長期電子煙或傳統香煙暴露的小鼠肺臟轉錄組學差異分析

季申健 王玉秀 顧建軍 閔凌峰

(揚州大學臨床醫學院,江蘇 揚州 225001)

吸煙是全身多種疾病的獨立危險因素,如肺癌、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、冠心病及腦梗死等。電子煙是一種靠電池產生動力的裝置,在加熱時能將里面的液體變成氣體狀態,供人吸入。目前電子煙被當作戒煙工具而使用〔1〕。現在盡管電子煙裝置日益升級發展,但電子煙的主要成分不外乎包括:尼古丁、植物甘油、丙二醇和多種調味劑〔2〕。雖然研究顯示電子煙中尼古丁與慢性疾病的不良生物反應存在明顯相關性〔3〕,但國外普遍認識:①電子煙中的尼古丁等有毒物質顆粒含量較傳統香煙低,短期吸入時對人體影響小,電子煙可以作為戒煙工具使用,甚至被推廣使用。②電子煙中含有的植物甘油、丙二醇和多種調味劑一般被用作食品添加劑,但在電子煙氣溶膠中,這些加熱成分被吸入能否導致肺損傷因缺乏對照而暫未有定論,尤其在長期暴露情況下。反觀國內,體外細胞培養、動物模型的研究認為電子煙氣溶膠和液體會引起不良反應,包括炎癥、氧化應激反應和培養細胞死亡等〔4,5〕。以上事實說明電子煙對人體的危害還是存在,不能忽視,尤其長期暴露對人體肺組織的影響仍需探討。電子煙在當今很受歡迎,尤其是IQOS 品牌。最近公布的使用數據中顯示其已有顯著增長,特別在年輕人群中〔6,7〕。由于IQOS品牌是新型電子煙,且缺乏足夠多的科學證據證明其危害性,因此許多人認為電子煙是無害的,可以作為香煙的安全替代品。但是,通過對經常使用電子煙的人群進行肺泡灌洗,并對灌洗液中的基因/蛋白質集分析表明:電子煙產生的氣溶膠對人類氣道有顯著且廣泛的急慢性炎癥反應,具有明顯的肺臟毒性〔8〕,所以電子煙產生的人體危害必須引起足夠的重視。

目前研究顯示,電子煙對機體的各個系統均有一定的影響,如心血管系統〔9～11〕、神經系統〔12～14〕、呼吸系統等,尤其是呼吸系統。Park等〔15〕采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)方法分析了電子煙氣溶膠對人支氣管上皮細胞的影響,結果顯示,暴露在電子煙氣溶膠下會誘導上皮細胞纖毛相關基因的下調,導致呼吸道纖毛的功能降低,進而無法正常清除氣道黏液,造成第1秒用力呼氣容積(FEV1)下降,推測吸食電子煙同樣可產生相似COPD病理生理學改變。 Staudt等〔16〕和Cervellati等〔17〕采用微陣列方法對傳統吸煙者、電子煙使用者和不吸煙者的肺泡巨噬細胞、肺泡上皮細胞樣本進行分析,結果顯示電子煙的使用同樣改變了巨噬細胞差異基因的表達,涉及炎癥和免疫反應,導致了與傳統吸煙類似的肺部變化。以上結果充分提示了電子煙對機體潛在的不利影響。

為理解電子煙與肺部組織差異基因的相關性,本研究建立了小鼠模型,利用轉錄組學技術,深入探究電子煙及傳統香煙對小鼠肺組織影響及差異基因功能學分析,為電子煙及傳統香煙對機體的分子生物學影響提供新思路、新方向。

1 材料與方法

1.1動物及分組 30只8周齡體質量24～27 g,SPF自交系C57BL/6J雄性小鼠,均購自北京維通利華實驗動物中心〔許可:SCXK(北京)2016-0006〕。隨機分為正常對照組、傳統香煙組、電子煙組,每組10只,在揚州大學動物中心飼養,溫度21～23 ℃,濕度50%～60%,自由飲水進食,晝夜節律12 h。實驗過程中給予實驗動物3R原則的人道關懷。所有動物研究經揚州大學動物倫理委員會批準。

