FOXC2與上皮型鈣黏蛋白對老年結直腸癌患者臨床預后及細胞活性的影響

彭傳林 曹惠 朱義生 劉龍 趙學軍 陳丹

(宿州市第一人民醫院 1普外科,安徽 宿州 234000;2內鏡中心;3武漢大學基礎醫學院;4宣城市人民醫院老年科)

結直腸癌是我國老年人群中高發的惡性腫瘤,其患病率逐年增加,是急需重點防治的疾病之一〔1〕。雖然隨著近年來腫瘤治療技術的快速進步,手術、放化療等不斷完善,但每年死于結直腸癌的患者數未出現明顯下降,治療方案選擇的合理性是其中主要原因之一〔2〕。準確評估結直腸癌患者病情嚴重程度和預后是治療方案合理制定的前提。叉頭框蛋白(FOX)C2位于人類16號染色體,與對應配體結合后能夠調控下游基因表達,在食管癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中呈高表達狀態,促進腫瘤發展〔3,4〕,但在結直腸癌中的表達特點及作用的研究仍十分少見。上皮型鈣黏蛋白存在于人體上皮細胞表面,在細胞之間及細胞與基質之間的連接中發揮通訊作用〔5〕,其表達下降是引發上皮細胞去分化和高浸潤性的關鍵環節〔6〕。本研究旨在探討FOXC2與上皮型鈣黏蛋白對老年結直腸癌患者臨床預后及細胞活性的影響。

1 材料與方法

1.1研究對象 選取2018年1月至2019年3月宿州市第一人民醫院收治的老年結直腸癌患者84例。入選標準:①年齡≥60歲,經組織病理學檢查確診為結直腸癌;②首次確診,無放化療等抗腫瘤治療史;③接受手術治療,配合完成隨訪。排除標準:①合并精神性疾病者;②合并其他組織器官惡性腫瘤。其中男38例,女46例;年齡60～82歲,平均(67.58±5.61)歲;組織學分級:高分化34例,中分化32例,低分化18例;腫瘤直徑:<5 cm 52例,≥5 cm 32例;TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期47例,Ⅲ～Ⅳ期37例;淋巴結轉移48例;浸潤深度:T1～T2 52例,T3～T4 32例。本研究經醫院倫理委員會批準,患者均簽署知情同意書。

1.2細胞與主要試劑 人結直腸癌細胞系HCT116購于上海康朗生物有限公司。免疫組化檢測試劑盒購于北京百歐泰生物有限公司;血清FOXC2檢測試劑盒和血清上皮型鈣黏蛋白檢測試劑盒均購于上海谷研實業有限公司;胎牛血清,DMEM完全培養基購于上海錸博生化科技有限公司;CCK-8檢測試劑盒北京拜爾迪生物有限公司;Transwell小室購于南京迅貝生物有限公司;鼠抗人FOXC2單克隆抗體,兔鼠抗人上皮型鈣黏蛋白單克隆抗體,鼠抗人基質金屬蛋白酶2單克隆抗體,鼠抗人基質金屬蛋白酶9單克隆抗體及對應的二抗均購于上海恒遠生物有限公司。

1.3免疫組化法檢測組織標本中FOXC2、上皮型鈣黏蛋白表達 留取手術切除的結直腸癌病灶組織及術中留取距離腫瘤病灶邊緣5 cm以上的癌旁正常組織,石蠟包埋、切片。將石蠟切片烤片2 h,常規脫蠟,室溫下加入二甲苯中靜置10 min,無水乙醇中靜置5 min,95%乙醇中靜置5 min,雙蒸餾水洗滌后室溫下靜置。高壓修復抗原,磷酸緩沖液洗滌后滴加一抗,稀釋倍數均為1∶500,4 ℃冷藏過夜,次日滴加辣根過氧化物酶標記的二抗,室溫下靜置1 h,二氨基聯苯胺(DAB)顯色,復染、脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察FOXC2、上皮型鈣黏蛋白陽性染色均為黃色、棕黃色、棕褐色,FOXC2定位于細胞質,上皮型鈣黏蛋白定位于細胞膜,對陽性細胞比例和染色強度進行評分,兩項乘積0～2分為陰性,3～9分為陽性。

1.4資料收集和血清FOXC2、上皮型鈣黏蛋白濃度檢測 收集患者人口學特征及組織學分級、腫瘤直徑、TNM分期、淋巴結轉移情況、浸潤深度,術后對患者進行3年隨訪,收集生存情況。術前采集患者空腹外周靜脈血,離心收集血清,酶聯免疫吸附試驗檢測血清FOXC2、上皮型鈣黏蛋白濃度。

