六盤山野生大球蓋菇分離鑒定及生物學特性初探

李 穎 高有錢 林戎斌 賈寶光 王正安 賈 旭

（1.寧夏農林科學院固原分院 寧夏 固原 756000；2.固原市六盤山林業局 寧夏 固原 756000;3.福建省農業科學院土壤肥料研究所 福建 福州 350013）

大球蓋菇（Stropharia rugosoannulata）又名皺環球蓋菇、 酒紅色球蓋菇、 裴氏球蓋菇， 屬于擔子菌門（Basidiomycota）、 傘菌綱（Agaricomycetes）、 傘菌目（Agaricaler）、 球蓋菇科（Strophariaceae）、 球蓋菇屬（Stropharia）[1]。 大球蓋菇作為栽培管理粗放的特色食用菌之一，其質地鮮嫩，對人體有益的多糖類、蛋白質、礦質元素及維生素等物質含量豐富，并具有抗腫瘤、抗氧化等功效，是一種集營養、療效于一體的食、藥兼用菌，具有廣闊的市場前景及商業生產潛力。 我國云南、吉林、西藏等地有野生大球蓋菇分布[2]，國內專家學者也對其做了相關研究報道。 李碧瓊等[3]首次對莆田老鷹尖自然保護區的野生食用菌資源進行調查，發現了野生大球蓋菇。 顏淑婉和劉勝貴等[4-5]對其大球蓋菇生物學特性進行了研究， 確定了適宜其生長發育的碳源、氮源、pH 及生長溫度。 馬令法等[6]的研究表明，大球蓋菇菌核生長、菌落形成和菌絲生長的最優碳源是葡萄糖，最優氮源是酵母膏。 薩仁圖雅等[2]的研究表明，不同品種的大球蓋菇菌絲生長對碳源和氮源的需求不同。 大球蓋菇屬草腐菌，其抗逆性強，生態習性范圍廣，野生大球蓋菇主要生長在闊葉林下的落葉層及針闊混交林中。 我國西北地區生態環境條件十分脆弱，生物種類相對稀少，大多數物種表現為抗旱、抗寒及耐鹽堿等生物學特性，研究六盤山的野生大球蓋菇資源， 對保護當地脆弱的生態系統和生物多樣性， 同時對發展當地的經濟具有重要意義與科學價值。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

六盤山國家級自然保護區 （35°15′~35°41′ N，106°09′～106°31′ E） 位于寧夏南部黃土高原西部，處于干旱向半濕潤過渡的地帶， 是黃土高原植被覆蓋良好、生物多樣性、徑流與森林資源最豐富的地區之一，素有黃土高原的“綠島”和“濕島”之稱，是我國西北地區重要的水源涵養基地和生態屏障， 橫貫陜甘寧3 個省份，總面積為6.78 萬hm2，是寧夏3 大次生林區之一，種質資源豐富，素有“西北種質資源基因庫”之稱，特有的地形地貌和氣候為野生食用菌的繁衍提供了得天獨厚的環境條件。

1.2 供試材料

1.2.1 子實體 子實體2021 年9 月28 日采集于六盤山國家森林公園。

1.2.2 培養基 PDA 固體培養基： 馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L，自然pH。

