCR 產(chǎn)物采用2.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，用紫外凝膠成像儀拍照。 而需要測(cè)序或用CAPS/dCAPS 標(biāo)記驗(yàn)證的部分基因，PCR 反應(yīng)總體系50 μL， 內(nèi)含1× Phanta Max 緩沖液、dNTP 0.2 mmol/L、Phanta Max 高保真DNA 聚合酶 （南京諾唯贊生物科技股份有限公司）、 上下游引物各1.5 μmol/L 及基因組DNA 50 ng。 PCR 反應(yīng) 程序：98℃預(yù)變性3 min；98℃變性10 s，退火時(shí)間15 s，72℃延伸30~60 s，共35 個(gè)循環(huán)；72℃再次延伸5 min，最后保持在16℃。 PCR 產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳后切膠純化DNA 片段，而后送北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。 酶切反應(yīng)體系：總體積30 μL，內(nèi)含3 μL PCR 產(chǎn)物、1 μL 限制性內(nèi)切酶及1× 反應(yīng)緩沖液。 所有基因分析的相關(guān)引物序列見(jiàn)表1。

表1 抗病基因的分子標(biāo)記和基因克隆的引物

2 結(jié)果與分析

2.1 稻米食味品質(zhì)相關(guān)基因的分子特征

除Wx 基因外，Tian 等[11]和謝米雪等[12]根據(jù)關(guān)鍵核苷酸多態(tài)性均將水稻淀粉合成途徑中的其他重要基因分成2 種單倍型， 其中SBE3 基因的3’UTR 第63 個(gè)堿基的變異將導(dǎo)致SpeI 限制性內(nèi)切位點(diǎn)的改變，缺失的為Ⅰ型，反之則為Ⅱ型；AGPiso 基因的終止密碼子下游第532 個(gè)堿基G 的變異導(dǎo)致EcoRI 限制性內(nèi)切位點(diǎn)的改變，缺失的為Ⅰ型，反之則為Ⅱ型；AGPlar 基因的起始密碼子上游第1 633 個(gè)堿基存在C/T 的變異，含C 的為Ⅰ型，含T 的為Ⅱ型；ISA 基因的起始密碼子上游第1 499 個(gè)堿基存在C/G 的變異，含C 的為Ⅰ型，含G 的為Ⅱ型；SSII-3 基因的起始密碼子后的第4 329 個(gè)及第4 330 個(gè)堿基存在GC/TT的變異，含TT 的為Ⅰ型，含GC 的為Ⅱ型；SSI 基因的起始密碼子后的第3 216 個(gè)堿基存在A/T 的變異，含T 的為Ⅰ型，含A 的為Ⅱ型；SSIV-2 基因的起始密碼子后的第437 個(gè)堿基存在InDel 差異，擴(kuò)增片段大小為210 bp 的為Ⅰ型，而片段大小為198 bp 的為Ⅱ型。 同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)， 含有Ⅱ型SSI 和AGPlar 及Ⅰ型SSII-3 的稻米直鏈淀粉含量相對(duì)更低； 含Ⅰ型AGPiso、SBE3 和ISA 基因的稻米糊化溫度相對(duì)更低；含有Ⅱ型SBE3、ISA 和SSIV-2 及Ⅰ型SSII-3 的稻米堿消值相對(duì)更低。分析浙粳78 中的上述基因特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SSII-3和SBE3 為I 型， 其他5 個(gè)基因?yàn)棰蛐停▓D1）。

圖1 浙粳78 中與稻米食味及蒸煮品質(zhì)相關(guān)基因的分子分型

2.2 稻瘟病抗性基因的鑒定

浙江省單季粳稻2 年區(qū)試結(jié)果顯示，浙粳78 的苗葉瘟均值及其最高級(jí)均值、穗瘟發(fā)病率均值及其最高級(jí)均值、穗瘟損失率均值及其最高級(jí)均值、稻瘟病綜合指數(shù)均值分別為1.5 級(jí)和3.0 級(jí)、5.5 級(jí)和7.0 級(jí)、1.5 級(jí)和2.0 級(jí)、2.9， 最終該品種的稻瘟病抗性定為中抗。 為了明確該品種中是否攜帶白葉枯病抗性基因， 利用已克隆抗性基因的功能型或緊密連鎖分子標(biāo)記進(jìn)行鑒定， 結(jié)果表明， 該品種中含有抗病基因Pish、Pib、Pi36、Pi-co39、Pita、Pikm2、Pik（圖2）。