1.5HCT116細胞培養與轉染 人結直腸癌細胞HCT116使用含10%胎牛血清的DMEM完全培養基,在37 ℃ 5%體積的CO2培養箱中進行傳代培養。將HCT116細胞接種于6孔板中,顯微鏡下觀察細胞生長至80%融合時更換為不含血清的培養基。使用脂質體2000進行轉染,siRNA制備由北京靖瑞百康生物有限公司完成。使用無干擾活性的siRNA轉染HCT116細胞為陰性對照組,有FOXC2干擾活性的siRNA轉染HCT116細胞為FOXC2低表達組,僅加入脂質體的HCT116細胞為空白對照組。

1.6CCK-8檢測HCT116細胞增殖能力 取對數期HCT116細胞,按4×105/ml密度鋪于96孔板中,并加入含10%胎牛血清的DMEM完全培養基100 μl,常規培養24 h進行同步化處理,根據分組轉染細胞,每組設置8個復孔。轉染24、48、72 h加入濃度10%的CCK-8試劑10 μl/孔,讀取450 nm處的吸光度(OD)值。

1.7劃痕實驗檢測HCT116細胞遷移能力 取對數期HCT116細胞,按6×105/ml密度鋪于6孔板中,顯微鏡下觀察HCT116細胞生長融合度超過90%時做垂直劃痕,根據分組轉染細胞,設8個復孔。常規培養細胞24 h,觀察劃痕寬度變化并拍照,測量劃痕面積,計算HCT116細胞劃痕的愈合率。

1.8HCT116細胞侵襲能力檢測 將基底膠∶DMEM=1∶9稀釋后加入Transwell上室,體積為50 μl,常規培養6 h,將HCT116細胞按6×105/ml密度加入Transwell上室;根據分組向Transwell下室加入相應的細胞培養基,繼續培養24 h,結晶紫染色,光學顯微鏡下計數進入下室的細胞數量。

1.9Western印跡檢測細胞中FOXC2、上皮型鈣黏蛋白、基質金屬蛋白酶表達 RIPA細胞裂解各組HCT116細胞的總蛋白,測定蛋白濃度,電泳后使用電轉法將目標蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,室溫下封閉1 h,滴加一抗∶鼠抗人FOXC2單克隆抗體(稀釋倍數1∶300),兔鼠抗人上皮型鈣黏蛋白單克隆抗體(稀釋倍數1∶500),鼠抗人基質金屬蛋白酶2單克隆抗體(稀釋倍數1∶100),鼠抗人基質金屬蛋白酶9單克隆抗體(稀釋倍數1∶100),鼠抗人GAPDH單克隆抗體(稀釋倍數1∶1 000),4 ℃冷藏過夜,次日滴加二抗,稀釋倍數1∶2 000,室溫下靜置1 h,電化學發光法(ECL)顯影,讀取條帶灰度值。

1.10統計學分析 采用SPSS25.0軟件進行方差分析、t檢驗、χ2檢驗及受試者工作特征(ROC)曲線分析。

2 結 果

2.1不同組織中FOXC2與上皮型鈣黏蛋白表達情況比較 結直腸癌組織中FOXC2陽性率〔58例(69.05%)〕高于癌旁正常組織〔17例(20.24%)〕,上皮型鈣黏蛋白陽性率〔14例(16.67%)〕低于癌旁正常組織〔65例(77.38%)〕,差異有統計學意義(χ2=42.692、39.057,均P=0.000)。

2.2不同臨床病理特征患者FOXC2與上皮型鈣黏蛋白表達水平比較 TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移、浸潤深度T3～T4的結直腸癌患者FOXC2陽性率明顯升高,上皮型鈣黏蛋白陽性率明顯降低(P<0.01,P<0.05);FOXC2、上皮型鈣黏蛋白陽性率在不同性別、年齡、分化程度、腫瘤直徑的結直腸癌患者之間差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理特征患者FOXC2與上皮型鈣黏蛋白陽性表達比較〔n(%)〕

2.3不同預后水平患者血清FOXC2、上皮型鈣黏蛋白濃度比較 隨訪3年期間,84例老年結直腸癌患者生存65例(77.38%)。死亡組血清FOXC2濃度〔(41.95±5.03)ng/ml〕高于生存組〔(8.29±1.51)ng/ml〕,上皮型鈣黏蛋白濃度〔(84.60±8.25)U/L〕低于生存組〔(122.42±11.67)U/L〕,差異有統計學意義(t=28.219、32.751,均P=0.000)。

2.4血清FOXC2、上皮型鈣黏蛋白檢測對患者臨床預后的評估價值分析 ROC曲線分析顯示,血清FOXC2、上皮型鈣黏蛋白檢測對老年結直腸癌患者臨床預后具有較高的評估價值(P<0.05);其中血清FOXC2、上皮型鈣黏蛋白聯合檢測的評估價值最高曲線下面積(AUC)=0.939〕,靈敏度和陽性預測值明顯高于各指標單獨檢測。見圖1、表2。