基礎培養基：葡萄糖20 g、尿素2 g、磷酸二氫鉀1g、硫酸鎂0.5 g、瓊脂18 g、去離子水1 000 mL。

1.3 試驗方法

1.3.1 組織分離及純化 采用組織分離法對樣本子實體進行菌種分離。 首先用70%酒精棉擦洗菌蓋及菌柄部位進行表面消毒，在酒精燈火焰附近，用手將子實體從菌柄基部向菌蓋處撕開， 用燃燒后的手術刀片將菌蓋與菌柄之間的菌肉切成小方塊， 然后用滅過菌的鑷子夾取一小塊菌肉組織， 放入事先準備好的裝有無菌培養基的PDA 平板培養基中， 置于25℃培養箱中黑暗培養， 標記為Q1。 菌絲直徑達到2 cm 后，進行純化培養。1.3.2 菌種鑒定 采用真菌基因組提取試劑盒 （天根） 分別對大球蓋菇的子實體和分離培養得到的菌絲體進行基因組DNA 提取。 采用通用引物ITS1 和ITS4 （TS1：5-TCCGTAGGT-GAACCTGCGG-3；ITS4：5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）用于rDNA ITS 區段的PCR擴增。擴增體系為50 uL，其中包含35.5 uL去離子水、5 uL10×PCR buffer、4 uL dNTPs（2.5 mmol/L）、ITSl 和ITS4 引物各2 uL、0.5 μL Tag DNA 酶（5 U/uL）、1 uL 模板DNA（濃度20～50 mg/L）。 PCR 反應條件：95℃預 變 性5 min；94℃變 性30 s，55℃退 火30 s，72℃延伸40 s，35 個循環；72℃反應7 min。 PCR 擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后4℃保存。1.3.3 生物學特性分析 采用微生物平板培養法，通過測定不同碳源、 氮源及無機鹽培養基上菌絲長勢、生長指數、菌落直徑、菌落形成時間、菌落長勢、菌絲生長速度等指標來研究不同培養基配方對球蓋菇屬菌絲生長的影響， 并采用十字交叉劃線法標記1 次菌落直徑，持續標記3 次，記錄菌絲日均長速和菌絲長度。 每個配方5 個重復，注意記錄霉變情況，對霉變的平板要及時處理。

（1）碳源試驗。以基礎培養基中葡萄糖20 g 的含碳量為標準，分別以相同含碳量的蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、 甘露醇、 乳糖代替基礎培養基中的葡萄糖，并以不添加任何碳源的基礎培養基作對照，研究不同碳源物質對供試菌菌絲生長的影響。

（2）氮源試驗。 以基礎培養基中尿素2 g 的含氮量為標準，分別以相等含氮量的硝酸鉀、蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨、尿素、酵母粉代替基礎培養基中的尿素，并以不添加任何氮源的基礎培養基作對照，研究不同氮源物質對供試菌菌絲生長的影響。

（3）無機鹽試驗。 分別用硫酸鐵、硫酸鈣、硫酸鋅、硫酸銅和硫酸錳代替基礎培養基中的硫酸鎂，并以不加硫酸鎂的基礎培養基作對照， 其中常量元素添加量為0.5 g/L，微量元素添加量為0.06 g/L，研究不同無機鹽物質對供試菌菌絲生長的影響。

1.4 項目測定

測定不同培養基上球蓋菇的菌落直徑， 并對菌落長勢進行評分，研究不同碳源、氮源和無機鹽對球蓋菇菌絲生長的影響。 觀察、記錄每個菌株的菌落直徑、顏色、長勢、疏密度、平均生長速率等情況。

具體評分標準：菌絲長勢濃密、均勻，5 分；菌絲長勢較濃密、較均勻，4 分；菌絲長勢較稀疏、較均勻，3 分；菌絲長勢較稀疏、不均勻，2 分；菌絲長勢稀疏、不均勻，1 分。

菌落直徑（mm）：用直尺任意測量3 次，取平均值。

菌絲生長指數=菌絲長勢評分×菌絲生長速率；菌絲日均長速（mm/d）=[（菌落直徑-6）/2]/培養天數。

1.5 數據處理

采用Excel、SPSS 17.0 數據處理系統對試驗數據進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 分離培養

在秋季， 寧夏六盤山國家森林公園發現獲得野生大球蓋菇子實體，其單生或群生于枯枝落葉層中，菌蓋直徑5.5～8.0 cm，扁半球形至扁平，濕時稍黏，蓋緣光滑或覆叢毛狀鱗片，附著較多的菌幕殘片，深葡萄酒褐色。 菌褶直生，膜質，淺灰色至紫褐色；褶緣鋸齒狀，白色。 菌柄長6～12 cm，直徑0.9～2.0 cm，圓柱形至基部近球根狀，白色至奶油色菌環厚。 野生大球蓋菇子實體經組織分離后獲得純種菌絲Q1， 對大球蓋菇菌落的平板培養進行觀察， 可以看出菌絲生長濃密， 顏色為潔白色， 菌落絨毛狀， 圓形， 平坦，有放射狀紋。 對大球蓋菇菌株的菌絲進行顯微觀察， 發現菌絲細胞含有雙核， 且具有明顯的鎖狀聯合結構。 從菌絲生長速率來看，大球蓋菇Q1 菌絲生長速率為2.68 mm/d（圖1）。

