白藜蘆醇影響金黃色葡萄球菌生物被膜形成的分子機制

唐曉華 彭琦 袁文常

1廣州醫科大學金域檢驗學院，廣州 510180；2廣州醫科大學附屬第三醫院檢驗科，廣州 510145

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）除了可引起輕微的淺表皮膚感染外，還可引起危及生命的全身感染，如肺炎、敗血癥、心內膜炎和中毒性休克綜合征，由于其對多種藥物的耐藥性，已成為一個重大的全球健康問題［1-2］。金黃色葡萄球菌生物被膜是由菌落和胞外聚合物（exopolysaccharide，EPS）粘附形成的微生物群落［3］。多糖細胞內粘附素（polysaccharide intercellular adhesin，PIA）是金黃色葡萄球菌生物被膜中的主要EPS［4］。PIA 介導細胞間粘附并形成緊密連接的生物被膜，由細胞內粘附（icaADBC）操縱子產生［5］。除了PIA，細胞外DNA（eDNA）和一些表面蛋白也有助于生物被膜的穩定性［6］。此外，eDNA 可能在生物被膜的早期粘附和成熟階段充當靜電聚合物［7］，并通過將PIA 與生物被膜相關蛋白和生物被膜的其他成分連接來穩定生物被膜的結構［8］。由于生物被膜的形成，可導致金黃色葡萄球菌感染持續存在，同時，生物被膜保護的細菌細胞比浮游細胞對大多數抗生素和宿主防御系統更有抵抗力［9］。據報道，生物被膜可使抗微生物耐藥性增加100～1 000倍［10］。因為受生物被膜保護的細菌比浮游細菌需要更多的抗生素去根除，所以很難在體內達到最低的抗生素濃度來根除生物被膜下的細菌。此外，一旦建立了生物被膜，就很難根除［11］。

白藜蘆醇是葡萄屬植物產生的一種結構類似于雌激素乙菧酚的植物抗毒素［12］。研究顯示，白藜蘆醇具有良好的抗炎、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等多種生物學活性［13］。同時，白藜蘆醇也有較好的抗菌活性［14］。白藜蘆醇可以抑制金黃色葡萄球菌生長，并且通過下調SaeRS 來減少金黃色葡萄球菌分泌α-溶血素［13］。然而，白藜蘆醇在金黃色葡萄球菌生物被膜形成中的作用機制尚不清楚，也沒有系統的研究。因此，2023 年1 月至4 月，本研究旨在探討白藜蘆醇對金黃色葡萄球菌生物被膜形成的影響及其分子機制。

材料與方法

1.菌株及主要儀器試劑

黏液型金黃色葡萄球菌SYN菌株分離自廣州市某三甲醫院1 例腎結石患者的腎臟膿液，是一株強生物被膜生成金黃色葡萄球菌。酶標儀（美國Biotek 公司）、實時熒光定量PCR 儀（美國BIO-RAD 公司）、TE 緩沖溶液、TEN 緩沖液（中國酷萊博公司）；RNAiso Plus、TB Green Premix Ex Taq、PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（中國TaKaRa公司）；白藜蘆醇（美國SIGMA 公司）；胰酶大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）培養基、MH 培養基（中國環凱公司），熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）引物合成（中國深圳華大基因），引物序列見表1。

表1 熒光定量聚合酶鏈式反應引物及其序列

2.方法

2.1.白藜蘆醇最小抑菌濃度（MIC）的測定 采用肉湯微量稀釋法測定MIC。將細菌SYN 接種至血平板，37 ℃培養24 h。挑取血平板上單克隆菌落在生理鹽水中調成0.5 麥氏濁度菌液，用MH 液體培養基按1∶100 比例稀釋菌液。DMSO 溶解白藜蘆醇，稀釋至4 096 mg/L 母液濃度，后續實驗再進行倍比稀釋。在96 孔板每孔中先加入稀釋后的菌液100 μl，再分別加入100 μl 藥物，采用二倍稀釋法使白藜蘆醇的終濃度分別為2 048、1 024、512、256、128、64、32、16、8 mg/L。設置陽性對照孔（200 μl 菌液）和陰性對照孔（200 μl MH 培養基）。37 ℃培養24 h，觀察結果，以抑制細菌生長的最低濃度為MIC。