1.2主要儀器與試劑 Marlboro牌紅香煙(1.2 mg尼古丁,美國菲利普莫里斯煙草公司);Marlboro牌HeatSticks(1.29 mg尼古丁,美國菲利普莫里斯煙草公司)。電子煙IQOS加熱器(美國菲利普莫里斯煙草公司)。儀器與設備:煙熏箱(自制有機玻璃箱,90 cm× 40 cm × 30 cm)。光學顯微鏡、肺功能儀(flexiVent;SCIREQ,Montreal,加拿大)。

1.3動物造模 喂養2 w后開始造模。電子煙組及傳統香煙組分別被置于自制的煙熏箱中。為匹配尼古丁濃度:一支Marlboro牌紅香煙抽吸8次,一支HeatSticks抽吸12次。電子煙組及傳統香煙組分別暴露于電子煙氣溶膠和香煙煙霧中30 min,每次5支,間隔4 h,2次/d,5 d/w,共6個月;正常對照組則自由呼吸空氣6個月。記錄每組一般情況。

1.4肺功能檢測 造模結束后行肺功能檢測。在小鼠腹膜內注射0.5%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)予以麻醉處理,常規進行固定,備皮,消毒后剪開小鼠頸部皮膚,并且小心予以鈍性分離,使小鼠充分暴露出氣管,進而在氣管與軟骨環之間水平處輕柔剪開小鼠氣管,氣管切開后立即行氣管插管,并將小鼠置于體描箱內,保持頭低位,與呼吸機管路相連,行機械通氣測肺功能。在測定過程中,采用外加壓力的辦法,使動物深吸氣/深呼氣,電腦自動快速而準確地測出各項指標。測定指標有用力肺活量(FVC)、50 ms用力呼氣容積(FEV0.05)、FEV0.05/FVC%。在揚州大學醫學院機能實驗中心進行小鼠的肺功能檢測,為保證肺功能數據的準確性,均安排同一人進行實驗操作。

1.5肺組織獲取及處理 小鼠腹膜內注射0.5%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)后予以麻醉處理,處死小鼠后,收集小鼠的肺組織,進行多聚甲醛固定,石蠟包埋,隨后進行切片,每張切片厚度為5 μm,進行蘇木素-伊紅(HE)染色,并使用光學顯微鏡觀察小鼠肺組織的病理形態。

1.6轉錄組學測序 使用Illumina HiSeq平臺檢測樣品,用mRNA富集法對totalRNA進行處理,mRNA富集:用帶有OligodT的磁珠富集有polyA尾巴的mRNA;得到的mRNA中加入適量打斷試劑高溫條件下使其片斷化,以打斷后的mRNA為模板合成一鏈 cDNA,然后配制二鏈合成反應體系合成二鏈cDNA,并使用試劑盒純化回收、黏性末端修復、 cDNA 的3′末端加上堿基“A”并連接接頭,進行片段大小選擇,最后進行 PCR 擴增;構建好的文庫用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System質檢,合格后進行測序(由杭州景杰公司代理完成)。測序所得的原始數據稱為raw reads。首先,過濾掉低質量、接頭污染及未知堿基N含量過高的reads,本實驗使用華大自主研發的過濾軟件SOAPnuke進行統計,使用trimmomatic進行過濾,過濾后的數據稱為clean reads。然后將clean reads比對到參考基因組上,之后進行新轉錄本預測、 SNP &InDel 和差異剪接基因檢測。得到新轉錄本后,將具有蛋白編碼潛力的新轉錄本加入參考基因序列中構成一個完整的參考序列,計算基因-蛋白質表達水平。

1.7差異基因篩選及生物信息學分析 當基因豐度差異倍數達2倍及以上,且統計學檢驗P<0.05時,視為候選差異基因;將每組樣品組間兩兩比較,統計得到差異基因數量,在3組樣品間均有差異的基因作為差異基因。將篩選所得的差異基因做GO、KEGG功能富集分析。

