仿刺參β-胸腺素基因的克隆和表達分析

孫紅娟,蔣經偉,董 穎,高 杉,關曉燕,陳 仲,王 擺,潘泳嘉,肖 瑤,姜萍哲,李佩佩,張宸瑜,周遵春

( 遼寧省海洋水產科學研究院,遼寧省海洋水產分子生物學重點試驗室,遼寧 大連 116023 )

胸腺素是具有生物活性的多肽,是從小牛胸腺中提取出來的,按照等電點(PI)分為α(PI<5)、β(57)亞型[1]。該家族從低等棘皮動物到高等脊椎動物均為高度保守的,但是在細菌和其他微生物中尚未發現[2]。β-胸腺素家族分子質量約5 ku,由40～44個氨基酸組成,在生物體內的表達具有物種特異性。β-胸腺素能夠調節肌動蛋白濃度,參與細胞骨架重排以及細胞的分化、遷移等細胞活動[3-4]。另外β-胸腺素作為抗菌肽,也具有抗菌和抗病毒等方面的活性。

仿刺參(Apostichopusjaponicus)屬棘皮動物門海參綱仿刺參屬,因其缺乏適應性免疫系統,只能依靠先天性免疫系統抵御外界病原刺激[5]。抗菌肽在先天性免疫系統中發揮著至關重要的作用。胸腺素作為抗菌肽家族中的一員,在仿刺參中的作用機制尚無研究報道。研究仿刺參β-胸腺素的結構特征以及在病原菌刺激后是否參與機體的免疫應答,將為仿刺參活性多肽的研究提供材料,同時為仿刺參養殖過程中的病害防控以及生態調控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 組織和發育樣品

試驗用仿刺參取自遼寧省海洋水產科學研究院引育種中心,體質量(6.0±1.5) g,養殖水溫16～18 ℃,鹽度29,pH 8.3～8.5。試驗共取6種組織,包括體壁、肌肉、管足、呼吸樹、腸道和體腔細胞。不同發育時期包括受精卵、囊胚、原腸胚、小耳幼體、中耳幼體、大耳幼體、樽型幼體、五觸手幼體和稚參。

1.1.2 免疫菌株

免疫刺激試驗采用從仿刺參腐皮綜合征病灶處分離出來的4種病原菌:希瓦氏菌(Shewanellabaltica)、假交替單胞菌(Pseudoalteromonasnigrifacien)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)和燦爛弧菌(Vibriosplendidus)。4種病原菌均在2216E培養基中,于28 ℃,150 r/min條件下培養。當密度達到108cfu/mL時,可用于免疫刺激。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因全長克隆

用動物組織RNA提取試劑盒(TIANGEN)提取仿刺參體腔細胞RNA,以前期轉錄組測序得到的部分仿刺參β-胸腺素序列為基礎,采用SMARTer 5′/3′RACE試劑盒(Clontech)對該基因5′端進行克隆,3′端的克隆采用3′-Full Race PrimeScripTMRTase試劑盒(Takara),RACE特異引物(GSP)見表1。反應體系見表2。

表2 仿刺參β-Thymosin的RACE PCR反應體系Tab.2 RACE PCR system of Ajβ-thymosin

1.2.2 生物信息學分析

在美國國家生物技術信息中心網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)進行開放閱讀框的預測和保守結構域分析;采用Expert Protein Analysis Systerm(http://www.expasy.org/tools/)進行核酸和氨基酸序列的翻譯;在SMART平臺(http://smart.embl-heidelberg.de/)進行蛋白二級結構預測。采用MEGA 4.0軟件對不同物種氨基酸序列進行比對后構建系統發育進化樹,自展值設置為1000次重復。

1.2.3 仿刺參免疫

將同一批次的300頭健康仿刺參平均分為5組:對照組與4個免疫刺激組。試驗采用滅菌注射器對仿刺參進行體腔注射,對照組注射滅菌海水,刺激組分別注射不同的菌液。試驗采用的注射劑量均為100 μL/頭[6]。每組在注射后4、24、48、72 h和96 h分別選取9頭仿刺參解剖并獲取體腔液,隨機分成3份,每3頭混合成1份,4 ℃,3000 r/min(離心半徑10 cm)離心10 min,棄上清液收集體腔細胞保存用于RNA提取。