圖1 野生大球蓋菇子實體及菌落Q1 的平板培養

2.2 菌種鑒定

測序結果登錄GenBank 核酸序列數據庫進行Blast 比對， 與登錄號MH860190.1 （Stropharia rugosoannulata）的菌種覆蓋度最高達100%，相似性達99.85%。 下載相似高的ITS 序列，用Clustal W 進行序列比對，基于分離株Q1 以及來自GenBank 的最相似球蓋菇屬15 個種的ITS 序列，用MEGA2.0 軟件采用ML 法構建系統樹（采用默認值，圖2）。 從系統發育樹可看出，菌種Q1 與球蓋菇屬中的大球蓋菇聚為一支，結合形態特征，鑒定分離菌種為大球蓋菇。

圖2 基于ITS 序列構建的系統發育樹

2.3 菌絲生物學特性

2.3.1 不同碳源對大球蓋菇菌絲生長發育的影響6 種碳源均可以被大球蓋菇菌絲所利用（表1），說明大球蓋菇Q1 對碳源利用譜較廣。 其中以葡萄糖和蔗糖作為碳源時大球蓋菇菌絲長勢最強， 菌絲健壯而濃密，與其他碳源相比差異顯著。 其按照菌絲生長速率順序為葡萄糖=蔗糖＞可溶性淀粉＞麥芽糖=乳糖=甘露醇＞無碳源。 結合菌絲長勢與密度發現，大球蓋菇菌絲生長的最適碳源為葡萄糖和蔗糖。

表1 不同碳源對大球蓋菇菌絲生長及生長勢的影響

2.3.2 不同氮源對大球蓋菇菌絲生長發育的影響由表2 可知， 結合大球蓋菇菌絲生長勢和生長速率分析， 菌絲在酵母浸粉為氮源的培養基上生長快而健壯，菌絲濃密，與其他氮源培養基上的菌絲生長指數差異顯著； 菌絲在硫酸銨和硝酸鉀為氮源的培養基上菌絲生長速率較快， 在硫酸銨培養基上生長快而較健壯，菌絲較濃密，但是菌絲在硝酸鉀培養基上長勢差，菌絲稀疏，故不宜選用硝酸鉀。 試驗表明，大球蓋菇菌絲生長的最適氮源為酵母浸粉。

表2 不同氮源對大球蓋菇菌絲生長及生長勢的影響

2.3.3 不同無機鹽對大球蓋菇菌絲生長發育的影響不同無機鹽對大球蓋菇菌絲生長具有一定的影響，在添加硫酸鐵的培養基上，菌絲生長速率最快，但菌絲長勢一般。 在不添加無機鹽的培養基上，與其他培養基的菌絲生長指數相比差異顯著，菌絲長勢較強，密度較濃密，試驗表明，大球蓋菇菌絲生長過程中可不添加無機鹽（表3）。

表3 不同無機鹽對大球蓋菇菌絲生長及生長勢的影響

3 討論與結論

六盤山野生大球蓋菇發生季節在秋季， 單生或群生于草地或枯枝落葉層， 采用組織分離法對野生大球蓋菇子實體進行分離，成功分離、純化得到野生大球蓋菇菌種Q1。 通過ITS 序列分析法對供試子實體與菌絲體進行擴增、測序、對比，驗證子實體為大球蓋菇子實體的分離物，分離獲得的菌絲體Q1 為大球蓋菇菌種。

大球蓋菇菌絲體生長最適碳源為葡萄糖和蔗糖，最適氮源為酵母浸粉，這一結果與顏淑婉等[7]的試驗中大球蓋菇菌種St0128 菌絲生長適宜條件一致。 無機鹽試驗結果表明， 硫酸鐵促進大球蓋菇Q1菌絲體生長，而硫酸鈣抑制菌絲體生長，結合菌絲體生長長勢得出， 大球蓋菇菌絲體生長最適的為不添加無機鹽處理，該結果與閆培生等[8]、馬令法等[6]的研究結果不同。