1.8統計學分析 使用SPSS13.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.13組肺功能及肺組織學改變 相較于正常對照組,傳統香煙組FEV0.05、FEV0.05/FVC顯著下降(P<0.05);電子煙組FEV0.05、FVC、FEV0.05/FVC顯著下降(P<0.05)。與傳統香煙組比較,電子煙組FEV0.05、FVC均下降,且FVC下降有統計學差異(P<0.05)。見表1。從肺組織肺病理學角度看,相較于正常對照組,傳統香煙組及電子煙組肺泡腔均存在明顯擴張。見圖1。

圖1 3組肺組織(HE染色)

表1 3組肺功能比較

2.23組肺組織差異基因分析 基因組學測序分析結果提示,相較于正常對照組,傳統香煙組發現1 089個差異基因,其中678個為表達上調基因,411個為表達下調基因;電子煙組發現1 044個差異基因,其中 598個為表達上調基因,446為表達下調基因;傳統香煙組與電子煙組之間,發現811個差異基因,其中499個為表達上調基因,312個為表達下調基因,見圖2。同時對差異基因進行韋恩圖分析,見圖3。

圖2 火山圖:3組肺組織差異基因

圖3 韋恩圖:3組肺組織差異基因

2.33組肺組織差異基因GO聚類分析和功能富集分析 相較于正常對照組,傳統香煙組通過GO聚類分析,差異基因生物學過程主要聚類在生物調節、細胞轉化及應激反應這3個生物學過程;細胞組成成分主要聚類在胞外區、細胞膜及細胞器細胞組成成分;分子功能學主要聚類在黏附、催化活性分子功能學過程。相較于正常對照組,電子煙組通過GO聚類分析,差異基因生物學過程主要聚類在生物調節、細胞轉化、發育過程、多生物學過程及應激反應這5個生物學過程;細胞組成成分主要聚類在胞外區、細胞膜及細胞器細胞組成成分;分子功能學主要聚類在黏附、催化活性分子功能學過程。與電子煙組相比較,傳統香煙組通過GO聚類分析,差異基因生物學過程主要聚類在生物調節、細胞轉化、發育過程、代謝過程、多生物學過程及應激反應生物學過程;細胞組成成分主要聚類在胞外區、細胞膜及細胞器細胞組成成分;分子功能學主要聚類在黏附、催化活性分子功能學。見圖4。

圖4 3組肺組織差異基因GO聚類分析

2.43組肺組織差異基因KEGG聚類分析和功能富集分析 相較于正常對照組,傳統香煙組通過KEGG聚類分析,差異基因主要聚類在癌性疾病以及感染性疾病;主要聚類在運輸與代謝、信號傳導、翻譯及免疫系統;電子煙組通過KEGG聚類分析,差異基因主要聚類在癌性疾病及感染性疾病;主要聚類在運輸與代謝、信號傳導、翻譯及免疫系統。與電子煙組相比較,傳統香煙組通過KEGG聚類分析,差異基因生物學過程主要聚類在運輸與代謝、信號傳導、翻譯及免疫系統。見圖5。

圖5 3組肺組織差異基因KEGG聚類分析

3 討 論

本研究說明,電子煙同樣會造成小鼠氣道阻力增加,肺組織彈性下降。Ferrari 等〔18〕研究結果提示,電子煙的短期使用對非吸煙者沒有直接的不良影響,對吸煙者的FEV1和用力呼氣流量(FEF)25只有很小的影響。而Meo 等〔19〕研究結果顯示電子煙組肺功能(FEV1、FEV1/FVC、FEF25%、FEF50%、FEF75%、FEF25%～75%、FEF75%～85%)明顯下降(P<0.05)。提示不管短期還是長期電子煙使用均可對機體肺功能產生一定的影響。所以和傳統香煙相比,電子煙不是作為戒煙工具的最佳選擇,兩者同樣都能引起肺功能的慢性下降和惡化。

