P16/Ki-67雙染在宮頸癌篩查中的應(yīng)用價值分析

高亞麗 吳坤英

鄭州市婦幼保健院婦科，鄭州 450000

宮頸癌發(fā)病機制復(fù)雜，可能涉及性生活開始過早、多個性伴侶、抽樣、免疫功能缺陷性疾病、多孕多產(chǎn)等，其中人乳頭瘤病毒（HPV）感染是其發(fā)生的主要因素，若不及時治療，隨著腫瘤不斷增大可侵犯或壓迫鄰近器官組織而出現(xiàn)相應(yīng)癥狀，甚至威脅患者生命安全［1］。宮頸癌癌前病變持續(xù)時間較長，若能早期篩查并發(fā)現(xiàn)早期浸潤癌和癌前病變，可起到減少或預(yù)防宮頸癌發(fā)生的目的。液基細胞學(xué)（TCT）檢查、高危人乳頭瘤病毒（HR-HPV）檢測是宮頸癌篩查的常用手段，但前者檢查無法在體外培養(yǎng)，且重現(xiàn)性欠佳、檢測步驟過于繁瑣、難以將一過性感染的影響排除，存在較高的假陰性，后者檢查會受到細胞學(xué)診斷醫(yī)師業(yè)務(wù)水平限制，漏診率較高，同時價格昂貴、易出現(xiàn)假陽性、不適合大規(guī)模宮頸癌篩查等，故無法作為最終的臨床診斷方式［2-3］。抑制基因蛋白16（P16）屬于細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，P16-Cyclin D1CDK-Rb 組成的調(diào)控途徑與宮頸癌發(fā)生密切相關(guān)，而原癌基因細胞增殖核抗原（Ki-67）屬于核蛋白，在G0 期缺失，在G1、G2、S、M 期均有表達，正常情況下兩者表達為互斥的，若檢測細胞中兩者同時表達提示細胞周期失調(diào)且存在宮頸高級病變可能［4-5］。本研究分析P16/Ki-67 雙染在宮頸癌篩查中的應(yīng)用價值，以為臨床診斷提供新的思路，現(xiàn)報道如下。

資料與方法

1.研究對象

回顧性分析2020 年10 月至2022 年5 月就診于鄭州市婦幼保健院的100 例宮頸病變患者的臨床資料，年齡（55.65±2.14）歲（25～72 歲）；首次性生活年齡（23.65±2.14）歲（18～28歲）；性伴侶數(shù)（1.22±10）個（1～3個）；婚姻狀況：已婚93 例，未婚7 例。納入標準：宮頸完整，既往未接受物理或?qū)m頸手術(shù)治療者；年齡＞21 歲；檢查前3 d 無性生活、無陰道用藥、無外陰清洗；患者或家屬簽署知情同意書。排除標準：既往接受盆底放射治療者；既往有宮頸手術(shù)史或子宮切除術(shù)治療者；妊娠期或哺乳期孕婦者。

本研究經(jīng)鄭州市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，批準文號：ZZFY-LL-2021017。

