SUMO特異性蛋白酶1和ER在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中的表達和兩者之間關系的研究

李云輝 朱博文 崔鑫

1洛陽市中心醫(yī)院婦科，洛陽 471000；2洛陽市第三人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，洛陽 471002；3洛陽市中心醫(yī)院病理科，洛陽 471000

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，好發(fā)于圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后女性。中國每年有接近8 萬的新發(fā)病例，致死率僅次于卵巢癌和宮頸癌［1］，嚴重危害女性的健康。雖然子宮內(nèi)膜癌的診治已進入分子檢測時代，但是由于基層醫(yī)院條件限制，分子實驗室以及人才梯隊尚未成熟，往往更多地依賴于傳統(tǒng)組織學分型，傳統(tǒng)組織學分為Ⅰ型和Ⅱ型［2］。I型子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生主要與雌激素（ER）相關，在I 型子宮內(nèi)膜癌中最常見的組織學類型為子宮內(nèi)膜樣腺癌。子宮內(nèi)膜樣腺癌的病因及發(fā)病機制尚未明確。目前，研究發(fā)現(xiàn)PTEN、PAX-2、P53等基因突變及微衛(wèi)星不穩(wěn)定性均與其發(fā)病密切相關［3-5］。

小泛素相關修飾物（small ubiquitin related modifier，SUMO）是一種主要位于真核生物中高度保守的能夠參與蛋白質(zhì)小泛素化相關修飾的一類蛋白［6］，把SUMO蛋白通過與底物蛋白的共價結(jié)合調(diào)節(jié)靶蛋白的功能這一過程稱為SUMO 化修飾［7］。SUMO 化修飾是一個動態(tài)可逆的過程。逆反應是指把SUMO 蛋白和靶蛋白分離的過程，在這個逆反應過程中SUMO 特異性蛋白酶（SUMO-specific proteases，SENPs）發(fā)揮著關鍵作用。SENPs 參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展［8］。在SENPs 家族中，SENP1 是最重要也是目前研究最多的一種，它能夠催化大量SUMO 和靶蛋白分離。研究發(fā)現(xiàn)：SENP1 在結(jié)直腸癌、前列腺癌、膀胱癌等組織中高表達［9-11］，但其在子宮內(nèi)膜癌中的表達以及是否和ER 的表達存在相關性尚無相關報道。因此，本研究擬通過相關試驗研究分析SENP1 和ER 在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的表達和兩者之間的關系，探討SUMO 化修飾在子宮內(nèi)膜樣腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，進一步探索子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機制，為患者的治療提供依據(jù)。

材料與方法

1.主要材料和試劑

正常子宮內(nèi)膜上皮細胞株，子宮內(nèi)膜癌細胞株（ishikawa），DMEM 細胞培養(yǎng)基，（Gibco 公司，美國），胎牛血清（Gibco 公司，美國），F(xiàn)ast SYBR Green 聚合酶鏈式反應（PCR）試劑盒（天根生化科技有限公司，中國），BCA 蛋白定量試劑盒和增強型RIPA 裂解液（博士徳公司，中國），SENP1 抗體（EPR3844；Abcam，英國），GAPDH 抗體（Abcam，英國），DAB（威佳科技，中國），山羊血清封閉液（浩然生物科技，中國），蘇木素（博谷生物科技，中國），F(xiàn)ulvestrant（氟維司群，MCE）。

2.方法

2.1.臨床樣本收集 選取2018 年10 月至2020 年10 月在洛陽市中心醫(yī)院行手術切除的子宮內(nèi)膜樣腺癌組織和正常子宮內(nèi)膜組織各80 份，把收集到的標本分別進行SENP1（工作濃度1∶700）和ER（工作濃度1∶400）免疫組化染色。收集患者病例信息，對患者進行長期隨訪，詳細了解患者的治療情況及預后情況。所有標本的病理診斷及免疫組化的判讀均由洛陽市中心醫(yī)院病理科2 位副主任醫(yī)師獨立證實。