本研究結果提示,不管是傳統香煙組還是電子煙組,差異基因多分布在細胞的胞質細胞器結構上,兩者在差異表達方面多有重合,且差異基因表達GO富集分析多主要聚類在生物調節、細胞轉化、發育過程、代謝過程、多生物學過程及應激反應過程。傳統香煙煙霧誘導肺組織病理性改變的機制多種多樣,包括調節細胞增殖〔20〕、誘導細胞凋亡、調節機體免疫反應〔21,22〕及誘導炎癥、氧化應激〔23,24〕等多種方式。本研究發現,電子煙誘導肺組織病理改變機制主要涉及炎癥、氧化應激、細胞凋亡、調節細胞增殖等。本文觀察到電子煙誘導的肺部炎癥中,金屬蛋白酶(MPO)、基質金屬蛋白酶(MMP)-8、MMP-9等炎癥基因上調;而在傳統香煙組則沒有發現這些上述基因。MMP-8、MMP-9屬于MMP家族,在過氧化物酶體增生物激活受體(PPAR)γ和骨鈣蛋白(OPN)通路及趨化因子相互誘導下,主要由中性粒細胞分泌,而中性粒細胞是參與氣道炎癥的主要細胞〔25,26〕。相關研究已表明氣道炎癥過程中,MMP-8、MMP-9會大量分泌,與氣管擴張和肺組織破壞關系密切〔27〕。從電子煙組小鼠的肺組織病理觀察到,這些上調基因參與導致肺損害的炎癥過程。以往發現在傳統香煙煙霧暴露下,MMP-12、MMP-1等同樣也可誘導肺部產生炎癥〔28〕。由此可見,這些基因所涉及的促炎機制基本相同,故提示了電子煙和傳統香煙均可引起小鼠肺組織的炎癥反應,電子煙并不是沒有危害。在氧化應激方面,本研究發現電子煙組和傳統香煙組都有下調抗氧化的基因,并且電子煙組高于正常對照組,如NAD(P)H醛脫氫酶1明顯下調。NAD(P)H醛脫氫酶1可減少氧化應激誘導的自由基的形成,而抗氧化基因下調能導致肺部氧化/抗氧化失衡,一旦失衡產生能損傷氣道上皮細胞進而導致小氣道病理改變。以上發現說明電子煙也可導致體內氧化應激產生。在細胞增殖和凋亡方面,本研究發現電子煙組信號傳導及轉錄激活蛋白(STAT)1表達下調,而轉化生長因子(TGF)β-1則表達上調;而在傳統香煙組則未發現STAT1。STAT1是STAT家族蛋白的一員〔29〕,該基因表達與抑制腫瘤發生有關,一般與酪氨酸激酶(JAK)結合形成信號通路,可促進腫瘤細胞凋亡,從而發揮抗腫瘤作用〔30,31〕,而且研究顯示吸煙可導致STAT家族蛋白信號傳導失調,可能還會促進肺癌的侵襲、轉移〔32,33〕。TGFβ-1在活性氧作用下,通過結合多種Smad蛋白通路,在腫瘤微環境下可以幫助腫瘤細胞逃逸,它與腫瘤的發生和發展密切相關〔34〕。另外還有多種信號通路,包括核轉錄因子(NF)-κB〔35〕、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)〔36,37〕等也參與煙草煙霧誘導的生物學改變過程。相關研究認為在電子煙氣溶膠暴露條件下,某些常見涉及炎癥、氧化應激等基因表達或有限或明顯上調,可能與電子煙品種、尼古丁含量、實驗小鼠品系、長短期持續暴露等有關〔38～40〕。結合本實驗電子煙組和傳統香煙組的轉錄組學差異結果,本文推測這些差異基因改變機制或許跟Czekala等〔38〕研究保持一致,需在后續實驗中進一步論證。

綜上,電子煙具有和傳統香煙的危害性,甚至更甚于傳統香煙對機體呼吸系統的危害。一方面長期暴露于電子煙可導致肺功能、肺彈性的下降,另一方面可誘導肺組織肺泡腔的擴大及炎性細胞的浸潤,久之導致肺部結構的變化。