異丙酚對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷的影響及其分子機(jī)制

許 杰 王 暉 溫 洪 張 艦

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院麻醉科，北京 100020

腦卒中是最常見的臨床腦血管疾病之一[1]。缺血性腦卒中可導(dǎo)致腦損傷和神經(jīng)功能障礙[2]。腦缺血/再灌注雖可挽救死亡細(xì)胞，但也可能加重細(xì)胞損傷[3]。因此，有必要探究影響腦卒中進(jìn)程的病理機(jī)制，尋找緩解腦缺血/再灌注損傷的有效策略。目前，缺氧/復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）誘導(dǎo)的大鼠PC12 細(xì)胞已經(jīng)被廣泛用于模擬腦卒中體外模型[4]，這為開展腦卒中的相關(guān)研究提供了方便。異丙酚是一種高脂溶性麻醉藥物[5]，被發(fā)現(xiàn)可緩解缺血/再灌注誘導(dǎo)的腦損傷[6]。此外，異丙酚被證實(shí)可改善神經(jīng)炎癥損傷，并可能作為腦卒中神經(jīng)保護(hù)的有效策略[7-8]。因此，揭示異丙酚調(diào)控腦卒中進(jìn)程的分子機(jī)制至關(guān)重要。微RNA（microRNA，miRNA）是腦卒中進(jìn)程的關(guān)鍵調(diào)控子。研究顯示，miR-1246 在缺血性腦卒中患者血清中高表達(dá)[9]。然而，異丙酚是否通過影響miR-1246 表達(dá)調(diào)控腦卒中進(jìn)程尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)研究異丙酚是否通過調(diào)控miR-1246 表達(dá)影響H/R 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷，為腦卒中的治療提供潛在分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

PC12 細(xì)胞（貨號(hào)：CL-0412）購自中國武漢procell；異丙酚（貨號(hào)：2078-54-8）購自Sigma-Aldrich；DMEM 培養(yǎng)基（貨號(hào)：11965092）、胎牛血清（貨號(hào)：10100147）購自Gibco；Lipofectamine3000（貨號(hào)：L300-0075）、Trizol 試劑（貨號(hào)：15596026）購自Invitrogen；逆轉(zhuǎn)錄（貨號(hào)：RR047A）和熒光定量試劑盒（貨號(hào)：DRR041A）購自TaKaRa；RIPA 裂解液（貨號(hào)：P0013B）、BCA 試劑盒（貨號(hào)：P0012S）、MTT試劑盒（貨號(hào)：C0009S）、Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：C1062S）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunoadsordent assay，ELISA）試劑盒（貨號(hào)：ml002813、ml028514、ml002859、ml028510）購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；miR-1246 模擬物及抑制劑（miR-1246 和anti-miR-1246）購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；B 淋巴細(xì)胞瘤-2（B lymphocyte-2，Bcl-2）抗體（貨號(hào)：ab32124）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2關(guān)聯(lián)x 蛋白（B lympho-blastoma-2 associated with x protein，Bax）抗體（ab32503）、GAPDH 抗 體（貨 號(hào)：ab9485）與HRP 羊抗兔IgG（貨號(hào)：ab205718）購自Abcam。

1.2 H/R 處理與分組

將PC12 細(xì)胞分為七組：control 組（正常條件21%O2/5%CO2/74%N2培養(yǎng)）、H/R 組（缺氧條件3%O2/5%CO2/92%N2培養(yǎng)2 h，正常條件下培養(yǎng)12 h）、H/R+異丙酚組（用50 μmol/L 異丙酚預(yù)處理1 h[6]后用H/R 處理）、H/R+anti-miR-NC 組（轉(zhuǎn)染anti-miR-NC 后用H/R處理）、H/R+anti-miR-1246 組（轉(zhuǎn)染anti-miR-1246后用H/R 處理）、H/R+異丙酚+miR-NC 組（轉(zhuǎn)染miR-NC，再經(jīng)50 μmol/L 異丙酚和H/R 處理）、H/R+異丙酚+miR-1246 組（轉(zhuǎn)染miR-1246，再經(jīng)50 μmol/L異丙酚和H/R 處理）。上述組別進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)時(shí)，每組均設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染步驟根據(jù)Lipofectamine3000 的說明書進(jìn)行。

1.3 MTT 檢測(cè)細(xì)胞活力

PC12 細(xì)胞用不同濃度（0、25、50、100 μmol/L）的異丙酚預(yù)處理1 h，然后用H/R 處理。取各組細(xì)胞（1×105個(gè)/ml），接種于96 孔板（100 μl/孔）培養(yǎng)48 h，每組6 個(gè)復(fù)孔，然后與MTT 溶液孵育4 h，與Formazan溶解液孵育4 h。在570 nm 測(cè)定吸光度值（A 值），細(xì)胞存活率為相對(duì)于對(duì)照組存活率的百分比，即細(xì)胞存活率=A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組×100%[10]。