2.2.不同濃度白藜蘆醇下細菌生長曲線的測定 在6孔板中按照1∶100比例加入菌液及含512、256、128、64 mg/L白藜蘆醇的TSB培養基，放置于37 ℃恒溫搖床，200 r/min繼續培養。設置3 個重復孔，以不加任何藥物的孔作為陽性對照。每隔1 h測量OD600吸光度值，繪制金黃色葡萄球菌SYN的生長曲線。

2.3.結晶紫法不同濃度白藜蘆醇對生物被膜形成的影響 取96 孔板，加入含不同亞抑菌濃度白藜蘆醇的TSB 培養基200 μl。將過夜培養的SYN 菌液以1∶100 比例加入到含有不同濃度白藜蘆醇的96 孔板中，37 ℃培養24 h 后，棄去菌液，用無菌PBS 輕柔洗滌3 次去除浮游菌，自然晾干。每孔加入200 μl 99%甲醇溶液，固定10 min，自然晾干。每孔加入200 μl 0.5%結晶紫溶液，染色15 min，用去離子水輕柔洗滌每孔直至流水無色，放入37 ℃培養箱烘干。每孔加入200 μl 33%冰乙酸，放入水平旋轉儀上緩慢震蕩，使孔中的結晶紫染液充分溶解，放入酶標儀測定OD590吸光度值。

2.4.苯酚濃硫酸法檢測亞抑菌濃度白藜蘆醇對生物被膜胞外多糖產生的影響 標準曲線的繪制：分別吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.8 ml 葡萄糖溶液（40 mg/L），各以ddH2O 補充至2.0 ml。加入1.0 ml 6%苯酚及5.0 ml濃硫酸，搖勻靜置30 min，于490 nm測量光密度，根據葡萄糖濃度與光密度值計算繪制標準曲線。于6 孔板中按1∶100 比例將SYN 接種于終濃度為128 mg/L 白藜蘆醇的TSB 培養基中，37 ℃培養24 h。舍棄浮游菌，無菌PBS 輕柔洗滌2 次，去除浮游態細菌。用3.0 ml PBS重懸生物被膜，70 ℃水浴加熱1 h后，11 500 r/min 離心（離心半徑10.37 cm）12 min，收集沉淀。沉淀中加入3.0 ml 3% EDTA 溶液，混勻，11 500 r/min 離心（離心半徑10.37 cm）12 min。上清液用孔徑為0.22 μm的微孔濾膜過濾，濾液為待測多糖樣品。取樣品1.0 ml，加入1.0 ml ddH2O，加入1.0 ml 6%苯酚，加入濃硫酸5 ml，充分混勻后靜置30 min，測量A490吸光度值。

2.5.苯酚氯仿抽提法檢測亞抑菌濃度白藜蘆醇對eDNA釋放的影響 于6 孔板中加入終濃度為128 mg/L 白藜蘆醇的TSB 中，按1∶100 比例加入過夜培養的菌液，以不加白藜蘆醇的孔作為對照組，37 ℃靜置培養24 h。棄去培養液，無菌PBS 輕柔洗滌，每孔加入1.0 ml TEN 緩沖液，重懸黏附于孔板底的生物被膜，轉入EP 管中，12 000 r/min 離心（離心半徑10.37 cm）5 min。取上清500 μl 于預冷EP 管，加入300 μl TE 緩沖液，加入300 μl 苯酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）進行萃取，4 ℃，12 000 r/min 離心（離心半徑10.37 cm）10 min。取500 μl 上清液于預冷EP 管，加入500 μl 氯仿∶異戊醇（24∶1）再次萃取，4 ℃，12 000 r/min離心（離心半徑10.37 cm）10 min。取上層水相于預冷EP管，加入3倍體積的預冷無水乙醇，1/10體積的預冷乙酸鈉，混勻，20 ℃放置過夜。取出過夜后EP 管，4 ℃，15 000 r/min離心（離心半徑10.37 cm）30 min后棄上清，70%預冷乙醇洗滌沉淀，在空氣中晾干殘余乙醇。加入20 μl TE 緩沖液充分溶解管底沉淀。Nanodrop 2000 分光光度計檢測測量eDNA濃度，eDNA含量以ng/μL表示。