2.方法

2.1.P16/Ki-67 雙染檢測 檢查時取膀胱截石位，用一次性窺陰器將宮頸充分暴露，用宮頸細胞取樣刷在宮頸管內(nèi)及宮頸表面順時針旋轉(zhuǎn)5～10 圈，刷取宮頸脫落細胞，使用ThinPrep2000 系統(tǒng)處理標本，制作細胞涂片。晾干后，用無水乙醇固定10 min，室溫下晾干，使用疏水筆于載玻片上畫出疏水圈。應(yīng)用抗原清除及修復(fù)內(nèi)源酶：按照19∶1 的比例配比蒸餾水及抗原修復(fù)液，配置完成后將其置于染色缸內(nèi)后放入玻片，明確抗原修復(fù)液超過書寫區(qū)之上。隨后將染色缸置入高壓鍋內(nèi)，于氣壓閥開始均勻噴氣時開始計時，控制修復(fù)時間為5 min，待完成自然冷卻至室溫后使用清洗液漂洗3 min，重復(fù)清洗3 次，依據(jù)具體情況補全疏水圈，載玻片上會均勻滴入3%H2O2溶液，確保書寫區(qū)被充分覆蓋，室溫下孵育10 min，清洗液漂洗3 min，重復(fù)3次。完成后實施染色，即將1 滴DS-A 染液滴于書寫區(qū)，并于37 ℃環(huán)境中孵育30 min，漂洗30 min，重復(fù)3 次，隨后滴加1 滴DS-V 染液，恒溫箱（37 ℃）內(nèi)孵育30 min，清洗液漂洗3 min，重復(fù)3 次。將DS-C 和DS-D 以1∶33 制作成50 μl DAB 顯色液，并將其覆蓋于載玻片書寫區(qū)，于室溫下顯色10 min，隨后采用流水沖洗3 min，清洗液漂洗3 min，向其內(nèi)滴入50 μl Fast Red 顯色液，按照DS-C 和DS-D 以1∶75 的比例配制，于室溫下顯色15 min，后流水沖洗3 min，進行蘇木精-伊紅染色，復(fù)染10 s。流水沖洗5 min，于清洗液中行10 min 反藍，流水漂洗1 min。將2 滴隨心封片劑滴于載玻片中央，晾干后用樹脂滴膠封片。隨后置于光學(xué)顯微鏡下觀察，P16定位于細胞核或細胞質(zhì)上，呈淺棕色、棕黃色和棕色即為陽性；Ki-67定位于細胞核上，顯淺紅色、玫紅色即為陽性。

2.2.TCT 檢查 用棉拭子擦除宮頸口分泌物，用特制的宮頸刷在宮頸管內(nèi)順時針轉(zhuǎn)動5 圈，動作輕柔，采集宮頸口和頸管脫落的上皮細胞，用毛刷將收集的標本置于Thin Prep 保存液的小瓶內(nèi)漂洗，收集細胞，用新柏氏2000 全自動制片機制片。將細胞混勻，制作成直徑2 cm 左右的薄層細胞涂片，用95%乙醇固定，巴氏染色，封固制片，透明，樹膠封片放入烘箱烘干，由專業(yè)人員閱片。參照TBS 分級系統(tǒng)（2006）對細胞學(xué)檢測分類。不典型腺上皮細胞（AGC）和腺癌、高度鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL）、宮頸鱗狀細胞癌（SCC）、低度鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL）、不能排除高級別鱗狀上皮內(nèi)病變的宮頸不典型鱗狀細胞（ASC-H）、未見上皮內(nèi)病變細胞或惡性細胞（NILM）、細胞學(xué)異常診斷包括意義不明確的宮頸不典型鱗狀細胞（ASC-US）。TCT 檢查結(jié)果判斷標準：NILM判定為陰性結(jié)果，其余均判定為陽性結(jié)果。

2.3.HR-HPV 檢測 以窺陰器暴露宮頸，用棉拭子擦去宮頸過多的分泌物，將蘸取少許無菌生理鹽水的標準宮頸刷插入宮頸口，順時針旋轉(zhuǎn)約5 圈，慢慢取出宮頸刷，放置在裝有專用保存液的小瓶內(nèi)，多余的刷柄在管口處折斷，將刷頭留在樣本管內(nèi)，管蓋旋緊，做好樣品標識并保持洗脫管直立放置，4 ℃保存待檢。用高危型人乳頭瘤病毒核酸檢測試劑盒檢測23 種HPV 基因型，包含HPV6、HPV11、HPV42 等在內(nèi)的9 種HPV 低危型和HPV18 型、HPV16 型，HPV31、HPV33、HPV35 等在內(nèi)的12 種高危型HPV。檢測出HR-HPV亞型則檢查結(jié)果評定為陽性。