1.4 Annexin V-FITC/PI 分析凋亡率

根據(jù)Annexin V-FITC/PI 試劑盒說明書，PC12 細(xì)胞用Binding Buffer 重懸，然后與Annexin V-FITC 和PI 孵育15 min。最后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.5 Western blot 分析蛋白水平

RIPA 裂解液提取總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE 電泳后，蛋白被轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。膜經(jīng)封閉后與一抗（anti-Bcl-2 稀釋1∶1 000、anti-Bax 稀釋1∶1 000、anti-GAPDH稀釋1∶2 500）孵育，然后與HRP 羊抗兔IgG（稀釋1∶50 000）孵育。最后，用ECL 溶液顯示蛋白條帶，Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.6 ELISA 分析炎癥因子水平

根據(jù)ELISA 試劑盒說明書，檢測(cè)腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-18 和IL-10 在PC12 細(xì)胞培養(yǎng)基中的水平。

1.7 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR）

總RNA 用Trizol 試劑提取，然后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。用熒光定量試劑盒進(jìn)行RT-PCR。引物序 列：miR-1246 正向引物：5’-TGAAGTAGGACTGGGCAGAGA-3’，反向引物：5’-TTTGGGTCAGGTGTCCACTC-3’；U6 正向引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.5 μl，MgSO42.5 μl，dNTPs 2.5 μl，正反向引物各0.5 μl，cDNA 2 μl，RNase-Free ddH2O 補(bǔ)足體系至25 μl；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40 次循環(huán)。以U6 為內(nèi)參，miR-1246 的相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組比較采用t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度異丙酚對(duì)H/R 處理PC12 細(xì)胞活力的影響

與control 組比較，H/R 組PC12 細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.05）。與H/R 組比較，采用異丙酚處理后的細(xì)胞存活率上升（P＜0.05），且50 μmol/L 異丙酚處理時(shí)細(xì)胞存活率最高（圖1）。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)，異丙酚濃度選擇50 μmol/L。

圖1 不同濃度異丙酚對(duì)H/R 處理PC12 細(xì)胞活力的影響（n=6）

2.2 異丙酚對(duì)H/R 處理PC12 細(xì)胞損傷的影響

與control 組比較，H/R 組細(xì)胞凋亡率、Bax 蛋白、TNF-α、IL-1β 和IL-18 水平升高，Bcl-2 蛋白和IL-10水平降低（P＜0.05）。與H/R 組比較，H/R+異丙酚組細(xì)胞凋亡率、Bax 蛋白、TNF-α、IL-1β 和IL-18 水平降低，Bcl-2 蛋白和IL-10 水平升高（P＜0.05）。見圖2，表1。

表1 異丙酚對(duì)H/R 處理PC12 細(xì)胞損傷的影響（，n=3）

表1 異丙酚對(duì)H/R 處理PC12 細(xì)胞損傷的影響（，n=3）

注 與control 組比較，aP＜0.05；與H/R 組比較，bP＜0.05。H/R：缺氧/復(fù)氧；Bcl-2：B 淋巴細(xì)胞瘤-2；Bax：B 淋巴細(xì)胞瘤-2 關(guān)聯(lián)x 蛋白；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL：白細(xì)胞介素

圖2 異丙酚對(duì)H/R 處理PC12 細(xì)胞凋亡的影響

2.3 異丙酚對(duì)miR-1246 表達(dá)的影響

與control 組比較，H/R 組中miR-1246 表達(dá)升高（P＜0.05）。與H/R 組比較，H/R+異丙酚組中miR-1246表達(dá)降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3 異丙酚對(duì)H/R 處理PC12 細(xì)胞中miR-1246 表達(dá)的影響（n=3）

2.4 miR-1246 抑制劑對(duì)細(xì)胞損傷的影響

H/R 組與H/R+anti-miR-NC 組miR-1246 水平、細(xì)胞凋亡率、Bcl-2 蛋白、Bax 蛋白、TNF-α、IL-1β、IL-18、IL-10 水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與H/R+anti-miR-NC 組比較，H/R+anti-miR-1246 組miR-1246 水平、細(xì)胞凋亡率、Bax 蛋白、TNF-α、IL-1β和IL-18 水平降低，Bcl-2 蛋白和IL-10 水平升高（P＜0.05）。見圖4，表2。

表2 抑制miR-1246 對(duì)H/R 處理PC12 細(xì)胞損傷的影響（，n=3）

表2 抑制miR-1246 對(duì)H/R 處理PC12 細(xì)胞損傷的影響（，n=3）

注 與H/R+anti-miR-NC 組比較，aP＜0.05。H/R：缺氧/復(fù)氧；Bcl-2：B 淋巴細(xì)胞瘤-2；Bax：B 淋巴細(xì)胞瘤-2 關(guān)聯(lián)x 蛋白；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL：白細(xì)胞介素