2.6.實時熒光定量PCR 檢測生物被膜形成相關基因細菌總RNA 的提取根據Takara RNA 提取試劑盒說明書并稍加改進進行，cDNA 合成使用PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa），主要操作步驟：取1.0 ml 對數期培養物于離心管，8 000 r/min 離心（離心半徑10.37 cm）2 min，棄上清。加入100 μl TE Buffer，100 μl溶菌酶（20 g/L），10 μl 溶葡萄球菌素（1 mg/L），重懸菌體，37 ℃處理30 min。余下總RNA 提取根據試劑盒說明書提供的步驟進行。cDNA 的合成及實時熒光定量PCR 定量分析參考試劑盒說明書提供的步驟進行。

3.統計分析

實驗結果采用GraphPad Prism 8.0 軟件作圖及進行統計分析，符合正態分布的實驗數據均以均數±標準差（±s）表示；兩組間數據比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）；P＜0.05 表示差異有統計學意義。

結果

1.白藜蘆醇MIC及最低殺菌濃度的測定

采用96 孔板法檢測白藜蘆醇對金黃色葡萄球菌SYN的抑菌活性，結果顯示，1 024 mg/L 白藜蘆醇濃度下的孔板溶液為澄清狀態，濃度梯度8 mg/L 到512 mg/L 的孔板溶液為渾濁狀態，結果表明白藜蘆醇對SYN 的MIC 為1 024 mg/L。

2.白藜蘆醇的動態抑菌曲線

為測定不同濃度白藜蘆醇對金黃色葡萄球菌生長的影響，因此評估了1/2MIC（512 mg/L）、1/4MIC（256 mg/L）、1/8MIC（128 mg/L）濃度的白藜蘆醇對SYN 生長和生存能力的影響，結果如圖1 所示，DMSO 對細菌的生長幾乎沒有影響，128 mg/L 白藜蘆醇作用下的菌株的生長曲線基本與未加入藥物的對照組一致，隨著白藜蘆醇藥物濃度的增加，對金黃色葡萄球菌的抑制作用也在增強。后續研究亞抑菌濃度白藜蘆醇對金黃色葡萄球菌SYN生物被膜形成的影響選擇128 mg/L的白藜蘆醇處理細菌。

圖1 不同亞抑菌濃度白藜蘆醇下金黃色葡萄球菌SYN的生長曲線

3.不同濃度白藜蘆醇對生物被膜形成的影響

通過微量稀釋法和結晶紫染色法檢測2～512 mg/L 白藜蘆醇對SYN 生物被膜形成的影響。實驗結果如圖2 所示，白藜蘆醇可以顯著增強SYN生物被膜的形成，且呈濃度依賴性，濃度越高，生物被膜形成量越多。

圖2 白藜蘆醇對SYN 菌株生物被膜的增強作用。A：不同濃度白藜蘆醇對SYN 菌株生物被膜影響的吸光度值；B：不同濃度白藜蘆醇對SYN菌株生物被膜的結晶紫染色

4.亞抑菌濃度白藜蘆醇對胞外多糖生成及eDNA 釋放的影響

胞外多糖是生物被膜EPS 中最主要的成分，通過苯酚濃硫酸法測定亞抑菌濃度白藜蘆醇對SYN 胞外多糖的影響。亞抑菌濃度白藜蘆醇可促進SYN 中的胞外多糖生成。生物被膜形成過程中，膜內死亡的細菌會釋放eDNA，eDNA對細菌附著于載體表面及細菌之間的黏附起重要作用。結果如圖3 所示，與對照組相比，亞抑菌濃度白藜蘆醇可以增強eDNA釋放。

圖3 亞抑菌濃度白藜蘆醇對SYN菌株生物被膜的影響。A：亞抑菌濃度白藜蘆醇對胞外多糖生成的影響；B：亞抑菌濃度白藜蘆醇對eDNA釋放的影響

5.qRT-PCR 檢測亞抑菌濃度白藜蘆醇對生物被膜相關基因表達量的影響

我們測定了亞抑菌濃度白藜蘆醇作用下生物被膜相關基因的差異表達，結果如圖4 所示。亞抑菌濃度白藜蘆醇作用下icaA、fnbA、clfA表達水平無明顯差異，但是saeR、saeS、nuc、lrgA表達水平顯著降低。