1.2.4 熒光定量試驗

使用PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)試劑盒對總RNA進行反轉錄。反轉錄后獲得cDNA樣品。使用TB GreenTMPremix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒進行實時熒光定量PCR,以 Cytb作為內參基因(表1)[7]。反應體系為:0.4 μL ROX Reference Dye Ⅱ(50×),1 μL cDNA 模板,10 μL TB Green Premix Ex Taq (Tli RNase H Plus) (2×Conc.),正、反引物各0.8 μL,7 μL dH2O。每個樣本重復3次。采用 2-ΔΔCt法對實時熒光定量PCR所獲取的Ct值進行分析。不同組之間表達差異水平采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析和鄧肯多重比較,P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 仿刺參β-胸腺素基因結構分析

根據仿刺參β-胸腺素已知的部分序列,設計3′和5′末端引物(表1),采用RACE法進行克隆,將得到的3′和5′末端序列和已知序列進行拼接,獲得仿刺參β-胸腺素的mRNA全長1877 bp,命名為Ajβ-Thymosin。序列提交至美國國家生物技術信息中心數據庫,獲得登錄號:MF989226。開放閱讀框(ORF)長126 bp,翻譯后氨基酸序列為41個,分子量為4.6 ku,理論等電點為5.25,結構分析發現存在保守的β-胸腺素肌動蛋白結合基序(THY),不存在跨膜結構(圖1)。

圖1 仿刺參β-胸腺素的序列(a)和結構(b、c)分析Fig.1 Sequence (a) and structure (b, c) analyses of Ajβ-thymosina.灰色標記部分為開放閱讀框,黃色標記部分為G-actin 結合結構域,紅色氨基酸序列為保守功能區; b、c分別為功能結構域和二級結構.a.the ORF and G-actin binding residues are highlighted in grey and yellow, respectively; the red amino acid sequence is conservative functional residues; b and c. the functional structure and secondary structure, respectively.

2.2 仿刺參β-胸腺素蛋白序列的進化分析

將Ajβ-Thymosin基因的氨基酸序列和其他物種的氨基酸序列(表3)進行比對分析發現,在仿刺參β-胸腺素中存在著保守的功能序列EVASFDKSKLK(9-19)[8]和保守的G-actin 結合結構域LKKTET[9](圖1)。系統進化分析顯示Ajβ-Thymosin基因和紫色球海膽(Strongylocentrotuspurpuratus)、海綿和九孔鮑的β-胸腺素聚為一支(圖2)。

圖2 仿刺參β-胸腺素的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of Ajβ-thymosin

表3 不同物種β-胸腺素的氨基酸序列Tab.3 The amino acid sequence of β-thymosin from different species

2.3 仿刺參β-胸腺素在不同組織和不同發育時期的表達模式

實時熒光定量PCR測得Ajβ-Thymosin基因在不同組織的表達結果見圖3。Ajβ-Thymosin基因在體腔細胞和呼吸樹中高表達,并且與腸道、管足、肌肉和體壁組織中的表達量存在顯著差異。β-胸腺素在仿刺參不同發育時期的表達結果見圖4。Ajβ-Thymosin基因在受精卵期、原腸胚期和囊胚期低表達,從小耳幼體期開始顯著上調,并且在稚參期Ajβ-Thymosin基因的表達量達到最高。

圖3 β-胸腺素基因在仿刺參不同組織中的表達模式Fig.3 Expression level of Ajβ-thymosin at different tissues in sea cucumber A. japonicus

圖4 β-胸腺素基因在仿刺參不同發育時期的表達模式Fig.4 Expression level of Ajβ-thymosin at different developmental stages in sea cucumber A. japonicus

2.4 不同病原菌刺激后仿刺參β-胸腺素基因的表達變化

采用4種病原菌對仿刺參進行免疫刺激,檢測體腔細胞中Ajβ-Thymosin基因在刺激后4、12、24、48、72、96 h的表達變化情況(圖5)。對照組注射滅菌海水,在注射后6個時間點也同時取樣。在蠟樣芽孢桿菌組中,Ajβ-Thymosin基因在4 h表達水平顯著下調,在12 h表達水平顯著上調并達到最高水平,隨后在24、48 h表達水平下調,在72 h表達水平小幅度上調后在96 h表達水平又下調(圖5a)。在希瓦氏菌組中,Ajβ-Thymosin基因在4 h表達水平也出現顯著下調,從12 h開始表達水平開始上調,在48 h表達水平達到最高,隨后在72 h表達水平開始下調,96 h表達水平顯著下調(圖5b)。在假交替單胞菌組中,Ajβ-Thymosin基因在注射后4、12 h表達水平下調,至24 h表達水平上調并達到峰值,48 h表達水平上調但是上調不顯著,在72、96 h表達水平均下調(圖5c)。在燦爛弧菌組中,Ajβ-Thymosin基因在4、12、24 h均下調,48 h表達水平顯著上調達到最高,隨即在72、96 h表達水平均下調(圖5d)。