2.4.陰道鏡檢查 由陰道鏡醫(yī)師實施陰道鏡檢查及活檢術(shù)。使用陰道窺器充分暴露宮頸，使用棉球擦拭宮頸表面，攝片、保存。使用碘棉球及3%醋酸棉球均勻涂抹于陰道穹隆、宮頸及陰道壁處，仔細觀察各部位變化情況，保存圖像。在陰道鏡輔助下選擇異常處3～4 塊病理送檢。所有操作均由本院兩名經(jīng)驗豐富的病理科主任醫(yī)生進行診斷，病理診斷＜LSIL（即CINI 及以下診斷）為陰性；≥HSIL（即CINⅡ+）為陽性。

3.觀察指標

（1）記錄陰道鏡檢查結(jié)果；（2）以陰道鏡下活檢結(jié)果為金標準，分析HR-HPV、TCT、P16/Ki-67 雙染診斷宮頸病變靈敏度、準確度和特異度。準確度=（真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù)）/總例數(shù)×100%；靈敏度=真陽性例數(shù)/（真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%；特異度=真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù)）×100%。

4.統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0 軟件分析數(shù)據(jù)，用（±s）表示符合正態(tài)分布的計量資料，組間比較采用獨立樣本t檢驗；以例（%）表示計數(shù)資料，采用χ2檢驗，通過繪制受試者工作特征曲線（ROC），計算曲線下面積（AUC），其中AUC 越接近于1，說明診斷準確性越高，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1.陰道鏡下活檢結(jié)果

100 例宮頸病變患者，經(jīng)陰道鏡檢查發(fā)現(xiàn)14 例（14.00%）為炎癥病變，宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）Ⅰ26 例（26.00%），CIN Ⅱ 26 例（26.00%），CIN Ⅲ28 例（28.00%），SCC 6例（6.00%）。

2.HR-HPV、TCT、P16/Ki-67雙染診斷宮頸病變的價值

HR-HPV、TCT、P16/Ki-67雙染對宮頸病變診斷的靈敏度、特異度和準確度相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。見表1～4。

表1 100例宮頸病變患者的HR-HPV診斷結(jié)果（例）

表2 100例宮頸病變患者的TCT診斷結(jié)果（例）

表3 100例宮頸病變患者的P16/Ki-67雙染診斷結(jié)果（例）

表4 100例宮頸病變患者的HR-HPV、TCT、P16/Ki-67雙染診斷宮頸病變（%）

3.多種篩查方法效果評價

繪制ROC，HR-HPV、TCT、P16/Ki-67 雙染診斷宮頸病變的AUC 分別為0.917、0.835、0.888，P16/Ki-67 雙染檢測分別與TCT、HR-HPV 檢查相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（Z=1.720，P=0.086；Z=1.171，P=0.243）。見圖1。