圖1 血清FOXC2、上皮型鈣黏蛋白檢測對患者臨床預后的ROC曲線

表2 血清FOXC2、上皮型鈣黏蛋白檢測對患者臨床預后的評估價值分析

2.5各組結直腸癌細胞中FOXC2表達水平比較 FOXC2低表達組結直腸癌細胞中FOXC2 蛋白表達水平(1.15±0.13)低于陰性對照組(2.37±0.29)和空白對照組(2.41±0.35),差異有統計學意義(P<0.05),陰性對照組與空白對照組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 各組結直腸癌細胞中FOXC2蛋白表達的Western印跡

2.6各組結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲能力比較 FOXC2低表達組結直腸癌細胞增殖、遷移、侵襲水平均明顯低于陰性對照組和空白對照組,差異有統計學意義(P<0.01);陰性對照組與空白對照組差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲能力及上皮型鈣黏蛋白、基質金屬蛋白酶水平比較

2.7各組細胞上皮型鈣黏蛋白、基質金屬蛋白酶表達水平比較 FOXC2低表達組結直腸癌細胞中上皮型鈣黏蛋白表達水平明顯高于陰性對照組和空白對照組,基質金屬蛋白酶2、基質金屬蛋白酶9表達水平明顯低于陰性對照組和空白對照組,差異有統計學意義(P<0.01)。見表3。

3 討 論

目前臨床已有手術、放化療、免疫治療、靶向治療等多種抗結直腸癌治療手段,準確評估患者病情和預后對治療方案的合理制定,改善預后具有重要意義。FOXC2可影響細胞核中DNA轉錄,參與調控下游基因表達〔7〕;研究顯示,FOXC2能夠促進淋巴管和血管的新生,還作為上皮細胞間質轉化過程中的誘導因子,促進惡性腫瘤細胞發生上皮細胞間質轉化,提升細胞的轉移和侵襲能力〔8〕。基礎研究顯示,FOXC2在腫瘤細胞中伴隨間質表型蛋白高表達,而上皮型鈣黏蛋白等上皮標志物低表達〔9〕。已在食管癌、乳腺癌中發現FOXC2高表達參與病情的進展,但在結直腸癌患者中表達的研究仍十分少見。上皮型鈣黏蛋白是一種位于細胞連接面的跨膜糖蛋白,與鈣離子形成二聚體,參與調控同型細胞的黏附過程〔10〕。人上皮細胞中上皮型鈣黏蛋白是形成正常連接復合物的主要調節因子,與細胞骨架連接,胞外信號向胞內傳遞,細胞分化、生長密切相關〔11〕。

本研究結果提示,結直腸癌患者腫瘤組織中FOXC2高表達,上皮型鈣黏蛋白低表達,可能參與腫瘤的浸潤轉移過程。本文老年結直腸癌患者生存率與相關研究報道中結直腸癌患者3年生存率75.8%、78.51%基本一致〔12,13〕,說明本地區老年結直腸癌患者生存率處于平均水平。本文表明,血清FOXC2、上皮型鈣黏蛋白單獨和聯合檢測對患者臨床預后具有較高的評估價值,聯合檢測的評估價值最高,可用于老年結直腸癌患的預后評估,指導治療方案的制定。

FOXC2在多種惡性腫瘤中高表達,促進腫瘤的浸潤與遷移;還能夠上調基質金屬蛋白酶表達,維持血管穩定性,保證腫瘤生長過程中的營養供應〔14〕。FOXC2能夠參與調控內皮細胞、腫瘤干細胞的分化方向,影響細胞增殖、遷移等過程〔15〕。本研究結果提示,下調FOXC2表達能夠抑制結直腸癌細胞的生長、轉移和擴散。細胞間的黏附作用分為細胞與細胞間的黏附、細胞與基質間的黏附兩種類型;上皮型鈣黏蛋白是細胞與細胞間黏附的主要調控因子,在腫瘤組織中低表達,能夠促進腫瘤細胞的轉移和侵襲〔16〕。腫瘤細胞遷移和侵襲過程需要基質金屬蛋白酶降解相鄰胞外基質來完成。基質金屬蛋白酶2、基質金屬蛋白酶9是與腫瘤轉移關系最密切的基質金屬蛋白酶家族成員,參與腫瘤的轉移和侵襲〔17〕。本研究中下調FOXC2表達后結直腸癌細胞中上皮型鈣黏蛋白表達升高,基質金屬蛋白酶2、基質金屬蛋白酶9表達下降,提示FOXC2可能通過作用于上皮型鈣黏蛋白、基質金屬蛋白酶2、基質金屬蛋白酶9參與結直腸癌細胞的遷移和侵襲過程。