本 研 究 經(jīng) 醫(yī) 學 倫 理 委 員 會 審 批 通 過（LWLL-20230216）。

2.2.細胞培養(yǎng)與篩選 正常子宮內(nèi)膜上皮細胞和ishikawa 分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5% CO2，且飽和濕度。根據(jù)細胞生長情況，約每3 d 按1∶2 比例進行細胞傳代，分為試驗組和對照組，試驗組加入氟維司群（儲備液濃度10 μmol/L，每毫升DMEM培養(yǎng)基加入1 μl儲備液），作用時間48 h。

2.3.RNA 提取和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測SENP1 和ER 的mRNA 的表達量 將培養(yǎng)24 h 后的細胞使用Trizol 裂解提取總RNA。通過Nano Drop 2000 分光光度計測定總RNA 的濃度和純度。使用天根生物試劑盒逆轉(zhuǎn)錄總RNA 合成cDNA，并添加去DNA 試劑以消除基因組DNA 污染。采用SYBR Green Ⅰ熒光染料法進行PCR，擴增條件如下：95 ℃預變性5 min，隨后94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s 和72 ℃ 30 s，共40 個循環(huán)。通過熔解曲線分析驗證PCR 的擴增效率。使用2-ΔΔCt 方法計算靶基因的相對表達水平，PCR 引物序列如下。 ER 引物序列：正向引物GGGAAGTATGGCTATGGAATCTG， 反向引物TGGCTGGACACATATAGTCGTT。SENP1引物序列：正向引物 AAGATTCCCAGACTCCAACTCCCA， 反 向 引 物TGAATGTTCCCGCTCCTGCAAT。

2.4. 蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blotting）檢測SENP1 和ER 蛋白表達水平 按照試驗分組和對照組分別給予相應藥物濃度處理；48 h 后用加有200 mmol/L N-乙基馬來酰亞胺的裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，用4%～20%分離膠進行蛋白分離，冰浴下120 V 轉(zhuǎn)膜90 min，室溫下將膜置于5%脫脂奶粉中封閉1 h，然后分別加入抗體SENP1（1∶1 000）、ER（1∶2 000），4 ℃環(huán)境下孵育過夜，次日以1∶500稀釋的二抗孵育1 h，以超信號蛋白檢測試劑盒檢測蛋白表達，凝膠成像系統(tǒng)掃描光密度值，Image J 軟件進行定量分析。以GAPDH（1∶1 000）為內(nèi)對照，以目的蛋白條帶GAPDH 蛋白條帶的比值計量各蛋白表達水平。

3.統(tǒng)計學分析

運用GraphPad Prism 9 軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，相關分析采用Pearson相關系數(shù)，計量資料符合正態(tài)分布，所有實驗均重復3 次，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1.SENP1和ER在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中高表達

子宮內(nèi)膜樣腺癌組織SENP1 和ER 蛋白表達高于正常子宮內(nèi)膜組織，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖1、圖2、表1。

圖1 小泛素相關修飾物特異性蛋白酶1在正常子宮內(nèi)膜組織中的表達（免疫組織化學染色 ×100倍）

圖2 小泛素相關修飾物特異性蛋白酶1 在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達（免疫組織化學染色 ×100倍）

2.RT-PCR檢測結(jié)果

子宮內(nèi)膜癌細胞SENP1 和ER 表達均高于正常子宮內(nèi)膜上皮。通過采用ER特異性抑制劑（氟維司群）抑制ER的表達后，SENP1 在子宮內(nèi)膜癌細胞株中mRNA 的表達量明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖3、圖4。

圖3 SENP1、ER 在正常子宮內(nèi)膜上皮、子宮內(nèi)膜癌細胞中的表達

圖4 子宮內(nèi)膜癌細胞中加入ER 抑制劑前后SENP1、ER的表達

3.Western blotting結(jié)果

SENP1 和ER 在子宮內(nèi)膜癌細胞中的蛋白表達均高于正常子宮內(nèi)膜上皮細胞中［（0.11±0.04）比（1.04±0.06）、（0.67±0.10）比（1.57±0.5）］；加入氟維司群抑制ER 的表達后，SENP1在子宮內(nèi)膜癌細胞株中的蛋白表達明顯下降，子宮內(nèi)膜癌細胞組SENP1 和ER 蛋白相對水平高于子宮內(nèi)膜癌細胞+抑制劑組［（1.11±0.06）比（0.14±0.04）、（0.65±0.06）比（0.18±0.05）］，兩者之間具有正相關性，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見圖5、圖6。