3 討 論

抗菌肽具有廣譜抗菌作用,在非特異性免疫系統中占據著重要位置。在海參抗菌肽研究方面,Beauregard等[10]從冰島刺參(Cucumariafrondosa)體腔液中分離出一種可以抑制綠膿桿菌(Pseudomonasaruginosa)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)生長的抗菌肽。王明昌[11]從仿刺參消化道內分離出一種顯著抑制蛭弧菌的抗菌肽。筆者克隆了一種仿刺參抗菌肽Ajβ-Thymosin基因,通過序列結構、組織、發育和免疫表達分析,探索Ajβ-Thymosin基因是否具有免疫活性并且參與機體的免疫應答反應。

3.1 仿刺參β-胸腺素基因的序列特征

胸腺素廣泛地存在于脊椎動物和無脊椎動物中,目前發現至少存在15種β-胸腺素[12]。筆者在仿刺參中克隆得到了Ajβ-Thymosin基因,氨基酸序列為41個,分子質量為4.6 ku,等電點為5.25,具有高度保守的G-actin結合序列LKKTET[9],這些特征均表明Ajβ-Thymosin基因屬于β-胸腺素家族的成員。通過進化分析發現,仿刺參β-胸腺素和紫色球海膽、海綿和九孔鮑的β-胸腺素聚為一支。海膽(Paracentrotuslividus)中的β-胸腺素能夠和G-actin結合并參與機體抗菌免疫反應[8]。仿刺參和海膽β-胸腺素都有相同的保守功能結構域EVASFDKSKLK(9-19)[8],因此推測Ajβ-Thymosin基因中也具有免疫功能。

3.2 仿刺參β-胸腺素基因的功能分析

在仿刺參不同發育時期,免疫系統也處在一個動態發育的過程。Ajβ-Thymosin基因的表達量從小耳幼體期開始表達上調。小耳幼體期是仿刺參胚胎發育結束幼體發育的開始,此時消化道開始分化,免疫系統也開始形成,表明Ajβ-Thymosin基因在機體發育過程中起到關鍵作用。

β-胸腺素在不同物種體內具有組織表達特異性,在仿刺參體腔細胞中表達最高。這與β-胸腺素在斑節對蝦(Penaeusmonodon)[13]、合浦珠母貝(Pinctadafucata)[14]、皺紋盤鮑(H.discusdiscus)[15]、九孔鮑[16]、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[17]中的組織分布研究結果相似。由于體腔細胞、血淋巴細胞和血細胞在無脊椎動物中發揮免疫作用[13],因此推測Ajβ-Thymosin基因具有免疫活性。

β-胸腺素具有抗菌和抗病毒活性,許多研究發現病原體能夠引起β-胸腺素上調表達。在斑節對蝦[13]、日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)[18]、克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)[19]、長牡蠣(Crassostreagigas)[20]、皺紋盤鮑[15]、九孔鮑[16]、中華絨螯蟹[17]和卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)[21]面對細菌、病毒或免疫刺激劑刺激時,β-胸腺素的相對表達量出現了不同程度上升。仿刺參受到4種不同病原菌刺激后,Ajβ-Thymosin基因的表達量在4 h均發生下調。有研究顯示,仿刺參體內9個免疫相關基因在病原菌刺激后4 h的表達水平也均發生了下調[22-23],這表明仿刺參免疫系統中一些免疫因子在病原入侵初期會受到抑制。在蠟樣芽孢桿菌和希瓦氏菌組,Ajβ-Thymosin基因的表達量在12 h開始上調。在假交替單胞菌組,Ajβ-Thymosin基因的表達量在24 h開始上調。在燦爛弧菌組,Ajβ-Thymosin基因的表達量在48 h開始上調。Ajβ-Thymosin基因開始上調表達的時間不同可能是由不同細菌的細胞毒性不同造成的。Ajβ-Thymosin基因的動態表達模式表明其參與了仿刺參體腔細胞免疫應答的過程。

4 結 論

β-胸腺素作為一種抗菌肽,具有廣譜抗菌活性。Ajβ-Thymosin基因具有β-胸腺素家族成員特有并且高度保守的結構域,參與了仿刺參機體發育和免疫防御過程,這將為新型抗菌肽研究和病害防控提供理論支持。