圖2 稻瘟病抗性基因的PCR 鑒定

2.3 白葉枯病抗性基因的鑒定

2018 年和2019 年浙江省單季常規(guī)粳稻區(qū)試結(jié)果顯示，浙粳78 的白葉枯病均值及其最高級(jí)均值分別為2.0 級(jí)和3.0 級(jí)，該品種白葉枯病抗性綜合評(píng)定為中抗。 為了明確該品種中是否攜帶白葉枯病抗性基因， 利用已克隆抗性基因的功能型或緊密連鎖分子標(biāo)記進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，該品種中含有抗病基因Xa21（圖3）。 同時(shí)進(jìn)一步對(duì)Xa25/xa25 基因測(cè)序并與已知抗性基因序列[13]比對(duì)分析，證實(shí)浙粳78 中含有抗病基因xa25（圖3、圖4）。

圖3 白葉枯病抗性基因的PCR 鑒定

圖4 xa25 基因的測(cè)序分析

3 討論與結(jié)論

優(yōu)質(zhì)稻米，不僅需要漂亮的外觀品質(zhì)，更在于優(yōu)異的內(nèi)在蒸煮食味品質(zhì)。 而后者是由糊化溫度、直鏈淀粉含量、膠稠度等理化指標(biāo)間接決定，一般來(lái)說(shuō)，優(yōu)質(zhì)稻米具有較低直鏈淀粉含量、 較高膠稠度和較低糊化溫度等優(yōu)點(diǎn)。 研究顯示，含有Ⅰ型SSⅡ-3，Ⅱ型AGPlar 和SSⅠ稻米種質(zhì)的直鏈淀粉含量相對(duì)更低； 含有Ⅱ型AGPsio、SBE3 和ISA 的膠稠度相對(duì)較高；而糊化溫度與堿消值反相關(guān)，含有Ⅱ型ISA 稻米種質(zhì)的堿消值相對(duì)更低[11,14-15]。本研究結(jié)果顯示，浙粳78 中含有Ⅰ型SSⅡ-3 和SBE3， Ⅱ型ISA、AGPsio、SSIV-2、AGPlar 和SSⅠ。 因此，從直鏈淀粉及膠稠度的角度來(lái)看，該品種攜帶的基因均為優(yōu)良基因，而從堿消值的角度來(lái)看，ISA 則不是優(yōu)良基因。

要實(shí)現(xiàn)水稻生產(chǎn)的綠色生態(tài)發(fā)展， 培育多抗水稻新品種是最重要且經(jīng)濟(jì)有效的途徑。 根據(jù)寄主與病原物互作的性質(zhì)， 可以把植物抗病性區(qū)分為垂直抗病性（vertical resistance）和水平抗病性（horizontal resistance）兩類[16-17]。 其中前者是通過(guò)植物病害抗性基因識(shí)別和它對(duì)應(yīng)的病原物Avr 基因， 并產(chǎn)生高效專化性抗性免疫反應(yīng)，其抗性程度高、有效性強(qiáng)被廣泛用于現(xiàn)代抗病育種和生產(chǎn)上[18]。本研究利用多種病害抗性基因的功能型或緊密連鎖分子標(biāo)記， 并結(jié)合部分基因的PCR 克隆及測(cè)序分析，結(jié)果證實(shí)浙粳78攜帶有Pish、Pib、Pi36、Pi-co39、Pita 和Pikm2 等稻瘟病抗性基因， 以及白葉枯病抗性基因xa25 和Xa21，從而賦予該品種稻瘟病及白葉枯病雙中抗抗性。