圖4 抑制miR-1246 對(duì)H/R 處理PC12 細(xì)胞凋亡的影響

2.5 過表達(dá)miR-1246 逆轉(zhuǎn)異丙酚對(duì)H/R 處理PC12細(xì)胞損傷的影響

H/R+異丙酚組與H/R+異丙酚+miR-NC 組miR-1246 水平、細(xì)胞凋亡率、Bcl-2 蛋白、Bax 蛋白、TNF-α、IL-1β、IL-18、IL-10 水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與H/R+異丙酚+miR-NC 組比較，H/R+異丙酚+miR-1246 組miR-1246 表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率、Bax 蛋白及TNF-α、IL-1β、IL-18 水平升高，Bcl-2 蛋白和IL-10 水平降低（P＜0.05）。見圖5，表3。

表3 miR-1246 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了異丙酚對(duì)H/R 處理PC12 細(xì)胞損傷的影響（，n=9）

表3 miR-1246 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了異丙酚對(duì)H/R 處理PC12 細(xì)胞損傷的影響（，n=9）

注 與H/R+異丙酚+miR-NC 組比較，aP＜0.05。H/R：缺氧/復(fù)氧；Bcl-2：B 淋巴細(xì)胞瘤-2；Bax：B 淋巴細(xì)胞瘤-2 關(guān)聯(lián)x 蛋白；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL：白細(xì)胞介素

圖5 過表達(dá)miR-1246 逆轉(zhuǎn)了異丙酚對(duì)H/R 處理PC12 細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

PC12 細(xì)胞具有神經(jīng)細(xì)胞的一般特征，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)生理和神經(jīng)藥理學(xué)研究，且近年來多被用于在細(xì)胞水平模擬臨床腦卒中過程[11-12]。在本研究，H/R 處理PC12 細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。另外，異丙酚通過降低miR-1246 表達(dá)抑制H/R 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，這為異丙酚治療腦卒中提供了新的證據(jù)。

研究表明，異丙酚可減輕多種細(xì)胞損傷，具有抑制炎癥反應(yīng)和凋亡等作用[13]。既往的研究顯示，異丙酚處理可緩解細(xì)胞炎癥和凋亡[14-15]，并改善腎缺血/再灌注損傷[16]。此外，異丙酚可減輕人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥和凋亡[17]，并緩解大鼠腸缺血/再灌注損傷[18]及減輕H/R 誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷[19]。本研究指出，異丙酚提高了H/R 處理PC12 細(xì)胞的存活率，降低了細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。這些結(jié)果顯示，異丙酚可緩解H/R誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷，提示異丙酚可能用于腦卒中的治療。

miR-1246 在細(xì)胞損傷相關(guān)疾病中可發(fā)揮促進(jìn)作用。在脂多糖誘導(dǎo)的小鼠成軟骨細(xì)胞ATDC5 中，下調(diào)miR-1246 則可減輕細(xì)胞的炎癥損傷[20]。沉默miR-1246 可抑制脂多糖誘導(dǎo)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和炎癥因子的產(chǎn)生[21]。這些結(jié)果表明，miR-1246 可能具有促炎和促凋亡作用。本研究結(jié)果顯示，H/R 處理PC12 細(xì)胞中miR-1246 表達(dá)升高。功能分析結(jié)果顯示，抑制miR-1246 表達(dá)可以減輕H/R 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷，這與前人報(bào)道m(xù)iR-1246 的功能是一致的[20-21]。

近年來，越來越多研究發(fā)現(xiàn)，異丙酚可通過調(diào)控相關(guān)miRNA 的表達(dá)來緩解多種細(xì)胞損傷。例如，異丙酚可通過抑制miR-449a/miR-494 表達(dá)減輕心肌細(xì)胞損傷[22-23]。異丙酚可通過調(diào)控miR-20b-5p 抑制H/R誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞死亡[24]，并通過上調(diào)miR-153緩解缺氧誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞神經(jīng)損傷[25]。本研究顯示異丙酚可降低miR-1246 表達(dá)水平，且過表達(dá)miR-1246逆轉(zhuǎn)了異丙酚對(duì)H/R 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷的影響，這提示異丙酚通過調(diào)控miR-1246 表達(dá)減輕H/R 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷。

綜上所述，本研究顯示，在H/R 誘導(dǎo)的腦卒中細(xì)胞損傷模型中，異丙酚可通過下調(diào)miR-1246 緩解H/R 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞凋亡和炎癥。這些發(fā)現(xiàn)為異丙酚治療腦卒中提供了新的證據(jù)。