圖1 100例宮頸病變患者的HR-HPV、TCT、P16/Ki-67雙染診斷的ROC

討論

宮頸癌早期無典型性臨床表現(xiàn)，多數(shù)患者被確診時已進展為中晚期，錯失手術(shù)治療最佳時機，預(yù)后較差［6］。因?qū)m頸癌發(fā)病緩慢，癌前病變不會出現(xiàn)跨階式變化，而是呈階梯式進展，加上子宮頸獨特的可暴露性質(zhì)，其可經(jīng)早期篩查被發(fā)現(xiàn)并實施干預(yù)，有助于改善患者預(yù)后。HR-HPV 病毒持續(xù)感染與宮頸癌發(fā)生、進展密切相關(guān)，其是HPV可侵入至宮頸上皮細胞內(nèi)表面致癌蛋白，能夠產(chǎn)生多種HPV蛋白，而高危型HPV感染能夠經(jīng)干擾INF產(chǎn)生或抑制癌基因P53、滅活CDK 抑制物、影響細胞周期素CyclinA/E、激活端粒酶等，擾亂細胞的正常增殖與凋亡機制，最終誘發(fā)子宮頸癌變［7-9］。HR-HPV 檢測可通過標準化試劑盒實施檢測，判斷患者是否存在高危型HPV感染，能避免人為主觀因素的不利影響，且檢查具有高陰性預(yù)測值、高靈敏度等特點，可濃縮高風(fēng)險人群，常被應(yīng)用于宮頸癌篩查［10-11］。但HR-HPV 難以排除一過性感染的影響且檢測步驟過于繁瑣，不利于臨床推廣。TCT 為細胞學(xué)檢測新技術(shù)，結(jié)合物理技術(shù)與現(xiàn)代計算機技術(shù)，能使制成的薄層圖片背景更干凈、細胞成分更為齊全、結(jié)構(gòu)更加清晰，利于早期發(fā)現(xiàn)、診斷宮頸疾病［12-13］。TCT 具有操作簡單、涂片采集率高等優(yōu)點，但因病理細胞學(xué)醫(yī)生缺乏、質(zhì)量控制不足且觀察者間重復(fù)性差等影響，使得TCT 檢查也難以推廣。

P16 屬于腫瘤抑制基因，在宿主細胞內(nèi)能夠與Cyclin D競爭相結(jié)合為CDK4/CDK6，有助于抑制CDK4、CDK6 的活性，促使Rb 蛋白失活，在細胞增殖時無法經(jīng)細胞周期檢查點R點，進一步阻礙細胞周期從G1至S期的整個過程，有助于抑制宿主細胞的增殖［14-15］。HR-HPV 持續(xù)感染時宮頸上皮細胞基因組與病毒基因組會發(fā)生整合，其產(chǎn)生的E7 蛋白，可較好地與Rb 蛋白進一步結(jié)合后轉(zhuǎn)化為pRb，導(dǎo)致Rb-E2F 復(fù)合體發(fā)生解離，產(chǎn)生大量的核轉(zhuǎn)錄因子E2F，促使基因P16 表現(xiàn)出異常高表達。Ki-67 是一種貫穿表達于增殖期細胞中的核蛋白，該指標從G1 后期開始表達，其水平越來越高，至M 期達到頂峰，在有絲分裂后水平快速下降［16-18］。Ki-67被異常激活表示細胞喪失正常成熟功能，可造成分化異常、增殖亢進，而Ki-67 過表達表示細胞增殖活躍［19］。一般情況下，同一個細胞周期內(nèi)P16、Ki-67 不可能同時表達，兩者作用相互拮抗，但兩者同時表達時即表示細胞周期失調(diào)，表示患者存在高級病變風(fēng)險［20-21］。本研究中，HR-HPV、TCT、P16/Ki-67 雙染對宮頸病變診斷的靈敏度、特異度和準確度相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義；HR-HPV、TCT、P16/Ki-67 雙染診斷宮頸病變的曲線下面積（AUC）分別為0.917、0.835、0.888，P16/Ki-67 雙染檢測AUC 分別與TCT、HR-HPV 檢查相比也差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示P16/Ki-67雙染診斷準確性與TCT、HR-HPV 檢查相似。P16/Ki-67 雙染以免疫組化為原理，檢測子宮頸脫落細胞涂片，其結(jié)果判讀依賴于光學(xué)顯微鏡下同一細胞內(nèi)的染色結(jié)果，具有良好的重現(xiàn)性，不依賴于細胞學(xué)形態(tài)檢測，能夠檢出真正的病變細胞，且無須太過專業(yè)的讀片技術(shù)，細胞學(xué)醫(yī)師經(jīng)短期培訓(xùn)即可掌握。

綜上所述，P16/Ki-67 雙染篩查宮頸癌及癌前病變效果與TCT、HR-HPV 相似，其具有高效、客觀、簡便、易重復(fù)等優(yōu)點，可作為宮頸癌及癌前病變初篩的新選擇［22］。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突