圖4 亞抑菌濃度白藜蘆醇對SYN菌株生物被膜形成和調節相關基因表達的影響

討論

細菌生物被膜是細菌在生長過程中為適應生存環境的變化而附著于生物或非生物表面而形成的一種由自身產生的胞外聚合物及基質網包裹的有三維結構的菌細胞群體［6］。金黃色葡萄球菌形成生物被膜的能力是其引起復合型感染的重要特征，尤其是導管和移植物相關的體外材料［6］。生物被膜的生長使得細菌在醫院環境中和宿主感染時更好地存活，是導致金黃色葡萄球菌反復感染，難以治療的重要原因之一［6］。金黃色葡萄球菌生物被膜由復雜的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）組成，包括PIA、eDNA和蛋白質［17］。

白藜蘆醇具有多種生物活性，包括抗癌活性、免疫調節、預防心血管疾病、抗氧化、抗病毒作用及抗菌活性［13］。白藜蘆醇對革蘭氏陽性菌的抗菌活性大于對革蘭氏陰性菌的抗菌活性［14］。本研究中，我們發現白藜蘆醇可顯著增強金黃色葡萄球菌生物被膜的形成，并且隨著藥物濃度的增加，生物被膜形成能力增強。進一步研究發現，白藜蘆醇通過增加eDNA 釋放來誘導生物被膜的形成。Whitchurch等［17］首次在銅綠假單胞菌中研究了eDNA 在生物被膜形成中的作用。eDNA 在細菌生物被膜的形成、粘附和穩定性中起著關鍵作用［18］。金黃色葡萄球菌eDNA 形成過程中涉及的調控網絡十分復雜，金黃色葡萄球菌穿孔素CidA、抗穿孔素LrgAB、自溶酶Yycl 等參與eDNA 的釋放，雙組分系統（Agr、SaeRS、WalKR、SrrAB）和全局調節因子（SigB、SarA、MgrA）也直接和/或間接調節eDNA 的釋放［16］。金黃色葡萄球菌SaePQRS 調控系統由組氨酸激酶SaeS、應答調節因子SaeR、膜蛋白SaeP 和脂蛋白SaeQ 組成［19］。SaeRS 調控溶血素、白細胞殺傷素、蛋白酶、核酸酶和纖連蛋白結合蛋白等多種毒力因子的表達。金黃色葡萄球菌eDNA 可由耐熱核酸酶降解，編碼耐熱核酸酶的基因nuc突變后，金黃色葡萄球菌生物被膜形成能力增強［20］。nuc基因的表達受SaePQRS 調控系統的調控，在SaeRS 敲除菌株中，nuc基因的表達水平明顯下降。EMSA 實驗證明。SaeR 能直接與nuc啟動子區域結合，從而正調控nuc的表達［21］。研究顯示，亞抑菌濃度白藜蘆醇作用下，金黃色葡萄球菌lrgA、saeR表達顯著下調，且saeR基因在不同亞抑菌濃度白藜蘆醇作用下受到抑制，并且隨著藥物濃度的增加，抑制能力增強［13］。細胞裂解和DNA 釋放在生物被膜發育的初始階段對生物被膜附著至關重要，并且eDNA在生物被膜成熟過程中仍然是重要的基質成分。金黃色葡萄球菌抗穿孔素lrgAB操縱子由2個共轉錄的基因lrgA和lrgB組成。LrgA可以抑制細菌水解酶，減少eDNA 的釋放，從而抑制生物被膜的形成。LrgAB基因突變可增加的生物被膜粘附性和基質相關的eDNA［22］。本研究顯示，在亞抑菌濃度白藜蘆醇作用下，saeR、saeS以及lrgA基因表達顯著下調，與文獻研究一致。同時，受SaeRS 調控的nuc基因表達也顯著性下調，而這些結果提示，白藜蘆醇可能通過下調SaeRS 進而導致nuc的低表達，同時lrgA的低表達導致細胞裂解和eDNA釋放加速，進一步增強生物被膜的形成。

總之，本研究表明，白藜蘆醇可能通過抑制二元調控系統SaeRS 降低耐熱核酸酶的表達以及降低LrgA 的水平，從而增加eDNA的釋放，強烈促進金黃色葡萄球菌生物被膜的產生。這提示白藜蘆醇應用于臨床，可能會促進金黃色葡萄球菌慢性持續性感染的風險。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突