圖5 SENP1、ER 在子宮內(nèi)膜癌細胞組和正常子宮內(nèi)膜上皮細胞組中的表達

圖6 SENP1、ER 在子宮內(nèi)膜癌細胞組和子宮內(nèi)膜癌細胞+抑制劑組中的表達

討論

蛋白質(zhì)的翻譯后修飾（post-translational modifications，PTMs）是蛋白質(zhì)功能調(diào)控的重要方式，在多種細胞信號轉(zhuǎn)導和生物學發(fā)育過程種發(fā)揮著重要作用。PTMs 方式多樣，主要包括甲基化、磷酸化、乙酰化、泛素化、類泛素化等［12］。SUMO 是一種在真核生物中廣泛存在且高度保守的類泛素蛋白，通過與底物蛋白共價結(jié)合動態(tài)可逆性修飾靶蛋白，這一動態(tài)可逆的過程稱為SUMO 化修飾［7］。SUMO 化修飾作為一種重要的類泛素化蛋白修飾，參與調(diào)節(jié)靶蛋白細胞定位和功能，調(diào)節(jié)細胞核內(nèi)蛋白的定位和轉(zhuǎn)錄因子的活性。SUMO 修飾的異常調(diào)控與腫瘤性疾病、病毒感染性疾病、代謝性疾病等密切相關［8］。去SUMO 化的過程是指通過去SUMO化酶的作用把SUMO亞基從底物蛋白上解離的過程。在去SUMO 化酶中，SENPs 家族是最重要的一類，發(fā)揮著關鍵作用。在SENPs 家族成員中，SENP1 是最先被引用和報道的，也是研究最多的一種。SENP1參與修飾廣泛的底物，能夠催化大量SUMO化蛋白去SUMO化［13-14］。

子宮內(nèi)膜癌傳統(tǒng)分型包括世界衛(wèi)生組織組織學分型及Bokhman分型。Bokhman分型根據(jù)是否與雌激素相關，將子宮內(nèi)膜癌分為Ⅰ型和Ⅱ型［2］。Ⅰ型為雌激素依賴性，主要是由雌激素長期刺激導致，在圍絕經(jīng)期或絕經(jīng)后女性中發(fā)病率較高。I型子宮內(nèi)膜樣癌早期常缺乏明顯的臨床癥狀，容易被忽視，致使一部分患者確診時已錯過最佳的治療時機。目前，研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的高危因素主要包括雌激素用藥史、他莫昔芬用藥史、不孕癥、肥胖、惡性腫瘤病史或家族史等［15］，但是具體發(fā)病機制仍存在很多爭議。研究比較多的靶點主要有PTEN 的缺失、TP53突變、DNA 錯配修復（MMR）蛋白缺失、POLE突變等［16-18］。

SENP1 與多種腫瘤的發(fā)生密切相關。在不同的腫瘤中，SENP1的靶點也存在多樣性：在前列腺癌中的靶點主要是作用于前列腺素受體和剪接因子相關蛋白；在睪丸癌中主要調(diào)節(jié)生殖干細胞轉(zhuǎn)錄因子OCT4 的蛋白活性［19-20］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)：SENP1在子宮內(nèi)膜樣腺癌中高表達，但是具體機制尚未深入探究。我們推測：在子宮內(nèi)膜樣腺癌中，SENP1 和ER 存在相關性，共同促進了腫瘤的發(fā)生。本研究通過氟維司群抑制ER的表達，發(fā)現(xiàn)SENP1無論是蛋白水平還是mRNA 水平均顯著下降，故證實SENP1 在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的作用與ER 有關，并且可能發(fā)揮著協(xié)同作用。下一步我們將繼續(xù)探究SENP1對子宮內(nèi)膜樣腺癌生物學功能的影響，以期能夠更深入地了解SENP1 在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的作用機制。

綜上所述，SENP1 在子宮內(nèi)膜樣腺癌中高表達，并且SENP1對子宮內(nèi)膜樣腺癌的作用與ER 是正相關的，但其具體的作用機制仍需進一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突